文摘

小说丝状真菌菌株指定RB-1被孤立成纯培养从日本稻田土壤通过厌氧作用管技术。应变是mitosporic真菌生长在有氧和严格的厌氧条件下使用各种mono - di -三,多糖乙酸和乙醇生产。醋酸生产的数量高于乙醇在有氧和厌氧培养。疣的特点或强调的分生孢子RB-1相似的一些属的菌株Thermomyces高温或嗜中温变形的子囊菌。然而,基于系统分析与小亚基(四)和大亚基(路易斯安那州立大学)rDNA序列,RB-1特点是作为类的成员Lecanoromycetes:。目前,RB-1被指定为一个变形的子囊菌和过去被认为是一个incertae基准在类Lecanoromycetes。

1。介绍

稻田是众所周知的是生物甲烷排放的主要来源(1]。许多最近的微生物分析稻田,因此,专注于厌氧微生物发酵等,引起酸化的,和产甲烷微生物直接或间接参与甲烷生产(2]。稻田通常淹没在种植季节,收获后排水,因此,水稻土壤循环有氧和厌氧条件。在排水期间,有机质的主要最终分解器需氧或兼性厌氧细菌和丝状真菌。其中许多丝状真菌是众所周知的分泌水解酶参与生物聚合物降解,因此,他们被认为扮演重要角色在有机质的分解,特别是在树林和旱地土壤。丝状真菌也可以作为的分解者的有机物质,如植物碎片和植物根分泌排水期间,在稻田土壤。木村和川3]显示真菌的优势微生物群落的稻草排水稻田使用磷脂脂肪酸(PFLPs)作为生物标志物。Hatamoto et al。4]PCR-DGGE分析表明真核生物包括真菌的分解与稻草堆肥纳入水稻土壤尤其是在赛季中期排水。许多腐生的真菌分离从乌克兰水稻土壤排水淹没之前和之后5]。然而对丝状真菌的生态角色在被阶段因为真菌物种能够厌氧的增长速度并没有想过与水稻土壤。

尽管大多数丝状真菌是专性需氧菌,一些专性厌氧物种,统称为瘤胃真菌和归类为Chytridiomycota [6),确实存在,尽管它们的栖息地是限于食草哺乳动物的胃肠道。Tabak和库克713]报道乏氧生活真菌菌株隔绝氧限制环境,污水污泥等有机污染水域,丰富土壤。此前,和田(8)报道,一位身份不明的孢子形成丝状真菌殖民大米吸管淹没稻田土壤中硫酸盐还原的厌氧条件是充分的。齐藤et al。9]表明,纤维素滤纸或玻璃纸电影纳入淹没稻田土壤被真菌菌丝是暂时性的殖民统治后十天洪水。然而,在这些fungal-like生物没有进行进一步的研究。最近,有人建议尖孢镰刀菌可能获得能源增长的脱氮(10和氨发酵11]。真菌脱氮发生在一个O₂有限的环境中,N₂生成O最后脱氮产品由于缺乏N₂O还原酶生成N₂从N₂O (10]。另一方面,真菌氨发酵在厌氧环境中减少到乙酸和乙醇氧化(11]。真菌发酵脱氮和氨对缺氧反应条件被认为是广泛分布在许多真菌(12]。这些发现显示,丝状真菌能够生长在缺乏氧气可能分布在厌氧环境比预期的更多。这些结果表明,在水稻土壤真菌能够乏氧生活肯定存在。因此,作者试图分离厌氧丝状真菌生活在水稻土壤通过应用Hungate的卷芯厌氧技术的方法13)通常用于厌氧原核细胞的殖民。在这里,作者报道小说的隔离和表征兼性厌氧真菌从日本稻田土壤。

2。材料和方法

2.1。真菌菌株

Thermomyces lanuginosusNBRC 9738年从美国国家购买技术和评价与RB-1用于比较。

2.2。媒体

马丁的介质(14)减少0.03%盐酸半胱氨酸用于厌氧真菌隔离从稻田土壤。常规培养,基础培养基(KH的0.1%₂阿宝₄,0.05% MgSO₄7小时₂啊,0.5%蛋白胨、酵母提取物0.1%和1%葡萄糖,(pH值7.0))使用。用于测试利用基质,1%基础培养基中葡萄糖被指定的基板代替。为研究文化和形态特征、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA: NISSUI)使用。厌氧培养法、媒体包含0.0001% resazurine是准备下一个无氧的N₂大气的目视检查减少条件。在接种之前,媒体减少无菌添加半胱氨酸盐酸盐(调整pH值7.0)最终浓度为0.03%。管道、容器和烧瓶与棉花塞封闭用于有氧培养厌氧培养和丁基橡胶瓶塞。如果需要,适合大量CaCO₃被添加到培养基pH值作为稳定剂来维持文化的pH值在5.6 - -5.8。媒体被需要时添加2%琼脂凝固。

