在肠系膜脂肪组织中激活的转录和分子途径和克罗恩病患者的肠粘膜

摘要

Crohn的疾病（CD）是一种慢性炎症性疾病，其特征在于细胞因子不平衡和转录信号传导途径激活。此外，受影响的肠道区域附近的肠系膜脂肪组织（垫）的增加是CD的标志。因此，我们评估了肠粘膜中的转录信号通路和细胞因子表达，活性CD患者的沉岩。研究了10例同性恋CD和8例患有非炎性疾病的患者。肠粘膜和垫的活组织检查是通过免疫印迹测定肠冷冻和蛋白质表达。通过QPCR测量RNA水平。PIKB / IKB比率和TNFα.与对照相比，CD的肠粘膜含量显着高。然而，Dat1表达在CD和对照的肠粘膜之间类似。考虑到垫子，PIKB / IKB比率显着降低，与对照相比，CD抗炎细胞因子IL10显着高。最后，与对照相比，CD垫中Pstat1的蛋白质含量较高。这些发现强化了CD肠粘膜中促炎NF-KB途径的优势。我们首次表明CD患者垫中Stat1途径的激活，这可能有助于了解这种免疫介导的疾病的地质病理学。

1.介绍

克罗恩病(CD)的特点是黏膜免疫细胞活化和细胞因子失衡。肿瘤坏死因子(TNFα.）是在该过程中涉及的最重要的促炎细胞因子之一，其转录取决于称为核因子Kb（NF-KB）的转录因子的激活[1］．此外，在此过程中涉及涉及信号传感器和转录激活器的一些成员（统计数据）。响应于干扰素，并且当激活（Pstat1）结合干扰素刺激基因的启动子区域时，将STAT1上调。所有转录因子易于旋流到细胞核中并与保守的调节DNA序列相互作用，导致趋化因子，细胞因子，受体，信号传导调节基因等基因的转录。已经在几种胃肠道病症中研究了这些分子。但是，关于它们的最常见数据来自肠道组织的分析，比受影响的肠道附近的肠系膜脂肪组织（垫）稀有，罕见[2］．垫子的增加是疾病的常见特征，可能涉及小而大的肠道;因此，这种组织可以代表CD发病机制中的相关作用[3.那4.］．组织学分析揭示脂肪组织中的异常，包括巨噬细胞浸润和纤维化[5.］．脂肪组织能够释放可导致促进或抗炎途径的激素，例如已经显示出增加TNF分泌的瘦蛋白α.和IL6，以及激活NF-KB [6.那7.[如脂肪蛋白和抗炎因素，其衰减促炎反应。

TNF.α.具有几种功能，通常通过抗炎途径（例如IL10）抵消。TNF的加剧α.与其他炎症介质在肠道中的表达固有层炎症肠疾病（IBD）。腔内刺激导致白细胞介素的表达增加，例如IL1β、IL6和IL8，它们刺激淋巴细胞增殖和激活，其机制尚不完全清楚[8.］．

CD和溃疡性结肠炎（UC）之间的免疫差异研究，这两个主要的IBD表明，NF-KB的激活比UC更常见;相反，STAT1的表达和激活主要在UC中高。实际上，STAT1由由IFN的跨膜受体激活的氏型血管型途径激活γ.[9.那10]，可被SOCS3阻断，SOCS3在调控该通路中起重要作用[11那12］．

本研究旨在研究CD患者的肠道黏膜和MAT是否激活不同的分子和转录途径，从而导致患者不同的组织特异性药物反应，并建立潜在的治疗CD的药理靶点。因此，我们评估了参与激活NF-kB和STAT1通路的分子，以及随后在肠黏膜和肠道MAT中的细胞因子表达。最后，研究CD患者肠道黏膜与MAT之间的相关性，有助于更好地了解这种慢性炎症性疾病的病理生理机制。

2。材料和方法

2.1。化学品和试剂

sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹试剂均来自Bio-Rad实验室(Richmond, CA, USA)。HEPES、苯甲基磺酰氟、抑制蛋白、二硫苏糖醇、Triton X-100、Tween 20、甘油和BSA(分数V)购自Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)。硝基纸(BA85, 0.2μ.m)和免疫印迹化学发光蛋白标记试剂购自Amersham (Aylesbury, UK)。抗IL10抗体(sc1783)， Iκ..B.α.（SC1643），PIKK（SC7977），PSTAT1（SC7988），TNFα.（SC8301）和SOCS3（SC7009）来自Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA，USA）。IL6（AB 6672），IL17（AB 79056）和IL23（AB45420）抗体来自ABCAM（剑桥，MA）。对IL1的抗体β（503502）是从Biolegend（San Diego，CA）获得的。通过来自Fermentas（Glenburnie，MD）的PageRulertm评估蛋白质分子量。用于实时PCR分析的试剂来自Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）和应用生物系统（福斯特城，CA，USA）。塔克曼底漆TNF.α.（mm00443258_m1），摘要意思β（mm00434228_m1），白细胞介素6（mm00446190_m1），IL10.（MM01288386_M1）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（＃4352339e）是从应用的生物系统和集成的DNA技术（IDT）获得的。

