EOLA1抑制Lipopolysaccharide-Induced血管细胞粘附与MT2A Molecule-1表达式的ECV304细胞

文摘

我们的研究小组首先发现endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated因子1 (EOLA1,基因库AY074889)脂多糖(LPS)响应在ECV304细胞基因。先前的研究进一步证明了EOLA1协会与金属硫蛋白2 (MT2A),而EOLA1的角色在LPS-induced ECV304细胞炎症反应是未知的。在这个报告中,我们决定EOLA1的亚细胞定位和监管能力的EOLA1血管细胞粘附molecule-1 (VCAM-1)为了应对有限合伙人在ECV304细胞。我们的研究结果表明,EOLA1广泛扩散的细胞,和EOLA1表达式由有限合伙人显著诱导。EOLA1击倒效果显著增强LPS-induced VCAM-1生产。与此一致的是,过度的EOLA1导致减少LPS-induced VCAM-1生产。此外,MT2A击倒减少LPS-induced VCAM-1生产。总的来说,我们的结果表明负监管角色的EOLA1 LPS-induced VCAM-1表达涉及其协会与MT2A ECV304细胞。

1。介绍

Endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated因子1 (EOLA1,也叫基因库074889号CXorf40A)已经被我们的研究小组从基因差异表达与脂多糖刺激的ECV304细胞后(LPS)在2004年[1,2];然而它的生物功能不太理解。EOLA1位于人类染色体中Xq28和包含6248个基地在基因组学和5外显子相隔4个内含子。的EOLA1基因是高度保守的黑猩猩,猕猴,狗,老鼠,老鼠,鸡,斑马鱼和青蛙。EOLA1蛋白由158个氨基酸组成,有几个糖基化和磷酸化网站和helix-turn-helix主题没有信号肽和膜生成域。这些结构特征表明EOLA1是细胞内蛋白质和可能与其他未知的蛋白质在细胞质和细胞核,调节细胞功能。EOLA1基因的生物信息学分析审查属于激活信号cointegrator-1 (ASC-1)同源性(ASCH)总科,经常观察到许多生物(3,4]。

EOLA1弱表达稳定的条件下,反应有限合伙人在ECV304细胞中高度表达。EOLA1蛋白关系的发现和金属硫蛋白2 (MT2A)已经被酵母double-hybridization证实和coimmunoprecipitation试验(2,5]。MT2A是已知有抗炎、抗内毒素和tumor-inhibiting效应细胞培养(6,7]。此外,MT2A通过诱导细胞凋亡和抑制细胞生长G2 / M逮捕,而负调节NF -κupregulation B通路的我κB -α的差别,对这些》κB -α和细胞周期蛋白D1 (8]。基于大鼠肝移植模型,我们发现EOLA1表达式的显著变化在移植排斥反应9]。这些结果表明可能EOLA1在传输中的作用炎症相关的信号通过与MT2A协会,因此参与炎症反应的调节内皮细胞。

有限合伙人是主要的外表面膜组件出现在几乎所有的革兰氏阴性细菌和作为配体在引发先天免疫应答通过特定的受体在不同真核物种,从昆虫到人类(10,11]。诱导的血管细胞粘附molecule-1 (VCAM-1)是血管内皮细胞激活的标志(12]。VCAM-1属于免疫球蛋白超家族,调节白细胞招募炎症和免疫反应网站,和加速动脉粥样硬化的发展13,14]。有限合伙人也是诱发炎症免疫反应至少部分通过upregulation VCAM-1表达血管内皮细胞。

进一步了解EOLA1生物功能的调节炎症免疫反应,我们专注于确定EOLA1的亚细胞分布及其功效LPS-induced炎症基因的调节反应包括VCAM-1 ECV304细胞。

2。方法

2.1。有限合伙人准备和细胞培养

纯化本土有限合伙人酚提取大肠杆菌血清型0111:B4(σ)溶解在磷酸盐(PBS)的稀释1毫克/毫升,储存在−20°C。对于实验来说,有限合伙人股票的解决方案是进一步稀释为补充组织文化传媒的工作浓度100 ng / mL。ECV304细胞在培养基培养(写明ATCC) 199补充10%胎牛血清,3毫克/毫升玫瑰,100 U /毫升青霉素G, 100毫克/毫升链霉素、6 U / L胰岛素在明胶涂层菜肴在湿润的气氛中5%的有限公司₂。支流文化与EDTA-trypsin分离解决方案,分为1:3为进一步使用。

2.2。建设EGFP-EOLA1融合蛋白表达质粒和细胞转染

一对引物合成根据开放阅读框(ORF) EOLA1序列(正向引物:5′-ACCAGGATCCTCTCTTCATGCCCAAAG-3′,反向引物:5′-AGCAGGATCCTCTCTTCATGCCCCAAAG-3′);EcoR我和BamH我酶网站介绍了终端的正向和反向引物,分别。ECV304细胞与LPS刺激(100 ng / mL) 6 h,然后总RNA提取rt - pcr(豆类),最后的ORF序列EOLA1放大。PCR产品和pEGFP-N2质粒(Clontech)和内切酶切EcoR我和BamH我,那么削减产品恢复了电泳和酶与DNA连接酶(豆类),最后目标ORF序列插入pEGFP-N2质粒和单一的殖民地被选为测序(豆类)转换后的能力大肠杆菌DH5α。