2.3。隔离程序

隔离在这项研究中使用的真菌是依法开展Hungate卷管技术(13]。所有程序除了土壤采样和有氧孵化在PDA上的最后一步下隔离进行了厌氧氧流N₂。土壤收集从稻田清廉厘米深度Kanagi农场的教学和研究中心Biocoexistence不管大学青森县,日本,2004年4月。有些土壤特性如下:pH值(H₂O), 6.0;含水量为38.9%。土壤样本连续稀释在0.03%盐酸半胱氨酸溶液(pH值7.0)和转移到固体培养基(减少0.03%盐酸半胱氨酸)角色管,然后孵化2在一个垂直的位置。经过两个月的孵化,真菌菌落琼脂上形成的菌丝被转移到相同的厌氧新鲜偏中、孵化2c两个重复的过程后,菌丝发达厌氧偏被转移到一个掌上电脑板和耗氧孵化2c . PDA的单孢分离板文化指定RB-1,用于进一步的研究。RB-1保持在PDA的文化偏准备在25毫升有氧和厌氧条件下管。RB-1应变已存入日本微生物(JCM)作为JCM13780的集合。

2.4。形态学观察和文化特征

文化特征的形态观察和测定,分离培养的耗氧或厌氧在PDA板2C或PDA分布零散在载玻片上2C(幻灯片文化)。AnaeroPack(三菱瓦斯化学有限公司)是用于产生厌氧气氛。与乳酚棉蓝染色后,孤立的形态学观察下微分干涉与奥林巴斯显微镜的使用(BX50F4)或相差一个奥林巴斯显微镜下(MX50)。宏观观察,立体显微镜(奥林巴斯SZH10)使用。殖民地色彩进行评估基于颜色的出版手册(15]。

2.5。系统发育分析

基因组DNA的分离制备如前所述[16]。几乎全身的小亚基(四)rDNA(1760个基点)扩增使用底漆对E21f(菌进行-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT -)和E1778r (-AATGATCCTTCCGCAGGTTC -)[17]。放大的内部转录间隔区(ITS)地区大亚基(路易斯安那州立大学)rDNA包括年底D1-D2域(ITS-LSU rDNA)(1259个基点),一组引物ITS5 (-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG -)[18)和NL4 (-GGTCCGTGTTTCAAGACGG -)[19使用了)。PCR产物直接测序使用热Sequenase CY5.5染料终结者循环测序工具包和SEQ 4.4个人测序系统(Amersham)。四rDNA序列和ITS-LSU rDNA隔离的存入DDBJ /基因库EMBL的数据库下加入数字AB246879 AB517730,分别。确定序列和相对密切相关类群的隔离从DDBJ检索/基因库EMBL的数据库搜索与爆炸程序结合使用CLUSTAL W程序(20.]。序列间的进化距离计算使用木村的两个参数模型(21),构建了系统发育树neighbor-joining方法(22)使用大型4.0 (23计算机程序。引导分析进行评估的可信限分支到1000年启发式复制。

2.6。生物物理和生物化学特性

所有厌氧孵化项目下进行氧N₂的气氛。分离测定的温度和pH值配置文件通过测量直径的殖民地在有氧条件下发展起来的。掌上电脑板上的温度曲线进行了测试,在4 - 5孵化c . pH值剖面测试的基础培养基pH值的范围从2.0到9.5板。孵化项目进行了三点C。

测试可用为发酵基质,热压处理过的或filter-sterilized基质添加至10毫升的基础培养基代替葡萄糖在文化管、PDA和菌丝斜面接种到培养基中。孵化项目进行了三点C 3个月在有氧或无氧条件下没有颤抖。底物被认为是积极的在乙酸和乙醇在中检测到。乙醇和乙酸测定分析方法如前所述。

增长的时间进程隔离在有氧和无氧条件下确定使用厄伦美厄烧瓶500毫升和100毫升的基础培养基接种相当于1.5毫克(干重)在10毫升基础培养基菌丝体以前从有氧锻炼成长的3C为10天。接种后,烧瓶在孵化3C在互惠瓶操作100 rpm。样品收集在不同的时间间隔通过硝基过滤器和过滤后测定干燥恒重10C;由此产生的滤液被用来确定剩余的葡萄糖和发酵产品。