2.2。实验方案

来自肠道粘膜（ICD组）和肠系膜脂肪组织（ACD组）的活组织检查是从30例接受手术切除的10例同性恋CD患者中获取。在手术前一天通过结肠镜检查评估疾病活性的存在，所有患者患有克罗恩病活动指数（CDAI）[13]超过250分。不包括其他地区CD的患者。ILEAL组织的对照组由八名患者组成，患有ELECOLONONCOPPE的患者，检查是正常的（肠粘膜组织对照组-IC组）。对照组垫中由八名患者组成，患者接受了具有正常远端感应性的非炎症性疾病的直肠切除术（Hereum Mesenteric Adipose组织对照组-AC组）。该研究按照赫尔辛基宣言进行，并受坎皮纳斯大学伦理委员会批准。在从患者的知情同意后采取了所有样本。该研究是在坎皮纳斯大学，IBD研究实验室，外科手术部门，手术部门以及内科省内的细胞信号传导实验室进行。

2.3。Western Blot.

将活组织检查在液氮中冷冻冷冻，并在-80℃下储存直至使用。对于总蛋白质提取物制剂，将片段在4℃下溶解缓冲液中均化[1％Triton X-100,100mM Tris-HCl（pH7.4），100mM焦磷酸钠，100mM氟化钠，10mM EDTA，10 mM sodium orthovanadate, 2.0 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), and 0.1 mg aprotinin/ml] with a Polytron PTA 20S generator (model PT 10/35; Brinkmann Instruments, Westbury, NY) operated at maximum speed for 30 sec. Insoluble material was removed by centrifugation (12000 rpm at 4°C for 40 min). The protein concentration of the supernatants was determined by BCA method (Pierce™ BCA Protein Assay Kit. Catalog number 23225). Aliquots of the supernatants containing 50 μ.G通过SDS-PAGE分离G总蛋白质，转移到硝酸纤维素膜中，并用结果中所述用指示的抗体呈涂。特定条带由化学发光反应（来自Pierce Biotechnology，Inc.Rockford，IL）的Supersignal West Pico Chemilmisencyciny底物标记，并通过光学密度测定法量化（Un-Scan-IT程序）。我们已经应用了PONCEAU染色以检查凝胶和膜转印的等于装载（参见在线提供的补充材料中的补充图S1https://doi.org/10.1155/2017/7646859.)[14那15］．

２.４.RNA提取与实时定量PCR (qPCR)

根据制造商的说明，使用市售的酸 - 苯酚试剂Trizol（Invitrogen Corp.）提取总RNA。使用Nanodrop（ND-1000; Nanodrop Technologies，Wilmington，De）分光光度法确认RNA浓度，纯度和完整性。用无RNA酶的DNA酶（RQ1 rNase-ys，promega）处理RNA，然后使用寡核苷酸（DT）引物和逆转录酶（Revertaid TM套件，Fermentas）逆转录。反应混合物（20 μ.l) 42°C孵育60min, 70°C孵育10min，冰封。对得到的cDNA进行qPCR，使用制造商的协议。在10μ.根据制造商的建议，使用TaqMan PCR主混合，最终体积包含40-50 ng的逆转录RNA。

实时PCR扩增由初始变性步骤（50℃，2分钟，95℃10分钟）组成，40个变性循环（95℃，15s），退火（53℃，20s），和延伸（20℃72℃），然后在60℃下进行最终孵育1分钟。所有测量都被表达式归一化GAPDH基因被认为是稳定的家务基因。使用Delta-Delta CT方法测定基因表达[16］．

采用ABI Prism 7500序列检测系统(Applied Biosystems)对基因表达进行实时PCR分析。通过对每个基因的5点、2倍稀释曲线分析，得到互补DNA (cDNA)和引物的最佳浓度以及扩增效率。扩增在20μ.根据制造商的建议，使用TaqMan PCR主混合，最终体积包含40-50 ng的cDNA。实时数据使用序列检测器系统1.7(应用生物系统)进行分析。结果以相对转录量表达为先前优化的[16］．

