文摘
金黄色葡萄球菌是一个已知的食源性疾病的主要原因,牛奶和乳制品通常被菌株的产肠毒素的污染。在目前的研究中,122年金黄色葡萄球菌分离收集来自不同奶制品被表型特征属性,由葡萄球菌肠毒素基因编码的分布(海,证券交易委员会,sed,赛格,医师,sei,sej,选取),通过随机扩增多态性DNA PCR (RAPD-PCR)。此外,株耐万古霉素和甲氧西林(新青二)进行了研究。RAPD-PCR配置文件获得的差异与引物M13 AP4显示一个伟大的遗传异质性的存在之间的不同金黄色葡萄球菌菌株。使用底漆AP4 M13, 8组被RAPD-PCR杰出的聚类分析,尽管如此,除了在一些情况下,它是不可能的关联不同动物的隔离(牛或羊)的存在赛格ydF4y2Ba基因。没有隔离显示耐万古霉素或甲氧西林。
1。介绍
金黄色葡萄球菌是一种重要的食源性病原体参与各种侵入性疾病。特殊的意义的能力金黄色葡萄球菌菌株产生热量稳定导致葡萄球菌肠毒素食物中毒,这是胃肠炎(全世界最流行的原因之一1]。
十一SEs已经认可的主要抗原类型(海SEJ)和相应的基因已经被报道2]。最近,其他SE毒素被确定(SEK,选取,SEM, SEN,搜索引擎优化,以及建)和相应的基因(赛格ydF4y2Ba)描述3- - - - - -5在食物中毒),但他们的作用还不清楚。
金黄色葡萄球菌可以获得牛奶直接排泄与临床和亚临床乳房中葡萄球菌乳腺炎或环境污染处理和加工的原料奶(6,7]。
金黄色葡萄球菌也是一种常见的人类感染原因可以变得特别严重如果菌株对抗菌药物引起的8]。事实上,如今,抗菌素耐药性已成为一个主要公共卫生问题在许多国家由于在环境中耐药菌株的不断循环和可能的食品污染。事实上,它已经由几个作者暗示抗生素产肉动物的管理,用于治疗或作为生长促进剂,可能是一个主要的选择因素antimicrobial-resistant细菌病原体。此外,金黄色葡萄球菌经常被报道显示多个抗菌素耐药性模式,尤其是对甲氧西林和万古霉素(9,10]。
描述了几种分子打字方法为了获得一个准确和快速的表征金黄色葡萄球菌隔离,如凝固酶(我看)或蛋白质(水疗中心)限制片段长度多态性(RFLP), Multiple-Locus可变数目串联重复序列(MLVA) Pulsed-Field凝胶电泳(但是脉冲场凝胶电泳的出现),茎序列输入(MLST)和扩增片段长度多态性(妊娠)。随机扩增多态性DNA (RAPD PCR)已经广泛应用于区分不同的隔离金黄色葡萄球菌(11,12]。然而,几乎没有打字的RAPD方法的信息金黄色葡萄球菌菌株与乳制品。
在目前的研究中金黄色葡萄球菌菌株分离出不同的乳制品,收集各种意大利地区,被确定在物种水平和特征通过RAPD-PCR在基因水平。隔离的同时进行了对肠毒素基因的存在(海,秒,sed,赛格,医师,sei,sej,和选取)和表型活动如凝固酶的存在,thermonuclease和溶血活性。此外,金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林菌株进行了测试和万古霉素。
2。材料和方法
2.1。细菌分离和来源金黄色葡萄球菌识别
这项研究共有122名金黄色葡萄球菌菌株。所有的隔离都从当前获得(食品生产的科学研究所)细菌收集和来自不同的原料奶产品(牛奶、豆腐、奶酪、黄油和乳清)来自意大利不同区域和动物物种。报道在表181隔离来自牛,22日从山羊,从布法罗17从羊身上,2。
微型生化系统(生物测井GP微型板块、生物测井公司,海沃德,美国)被用来确认葡萄球菌物种。菌株进行维护和传播在脑心浸液肉汤(Oxoid、米兰、意大利)和孵化C在一夜之间。