增长收益的隔离在有氧和无氧介质测定使用血清瓶125毫升和100毫升基础培养基接种微量(0.1毫克)菌丝体的PDA斜挑针尖端。静态孵化后3C了10天,增长文化经历了相同的分析方法分析如上所述。

隔离在厌氧条件下的经济增长能力继代实验证实了所描述的格里森和戈登(24]。孤立的菌丝体生长在PDA的斜面接种到100毫升厌氧血清瓶125毫升的基础培养基的准备。培养瓶培养在3C和一小部分菌丝生长在每五天中被转移到相同的媒介。暴露的菌丝体的大气条件尽可能的避免了立即转移到下一个新鲜培养基。

所有的实验都重复三次以上确认再现性。

2.7。分析方法

葡萄糖是量化使用anthrone-sulfuric酸方法(25]。分析了乙醇气相色谱仪(日本岛津公司GC8A)配备一个FID检测器和一个Porapaq N列(水域)。有机酸测定采用高效液相色谱法(有机酸分析系统,日本岛津公司)配备一个离子排斥列(Shim-pack scr - 101 h)和检测邮报的专栏里pH-buffered电导率检测方法(26根据制造商的指示。甘油是酶化验glycerokinase使用商业套装(勃林格曼海姆)。气—气相色谱法测定(日本岛津公司GC8A)配有TCD检测器和wg - 100列(GL科学)。

3所示。结果

3.1。形态和文化特征

指定的应变RB-1是丝状真菌隔离从日本稻田土壤可以在有氧和厌氧条件下生长。在六周的有氧孵化2C在PDA上盘子,橄榄绿的殖民地橄榄颜色,被丛卷毛的质地,和一些空中菌丝。最初殖民地的颜色是白色,然后将从浅绿到深绿,最终从橄榄橄榄绿。渗出液和可溶性色素没有生产。在营养阶段,有隔膜的菌丝,2.0 - -3.0米直径,改变颜色从透明到明亮的棕色与衰老和琼脂,琼脂表面形成的。RB-1形态学特征,经过两个月的有氧孵化所示数据1(一)- - - - - -1 (e)。不同的缺席(图conidiophore-like结构1(一))。Conidiogenous细胞圆柱形或营养菌丝(图区分开来1(一))。单个或偶尔链接aleurioconidia,透明年轻时和棕色到深棕色时成熟,是承担的技巧略肿胀conidiogenous细胞或直接的营养菌丝(数字1(一)和1 (b))。成熟的分生孢子globose-shaped有时略subglobose-shaped单细胞,7.5 - -11.3米直径,表面疣的或更加深(图1 (c))。厚垣孢子,光滑或疣状隆起的,球状的到椭圆形,浅棕色,深棕色,-11.0和9.0米直径,经常发生在营养菌丝(图1 (d))。性生殖器官的发展并没有观察到。相反,由subglobose primordium-like结构和球形细胞经过两个月的孵化(图形成的1 (e))。

殖民地的厌氧PDA板总是白色,和空中菌丝很少是观察到,至少在潜伏期(3个月)。在CaCO的存在₃,殖民地在厌氧PDA板开发速度类似于在有氧条件下CaCO溶解不溶性颗粒₃。然而,在缺乏CaCO₃殖民地发展慢,在有氧条件下和停止当殖民地达到约60毫米直径,这表明酸生产抑制殖民地开发造成的降低pH值。虽然正常的分生孢子发育没有发生任何厌氧条件下,一些肿胀细胞看起来类似于分生孢子和厚垣孢子结构观察三个月后孵化(图1 (f))。

Thermomyces lanuginosus(14),一种真菌物种明显相关的形态学RB-1,没有任何厌氧条件下生长。此外,酸生产的有氧文化不同于RB-1没有被观察到。因此进一步的生理生化研究t . lanuginosus没有进行。