2.5。组织学分析：苏木精和曙红（H＆E）染色

从肠黏膜和受影响肠区域附近的MAT取活组织切片包埋在石蜡块中进行组织学分析。部分5μ.用H＆E染料切割并染色。使用Zeiss Axiophot显微镜和Cannon Power Shot G5数码相机系统（Cannon Inc.，Tokyo）进行显微照片。扫描较高放大率（20x）的领域被扫描，分析了随机字段。

2.6。统计分析

所有结果均报告为平均值±SEM。通过Mann-Whitney试验分析数据，比较CD组的垫及其各自的脂肪对照组并进行比较，分别，CD组的肠组织及其各自的肠道对照组。意义程度设定为。

结果

3.1。CD患者肠道和岩浆的形态学分析

CD肠黏膜的H&E染色显示肠壁增厚与炎症和深线性溃疡相关(图)1（b））与对照相比（图1（a））.此外，我们证明了垫子的面积和周边较低（图1（d））与对照组相比CD患者（图1（c））.

3.2。CD患者肠粘膜炎症标志物评价

CD患者显示出炎症标记的mRNA水平增加，如IL6，IL8，IL23，和IL10.（；图2（a）那2（b）那2（c）， 和2（d）与对照相比，在肠粘膜中。但是，没有区别TNF.α.在ICD和IC组之间检测到基因表达（图2（e））.另一方面，TNF的蛋白水平α.摘要意思,β，和il23（；图2（f）那2（g）， 和2（h）与对照组相比，ICD组显著升高。

３．3.乳糜泻患者MAT炎症标志物的评价

TNF.α.， il6, il8, il23，和IL10.基因表达（数字3（a）那3（b）那3（c）那3（d）， 和3（e），resp。）在席位组中类似，以及TNF的蛋白质表达α.，IL17和IL23（图3（f）那3（g）， 和3 (h)，resp。）。与各自的对照相比，CD患者垫中抗炎细胞因子IL10增加（；数字3(我)）.

3．4．核转录因子在CD患者肠黏膜和MAT中的调节作用

我们通过免疫印迹法评估了pIkB/IkB比值，与对照组相比，ICD组的pIkB/IkB比值明显更高(；数字4（a））.相反，与对照组相比，CD患者垫中PIKB / IKB比率较低（；数字5（a）），与肠粘膜相比，显示炎症信号响应中的不同模式。

尽管增加的基因表达stat1.在CD患者的肠粘膜中与对照组相比（数字4（c）），在肠粘膜中的基团中观察到STAT1（PSTAT1）的磷酸化和活化形式的差异（图4（b））.实际上，与IC组相比，ICD组中的SOCS3蛋白是统计途径的下调剂，在ICD组中也显着较高（；数字4（d））.

有趣的是，虽然没有差异stat1.与AC组相比，ACD组STAT1激活形式(pSTAT1)的蛋白含量较高(），表明STAT1转录途径在CD患者垫中激活。图5 (c)和5 (b)分别说明了这些发现。

4。讨论

在文献中报道了NF-KB活化在CD和STAT1激活中的优势在文献中[9.那10那17］．Schreiber等[9.]研究了活性IBD的患者，并比较了InucoScopopic结肠生物检查中Stat1的表达和激活。他们得出结论，与CD和对照相比，UC的STAT1表达和活化较高。但是，垫子中没有关于STAT1激活的研究。Schreiber等[10[透露，在疾病，CD和UC的肠粘膜中检测到NF-KB活化，但在疾病的肠道粘膜中检测到最高水平固有层来自CD患者的活检样本。NF-KB在细胞质中发现，并与IKB结合α.，这可以防止它进入核心[18］．一旦该信号通路被激活，蛋白质IKBα.被泛素 - 蛋白酶体途径磷酸化并降解，释放NF-KB，其与细胞核中的特异性DNA序列结合，激活参与促炎反应的靶基因[18］．

在本研究中，我们发现TNFα.与对照相比，在CD患者的肠粘膜中激活表达和NF-KB信号传导途径，而Dat1途径在Dat1途径中没有观察到差异，所以通过ICD和IC组的PSTAT1调节缺乏。该发现可以通过ICD组中的SOCS3水平增加来解释，这可能会抑制Stat1激活[19]加强CD中NF-KB途径的优势。至少在实验模型中[20.] NF-KB抑制剂改善结肠炎症。

另外，发现几种其他促炎细胞因子在CD的肠粘膜中增加。此外，虽然较高的TNFα.在CD的肠粘膜中注意到蛋白质水平，在其转录表达中没有观察到差异，可能是由于基因启动子的稳定性增加的[21.］．另一种可能性是高TNFα.蛋白质表达可以诱导TNF的负反馈α.基因转录。相反，在CD的肠道黏膜中，STAT1基因表达较高，而pSTAT1的表达没有差异，这可能是由于更高的蛋白稳定性和对泛素化和降解结果的保护。