细胞转染,ECV304细胞分裂到6-well培养板(precovered无菌盖玻片)1.5×10⁵/好,不断培养。然后,融合蛋白表达质粒pEGFP-EOLA1和控制质粒pEGFP-N2使用脂质体转染到细胞Lipofectamine 2000(表达载体)48 h。转染效率是由GFP阳性和阴性细胞。

2.3。亚细胞分布EOLA1

细胞转染48 h后,培养基被移除,然后用PBS细胞冲洗两次PFA和固定为4%。细胞的一部分被用来检查亚细胞位置;老鼠的细胞被孵化anti-GFP抗体(初级抗体)和山羊anti-rat抗体(二次抗体)与DAPI染色,LSM510元激光共焦显微镜下拍照(蔡司)。免疫电镜观察发现观察,细胞被固定为4% PFA然后用3%过氧化氢和氧化与血清孵化。之前准备的孵化了兔子anti-EOLA1多克隆抗体主要抗体和HRP-labeled山羊anti-rabbit二级抗体IgG抗体。那么细胞沾HRP-labeled streptoantibiotin和diaminobenzidine (DAB),刀柄glutaral 2.5%和0.1%锇酸固定,脱水与丙酮梯度,然后保存在饱和醋酸双氧铀准备70%丙酮。细胞进一步与纯丙酮清洗,浸泡在丙酮和环氧树脂的混合物(v v = 1: 1),采用纯包埋介质(没有环氧树脂固化促进剂DMP-30)和包埋介质(DMP-30)在40°C,和嵌入环氧树脂618。最后,细胞被制成超薄部分,沾染了铅和TECNA110透射电子显微镜下观察和拍摄(飞利浦)。

2.4。可拆卸的实验

击倒的EOLA1通过RNA干扰(RNAi)来实现的。的寡核苷酸序列EOLA1成分(小发夹RNA)如下:意义:5′-AGGAGGCAAGGATGTATTCTTCAAGAGAGAATACATCCTTGTTTTTTT-3′和反义:5′-AATTAAAAAAAGGAGGCAAGGATGTATTCTCTCTTGAAGAATACATCCTTGCCTCCTGGCC-3′。MT2A击倒,MT2A-shRNA的寡核苷酸序列如下:意义:5′-GATCCGCCGTG ACCGTTTGCTATATTTCAAGAGAATATAGCAAACGGTCACGGTTTTTTGGAAA-3′和反义:5′-AGCTTTCCAAAAAACCGTGACCGTTTGCTATATTCTCTTGAAATATAGCAAACGGTCACGGCG-3′。shRNA表达盒由H1启动子是由这些寡核苷酸插入到质粒pSilencer 3.1 / H1 hygro (Ambion)。pH1 unengineered质粒,被用来作为一个空白的控制。pH1的细胞转染,pH1-EOLA1成分或pH1-MT2A shRNA Lipofectamine 2000在无血清OPTI-MEMI(英杰公司)根据指导手册。的浓度DNA转染向量为8μ在500年最后的g / mLμl细胞被洗后4 h孵化和resuspended与血清完全生长培养基进行进一步的实验。

2.5。rt - pcr和VCAM-1化验

总RNA被隔离后使用试剂盒从细胞试剂制造商的指令(表达载体)。衡量基因mRNA表达水平,用一步法rt - pcr进行试剂盒(豆类)。上游引物合成的共生体(EOLA1: 5′-GCTCGAATTCATGAAGTTTGGCTGCCTCTC-3′,下游:5′-AGCAGGATCCTCTCTTCATGCCCCAAAG-3′;β肌动蛋白:上游:5′-CGGGAAATCGTGCGTGACATT-3′,下游:5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3′)。VCAM-1测定,细胞均质在PBS (1: 2、w / v)含1%蛋白酶抑制剂,然后在12000×g离心20分钟在4°C。anti-EOLA1的多克隆抗体产生从新西兰白兔免疫和免疫印迹法鉴定。免疫球蛋白对EOLA1纯化蛋白琼脂糖列。多克隆抗体的效率是衡量ELISA分析。ECV304细胞的溶解产物分析与抗体EOLA1蛋白免疫印迹。分析了上层清液使用酶联免疫试剂盒(σ)根据制造商的指示。