3.2。系统发育分析

RB-1显示不到96%的四rDNA序列相似性与其他已知的真菌物种和最密切相关Bellemerea阿尔(95.3%的身份),属于类的茶渍目Lecanoromycetes顺序。基于序列的系统发育树中获取的四rDNA DDBJ /基因库EMBL数据库如图2。总计30类群(1659到1669个基点后对齐)。在这棵树,RB-1放置在阶级Lecanoromycetes:。t . lanuginosus显示四rDNA序列相似性较低(92.0%身份)和RB-1班上存在Eurotiomycetes(图2)。为了获得进一步洞察RB-1的分类、系统发育分析使用LSU rDNA D1-D2序列。DDBJ /基因库/ EMBL的搜索显示D1-D2 RB-1序列相似性较低与相关真菌物种(少于89%的身份)。的D1-D2序列Caloplaca regalis类的,将其划分为Teloschistales Lecanoromycetes,显示最高的相似度与RB-1身份(88.6%)。系统发育树构建基于D1-D2序列,而从DDBJ检索/基因库EMBL的数据库,如图3。总数29类群(496到500个基点后对齐)被用来构建系统发育树。在这棵树,RB-1 Lecanoromycetes而不是Eurotiomycetes有关。t . lanuginosus被放置在班上Eurotiomycetes一样四rDNA序列的系统发育树构建(图2)。的身份D1-D2 RB-1和之间的序列t . lanuginosus是82.1%。

系统发育分析使用ITS1和ITS2序列并不因为它的序列进行相关的RB-1适合建设的系统发育树高信心不能从DDBJ检索/基因库EMBL的数据库。

3.3。生理生化特征

生理生化特性进行了总结表1。RB-1增长消耗葡萄糖和乙酸和乙醇发酵产品的生产两种有氧(图4(一))和厌氧(图4 (b))条件。增长率几乎是类似有氧和厌氧之间的文化。其他可能的产品,包括二次有机化合物,如氢、琥珀酸、丙酮酸,甲酸,柠檬酸,乳酸,丙三醇、异丙醇、丙酮、丙酸、丁酸、glyoxalate,丙二酸酯,没有检测到。增长和基质消耗pH值低于后立即终止4.7。葡萄糖完全被消耗在有氧和厌氧培养和成长没有终止如果文化的pH值与CaCO稳定₃;乙酸和乙醇生产pH-stabilized有氧文化的疲惫后立即用葡萄糖(数据未显示)。

可用的初始pH值的增长RB-1介于2.5和8.0之间的最佳pH值5.0 - -6.0。只有轻微的增长是观察到的pH值8.0。没有增长发生在pH值为9.0和2.0。RB-1增长4和3之间的温度C,最佳25-3左右在3 c .C,小菌落直径的增加发生。没有增长发生在4C或以上。分生孢子发展更多产的2c .静态好氧和厌氧液体文化,RB-1总是增长作为一个球形棉球在烧瓶底部或管而不是作为一个浮动垫或薄膜。

RB-1可以使用d -葡萄糖,D-galactose D-mannose,果糖,D-xylose, L-arabinose,蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、棉子糖、淀粉、菊粉、木聚糖、果胶作为发酵基质和增长。发酵在海藻糖、菊粉和木聚糖远远弱于其他可用基质。所有这些基质支持增长和发酵醋酸,乙醇和二氧化碳。在有氧文化中,所有在厌氧条件下可发酵基质也转化为乙醇和乙酸。另一方面,RB-1没有使用L-rhamnose、乳糖、蜜二糖,D-mannitol,山梨糖醇,甘油,Avicell、羧甲基纤维素、甲壳素作为发酵基质和增长。增长的产量和定量测定乙醇和醋酸生产葡萄糖在表2。比乙醇产乙酸在有氧和厌氧(1.8折)(1.9折)条件。

增长RB-1在厌氧条件下(cysteine-reduced液体介质)连续十一后持续不断地从最初的文化转移在同一介质。

4所示。讨论

因为丝状真菌通常被认为是专性需氧生物的兴趣付给他们的生态角色和功能在厌氧环境中,包括淹没稻田土壤。因此,丝状真菌被认为是不太重要的成分自然厌氧的生态系统;一些研究厌氧丝状真菌在自然栖息地已报告7,27- - - - - -29日]。在目前的研究中,小说的作者报告隔离兼性厌氧丝状真菌从日本稻田土壤。

因为没有性生殖器官观察,从形态学的角度来看,RB-1目前被认为是mitosporic真菌。RB-1的形态特征是密切相关的Thermomyces lanuginosus和Thermomyces疣的(14];前物种从日本现场土壤也被孤立30.]。然而,这些物种不同于RB-1单从分生孢子和分生孢子形成温度资料(31日]。此外,t . lanuginosus没有显示出厌氧生长之前报道(32]。的系统发育状态t . lanuginosus和t .疣的是模糊的,所以他们目前列为mitosporic子囊菌(合成子囊菌)33]。然而,最近,它已经表明t . lanuginosus的顺序放在类Eurotiomycetes和散囊菌目基于使用四rDNA及其系统发育分析序列(34如下所示(数字2和3)。通常,在mitosporic真菌,相似的形态特征并不一定表明系统发育关系。当然,有相对较低的相似之处的半导体存储器rDNA身份(92.0%)和D1-D2序列RB-1和之间的身份(82.1%)t . lanuginosus,这表明它们是过去的遥远。根据系统发育分析基于四rDNA和LSU rDNA序列,RB-1可能是放置在子囊菌类的类Lecanoromycetes(数字2和3虽然精确的系统发育地位目前不清楚。进一步的系统发育研究使用其他标记伸长等因素和线粒体rDNA应该是必需的。因此,尽管RB-1可能是一个未知的子囊菌的鉴定认为是incertae基准内部类Lecanoromycetes,分类仍不足以定义精确的分类地位;因此,需要进一步详细分类分析术语。