MAT的增加通常是活动性和侵略性乳糜泻的标志[22.-26.］．MAT在维持乳糜CD方面具有重要作用，因为脂肪细胞中促炎因子和抗炎因子之间的平衡改变可能导致先天和适应性免疫反应的激活[27.那28.］．以前的研究已经证明了CD患者垫中重要炎症标志物的争议表达。Desreumaux和同事于1999年发表了一项研究表明TNF表达增加α.CD患者小肠肠系膜MAT中，提示脂肪细胞是TNF的来源之一α.生产 [29.］．我们的结果似乎涉及文献，一旦我们在TNF中没有差异α.表达，随着CD患者垫中的降低的PIKB / IKB比和增加的IL10表达而证明了降低的NF-KB途径激活。此外，IL17和IL23蛋白表达在该组织中没有差异。

此外，由Yamamoto和合作者进行的一项研究[3.] 2005年表明CD患者肥大垫中脂联素分泌和组织浓度的增加。虽然在这项研究中，从IBD患者的正常垫子中进行了比较，但我们的控制不同地，他们得出结论，垫子可以作为防止炎症传播到腹腔内空间的屏障。相反，罗德里格和合作者[30.)在2012年发现垫CD患者低脂联素的表达,这可能显示肠道中的抗炎机制缺乏肠系膜影响肠道附近区域在慢性疾病的晚期,这可能有助于使慢性炎症状态。我们的研究结果显示，乳糜泻患者MAT中IL10蛋白水平升高，与Yamamoto的研究结果一致;然而，争议依然存在。

此外，我们的结果表明TNF的蛋白质和基因表达的差异没有差异α.或AC和ACD组中的其他促炎细胞因子。此外，与AC组相比，ACD组的PIKB / IKB比率较低。在垫中观察到STAT1基因表达的差异;然而，如在文献中报道的患者中，PSTAT1在患者垫中较高，类似于UC患者中发现的增加[31.］．虽然我们发现CD垫中的IL10和PSTAT1蛋白表达，但转录水平没有差异。转录和蛋白质水平的这种差异也可以通过增加基因启动子的稳定性或IL10和STAT1基因转录的负反馈来解释由其各自的高蛋白表达诱导的IL10和STAT1基因转录的稳定性[21.］．

如上所述的文献中，垫的作用仍然存在争议。如在严重肥胖患者中所见的镭脂肪细胞的小直径表明垫子中潜在的炎症病症[22.］．来自CD垫的脂肪细胞的形态学特征已经在文献中验证了[4.那32.］．DIAS和合作者[32.还与凋亡较低的脂肪细胞的低直径和面积相关，这可以解释每个较高倍率的较高数量的脂肪细胞。实际上，它们在非同一个人中没有在该组织中发现增殖。成熟的脂肪细胞不能进行细胞分裂;我们只能看到严重肥胖症的脂肪细胞增殖。然而，可以导致脂肪细胞数增加的另一种机制是通过细胞分化。这通过脂肪干细胞引发的脂肪发生途径进行[33.那34.]，它可以解释CD垫中的形态和代谢改变。最近，已经研究了脂肪衍生的基质血管级分（Ad-SVF）的旁静脉作用，并且还验证了未分化的单核元素的异构种群[34.那35.］．因此，鉴于我们的结果，仍然很难确认垫子是否具有可衰减CD患者中炎症的抗炎作用，或者如果如UC患者所见激活温和的促炎反应。细胞因子，adipokines，转录因子，脂肪干细胞，血管内皮和脂肪细胞塑性之间的相互作用可能涉及垫片重塑，这肯定会影响CD Phyopo病理学。

因此，本研究的结果增强了CD患者肠粘膜中促炎性NF-KB途径的优势。此外，我们首次表明CD中垫的炎症状态是由Stat1激活介导的。另一方面，这种激活可能导致抗炎细胞因子的增加，例如IL10。根据这项研究，MAT可能在CD的病理生理学和/或活性中发挥重要作用。实际上，激活的分子信号传导的知识以及不同组织中的转录因子和细胞因子表达，例如垫和肠粘膜，对于了解CD的地貌以及寻找解决组织特异性差异的新药物是重要的。

利益冲突

作者没有利益冲突。

作者的贡献

Andressa Coope和LíviaBitencourt Pascoal同样为这项研究进行了贡献。

致谢

作者感谢FAPESP（FundaçãodeAmparoàPesquisa做Estado deSãoPaulo）和Faepex（Fundo de apoio Ao ensino，àpesquisaeextensão）进行财务支持。作者感谢Nicola Conran博士和Tristan Torriani教授进行英语语法修订版。

补充材料

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