菌株鉴定也证实了金黄色葡萄球菌具体引物23 s rRNA基因根据Cremonesi [13]。
2.2。DNA的提取和检测赛格ydF4y2Ba通过多重PCR基因
DNA提取,如Cremonesi所述14),使用一个毫升文化孵化的BHI肉汤一夜之间C,包含大约细胞。并行,手机号码验证了总样本数量,按照ISO 6888 1/2:1999过程与Baird帕克RPF琼脂板(15]。作为调查的几项研究已经描述了,没有一个菌株分离牛和山羊牛奶,和相关乳制品,港口的任何seb,看,和瑞典克朗基因,年代e基因,包括海,证券交易委员会,sed,赛格,医师,sei,sej,和选取被多重PCR检测化验如Cremonesi所述13]。这PCR分析还包括种特异的引物为23 s rRNA,凝固酶,thermonuclease。参考菌株写明ATCC 700699(包庇海,证券交易委员会,凹陷,和sej写明ATCC 23235(基因),sed,赛格,sei,和sej写明ATCC 19095 (),证券交易委员会,医师,赛格和sei)包括积极控制PCR分析。
2.3。调查的表型
的金黄色葡萄球菌菌株被评价热稳定的核酸酶表型(TNase)测试使用甲苯胺蓝琼脂(Oxoid)根据ISO 8870:2006 [16根据ISO 6888 1/2:1999]和凝固酶测定(15]。
2.4。溶血在血琼脂和抗生素耐药性
溶血性活动决心在血琼脂(去纤维蛋白的羊血)(默克,Darmstad,德国)C 24小时。溶血是记录的类型- - - - - -,和双(+)。
抗生素敏感性决定了标准化在Muller-Hinton琼脂扩散试验(Biolife,米兰意大利)使用以下磁盘:万古霉素bioDisc VA30 (30g /磁盘)和甲氧西林(新青二)OX1 (1g /磁盘)(bioMerieux, RCS里昂,法国)根据制造商的指示。金黄色葡萄球菌写明ATCC 29213被用作参考菌株(17]。隔离被归类为敏感和耐药基于解释的标准由国家临床实验室标准委员会(18]。
2.5。RAPD-PCR
RAPD-PCR反应进行底漆M13和AP4。放大条件,以及电泳和放大产品的分析,被Andrighetto[描述的相同19),除了引物的扩增循环AP4修改如下:一个初始步骤C 90秒,紧随其后的是35的循环C 30秒,C为60秒,C 90秒。分组RAPD-PCR资料得到的凝胶进行了4.1软件包(应用数学、Kortrjik、比利时),使用皮尔逊积矩相关系数和UPGMA聚类分析。
3所示。结果与讨论
3.1。从乳制品微生物分离鉴定
所有122隔离被确定属于PCR反应金黄色葡萄球菌。Biolog GP识别27株给不同的识别;2压力导致s . delphini1s . xylosus1美国的中间部,1美国haemolyticus;1不确定,21株鉴定只是在属级(葡萄球菌spp)。Biolog GP的使用允许的78%的正确识别金黄色葡萄球菌隔离隔离,而剩余的22%,种特异的PCR是必要的。122年文化都是阳性凝固酶和热稳定的核酸酶的存在。
3.2。溶血的模式金黄色葡萄球菌隔离