RB-1能耗氧和厌氧生长,与大多数其他乙醇——acetate-producing真菌;几乎所有的但不是生长在厌氧条件下发酵(35,36]。在继代实验证实乏氧生活,增长能力的RB-1严格厌氧的液体培养基中降低半胱氨酸稳步保持即使11连续传输。接合菌厌氧生长的研究表明,压力显然是厌氧的能力增长,但需要非常少量的氧气对于任何增长,在厌氧培养基稀释在连续传输,而厌氧扩散持续增长的压力真正能够连续十转移(24]。因此,得出RB-1是兼性厌氧真菌。据作者所知,一些兼性厌氧丝状的高等真菌可以产生代谢能量通过简单的发酵,酵母等酿酒酵母,已确定28,29日]。如图4和表2醋酸,高于乙醇,与其他可发酵ethanol-producing真菌;几乎所有的生产少量的醋酸比乙醇(36]。不能进行简单的比较,因为不同的文化条件和媒体之间的先前的研究和本研究;因此,原因尚不清楚,代谢RB-1正在进行的分析。RB-1产生大量的完整的有氧条件下乙醇和乙酸。这种现象类似于乙醇生产的酵母Crabtree-positive文化完整的有氧条件下发生当糖存在超过(37,38]。因此,RB-1可能是Crabtree-positive有机体。产品可能的化合物以外的乙醇、乙酸、文化和二氧化碳的RB-1没有检测到。如果产生了,他们的数量可能是小于检测限(ca。0.1 - -0.5毫米)测量系统(高效液相色谱法和GC)用于本研究。有趣的是,醋酸RB-1显示了一个重要的激酶(ACK)活动,认为是发现严格在原核细胞中,在有氧和厌氧条件下生长(未公开的数据)。最近的存在在几个真核生物诱导真菌被确认(ACK基因39]。然而,ACK的真核生物的活动尚未得到证实。因此,RB-1乙酸代谢的研究可能是一个有趣的生物。作者和同事现在试图从RB-1净化ACK。

的系统发育、生物物理和生物化学特性RB-1这里表示可以区别于其他已知的真菌的物种。尤其是RB-1系统远离已知的真菌属。因此,作者得出结论:RB-1是一种新型的真菌。

稻田,通常暴露于旋转时间的灌溉和排水在种植期间,耕种土壤的字段也通过无氧和有氧条件下旋转。因此,微生物菌落会通过改变对灌溉(厌氧条件)和排水(有氧条件)。此外,耕种土壤的洪水淹没稻田异构环境中氧气浓度不同于其他厌氧的网站。例如,大部分土壤下面水保接口严格厌氧;因为氧气供应通过洪水和水稻的通气组织,土壤表面,根际,分别和rhizoplane有氧(40]。兼性厌氧菌可能是更具有适应能力的微生物在这种非典型网站相比,专性需氧或厌氧微生物。因此,尽管RB-1的生态作用和功能在水稻土壤生态系统目前还不清楚,但是RB-1的能力获取能量代谢和增殖在有氧和无氧环境可能在这样的有利环境。此前,和田(8)报道,一位身份不明的孢子形成丝状真菌殖民大米吸管在水下水稻土壤硫酸盐还原的厌氧条件是充分的。最近,一些研究人员报道,供应硝酸盐时,许多丝状真菌代谢能量可以获得由硝酸氧限制和厌氧环境中呼吸和氨发酵,分别为(10,11,41]。最近的研究表明,高达89%的从土壤排放到大气层可以归因于真菌活动(42]。这些发现表明,丝状真菌能够生长在缺乏氧气可能分布在厌氧环境比预期的更多。

确认

作者感谢y Harada博士和k .武田博士和k农业和生命科学学院的田中,不管大学对他们有价值的建议。作者还由于t . Noro r . Satou和m .高桥的技术援助。本研究的一部分基因研究中心不管大学完成的。