所有的测试金黄色葡萄球菌提出了在血琼脂平板溶血;66株(54%)溶血,49(40%)双溶血(+),7 (6%)溶血。大多数菌株分离牛乳制品显示患病率溶血(62%),29株(36%)给双溶血。溶血中发现只有2牛隔离。溶血患病率在牛金黄色葡萄球菌菌株在完全赞同其他研究论文20.,21所示),但相反是斯蒂芬(所做的研究22),在瑞士,发现溶血在23个34的两倍金黄色葡萄球菌孤立的牛奶样品。大部分的金黄色葡萄球菌压力来源于山羊奶制品(64%)显示双溶血,而在没有隔离−溶血检测。菌株的分离羊乳制品,的均匀分布,和double-hemolysis(5、6和6株)。这两个菌株分离水牛乳制品在血琼脂溶血性。
3.3。流行的赛格ydF4y2Ba基因的金黄色葡萄球菌隔离
的频率赛格ydF4y2Ba基因和肠毒素和样本来源之间的关系表2。122年的金黄色葡萄球菌隔离测试,79例(65%)被发现为一个或者更多的是积极的赛格ydF4y2Ba基因。最常见的基因sed(n: 40)紧随其后海,sej,证券交易委员会,选取,和sei。的基因医师是最频繁的。的基因证券交易委员会- - - - - -选取(n: 16),在所有情况下,相关的,但是只有一个应变把它们与其他基因。以同样的方式sej总是发现结合sed,但sed并不一定总是联系在一起吗sej。最常见的赛格ydF4y2Ba基因是证券交易委员会- - - - - -选取(n: 15),海- - - - - -sed- - - - - -sej(n: 14),sed- - - - - -sej(n: 13)海独自一人(n: 13)。21金黄色葡萄球菌只拥有一种毒素基因(13海3sed,1赛格3医师,和1sei),而剩余的58株怀有不止一个毒素基因。只有3隔离包庇赛格和sei肠毒素基因组成的集群(egc)[23]。
这部小说赛格ydF4y2Ba基因(赛格,医师,sei,sej,和选取)通常与经典的相关基因,除了8株阳性病例中只有一个新描述赛格ydF4y2Ba或者,在某些情况下,其中的一些。从多重PCR分析看来,存在一定程度的异质性赛格ydF4y2Ba基因档案;事实上可以组织成17基因组合。
比较数据相对于菌株分离牛,山羊,绵羊、和水牛乳制品,58岁的81(72%)从牛是阳性菌株赛格ydF4y2Ba,海,对话中,和sej更频繁的被发现。只有2株(特伦蒂诺隔绝阿迪杰牛奶和威尼托奶酪,两个地区的北意大利)被发现的证券交易委员会基因。十二的22个金黄色葡萄球菌(55%)与山羊奶制品包庇赛格ydF4y2Ba肠毒素基因,证券交易委员会和选取成为主流,每个被发现在7株。在类似的毒素模式金黄色葡萄球菌隔绝的羊。事实上53%的隔离产生肠毒素,证券交易委员会和选取是最广泛的。这两个菌株分离水牛没有生产葡萄球菌肠毒素。
这项工作表明,海和sed基因是显性的,往往是相关的sej在金黄色葡萄球菌隔离。Sed和sej在同一质粒基因已经被本地化(24]。
肠毒素A和D的优势与报告国家如巴西、挪威、法国和日本(25- - - - - -29日),肠毒素C金黄色葡萄球菌生产商经常孤立从牛奶和鲜奶奶酪。然而,Normanno [10)表明,分离的菌株在意大利乳制品大多数SED,紧随其后的是大海,秒,SEB;此外在韩国和法国海基因在菌株与葡萄球菌食物中毒主要研究了从1981年到2002年(30.,31日]。
3.4。抗生素耐药性的隔离
所有的金黄色葡萄球菌菌株研究还进行了对抗生素的耐药性。研究选择的抗生素万古霉素,甲氧西林,这些是常用的在医学和兽医领域。研究的122株120对万古霉素敏感,而其他2株(1从牛和1羊隔离)显示,按照NCCLS,这种抗生素接触电阻。没有从乳制品显示耐甲氧西林菌株分离。
3.5。RAPD-PCR的分离分析
所有122个孤立考虑本研究通过RAPD-PCR特征,许多人使用的一种技术类型金黄色葡萄球菌孤立的从不同的食品与葡萄球菌食物中毒(32- - - - - -35从个人季度牛奶和人类样本),36- - - - - -40)和乳腺炎牛奶样本(41]。RAPD-PCR分析所有的隔离与引物进行了M13, AP4。RAPD-PCR测定的重现性价值,独立放大的重复计算金黄色葡萄球菌菌株,高于95%的M13, AP4引物。
基因变异的金黄色葡萄球菌压力变得明显RAPD-PCR分析(图1)。相似度80%,8个不同的集群被检测到。集群分组5金黄色葡萄球菌的菌株分离牛乳制品:4 5显示肠毒素基因的存在和3溶血活性。大多数菌株分为集群B从绵羊的奶制品被孤立;这个集群包含5株来自山羊,牛3从羊,和2。六个金黄色葡萄球菌隔离无法产生肠毒素和7株显示双溶血,1和2溶血。集群C组4只山羊隔离,其中2株包庇证券交易委员会- - - - - -选取和2没有肠毒素生产商。双溶血中检测出3的4株。集群包含20 D隔离(从山羊15从牛,2,1从水牛从绵羊和2)——双溶血主要分别在11日和8株。在这个集群中,只有一个金黄色葡萄球菌应变与羊了溶血。集群D可分为两个subclusters (D1和D2);D1包含14株(10牛,山羊,1从水牛从绵羊和2)7没有毒素的生产者,而D2 subcluster分组6隔离(5从牛和1只山羊),所有的心怀sed基因。集群E包含8株来自绵羊的乳制品(3从绵羊山羊和5)和2头牛。8显示肠毒素基因的存在,绵羊的菌株7包庇证券交易委员会- - - - - -选取和1赛格- - - - - -sei。2株分离牛没有肠毒素生产商。在集群E溶血是主导(7/10)。所有的菌株属于集群F从牛隔离,隔离6的9株无法产生肠毒素,和5隔离溶血。集群G分组5株从牛和山羊4 (1)。所有隔离溶血性和没有显示肠毒素基因的存在。集群H包含38个隔离从山羊从牛和2(36),在这个集群我们确定了两个subclusters, H1(16隔离)和H2(17隔离),特点是相似系数为90%。16个牛隔离属于H1 subcluster显示肠毒素基因的存在(除了一个金黄色葡萄球菌应变)菌株窝藏单独或与他人的交往中,海(9),sed(15)sej(8),而株分组的H2 subcluster(16 1牛和山羊隔离)14显示的存在海基因,11对话中,和9sej。在H1和H2分别溶血性隔离成为主流,16日和10株。应用相似性值80%,21岁金黄色葡萄球菌隔离不进入8集群。
RAPD-PCR技术被证明是有效的在打字菌株进行了研究。引物的使用允许隔离的细分成八大集群中,在某些情况下,确定了菌株也有类似的特征(存在/缺乏肠毒素基因编码,溶血类型)。据其他作者,我们的研究结果表明,毒素基因的存在并不与特定RAPD-PCR模式(12,42]。此外,RAPD-PCR和分析基因编码的毒素与起源的地理区域,无相关性,而在许多情况下有相关动物物种。
关于耐抗生素(万古霉素、甲氧西林),没有乳制品的菌株分离显示阻力,而低频报道了Normanno et al。43)发现,3.75%的的人金黄色葡萄球菌对甲氧西林耐药。的确,enterococci也显示出类似的结果,不同的作者44- - - - - -46)表明,在乳品行业,大多数菌株对抗生素敏感。
4所示。结论
获得的数据在目前工作确认的广泛的表型和基因型多样性金黄色葡萄球菌等乳制品,但并不总是能够intercorrelated多样性。此外,类似的肠毒素菌株发生率被确认在隔离动物痛苦乳腺炎(47]。然而,有趣的是,没有明显的观察到的应变变化之间的相关性和该地区的隔离。