2.6。免疫印迹分析

转染细胞细胞溶解与缓冲区里帕补充完整的蛋白酶抑制剂平板电脑(罗氏)。酚试剂法测定溶菌产物蛋白质浓度测定。蛋白质样品(30μg)加载在sds - 9%聚丙烯酰胺凝胶,然后转移到Protan硝化纤维膜electroblotting设备,使用标准的程序。如前所述(执行Immunodetection2)通过使用anti-EOLA1、anti-MT2A或anti-GFP作为主要抗体和二级抗体Ig-horseradish过氧化物酶共轭(表达载体),反β肌动蛋白作为加载控制。anti-EOLA1的多克隆抗体产生从新西兰白兔免疫和免疫印迹法鉴定。免疫球蛋白对EOLA1纯化蛋白琼脂糖列。多克隆抗体的效率是衡量ELISA分析。

2.7。统计分析

数据表示为±标准错误。学生的确定执行以及ELISA分析的统计学意义;被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。EOLA1在ECV304细胞的亚细胞分布

ECV304细胞转染pEGFP-EOLA1融合蛋白表达质粒和控制pEGFP-N2质粒48 h。激光共聚焦显微镜下观察的图像。ECV304细胞转染与控制质粒或融合蛋白表达质粒了全细胞均匀分布到绿色荧光,而与融合蛋白表达质粒转染的细胞也有核聚合数据1(一)和1 (b))。准备的兔子anti-EOLA1多克隆抗体作为主要抗体,转染细胞被标记免疫,然后电子显微镜下观察。没有控制的细胞转染质粒免疫沉淀,但明显免疫沉淀沉积在细胞的细胞质基质与融合蛋白表达质粒转染(图1 (c))。

3.2。LPS诱导EOLA1表达和VCAM-1生产ECV304细胞

ECV304细胞融合,然后用LPS刺激增长到80% (100 ng / mL)的时间进程。细胞表明EOLA1表达时间的方式在两个基因转录增加(图2(一个)(图)和翻译2 (b))。VCAM-1集中阐明文化上层清液用ELISA。接触的细胞有限合伙人(100 ng / mL)导致显著增加VCAM-1生产3 h(后)(图2 (c))。所有的数据是由三个独立重复实验。

3.3。过度的EOLA1抑制的表达VCAM-1 LPS诱导的ECV304细胞

进一步描述的功能影响EOLA1 VCAM-1感应在ECV304细胞,这些细胞被cotransfected pOPRSVI-EOLA1-EGFP和pCMV-LacI后稳定EOLA1过表达质粒通过IPTG诱导(图3(一个))。过度的细胞EOLA1治疗后与有限合伙人(100 ng / mL)添加IPTG 48 h。VCAM-1蛋白在细胞上清液生产检测的ELISA测定后6 h有限合伙人的待遇。结果表明,有限合伙人显著诱发VCAM-1蛋白质分泌,和超表达EOLA1减少VCAM-1蛋白质水平LPS诱导的ECV304细胞(图3 (b))。

3.4。击倒EOLA1增强LPS-Induced VCAM-1生产ECV304细胞

进一步调查的有效性在LPS-induced EOLA1 VCAM-1生产、EOLA1成分的ECV304细胞转染EOLA1基因沉默。EOLA1表达差别明显对这些被证实在EOLA1 shRNA转染细胞免疫印迹。击倒EOLA1还显示减少MT2A表达式(图4(一))。击倒EOLA1导致增强LPS-induced VCAM-1蛋白质分泌(图4 (b))。

3.5。通过MT2A EOLA1调节VCAM-1生产

EOLA1在ECV304细胞,有与MT2A EOLA1调节MT2A的表达,表明EOLA1介导VCAM-1生产通过与MT2A协会。我们进一步研究了在LPS-induced MT2A免疫反应的作用。与LPS MT2A击倒细胞治疗,VCAM-1的细胞上清液用ELISA测定在有限合伙人治疗后6 h。结果表明,击倒MT2A会使LPS-induced VCAM-1蛋白质分泌在ECV304细胞(图5)。

4所示。讨论

EOLA1是一种新型的基因首先发现了我们的研究小组从LPS-induced基因表达在ECV304细胞的筛选;然而,对炎症的生物功能。要理解EOLA1的亚细胞分布,我们定向克隆EOLA1的ORF序列pEGFP-N2载波,从而成功地构建EGFP-EOLA1融合蛋白的真核表达质粒转染ECV304细胞。此外,我们激光共焦显微镜下观察转染细胞后瞬时表达。观察结果显示强绿色荧光信号在细胞质和细胞核。DAPI染色证实融合蛋白在细胞质中表达,在原子核聚合。此外,我们进一步观察亚细胞定位EOLA1水平的细胞超微结构利用免疫电镜酶标记技术,结果证实EOLA1的表达主要是局部在细胞质中。上述观察结果表明,EOLA1是细胞内蛋白质和有能力把细胞核从细胞质中,尽管这种现象在未来仍然需要进一步证实。

ECV304细胞属于人类脐静脉内皮细胞,可以激活LPS刺激。有限合伙人可以启动TLR4介导的细胞内信号事件,包括激活NF -κB,这最终会导致内皮细胞的转录和释放VCAM-1吸引单核巨噬细胞积累的炎症反应(15,16]。最近的研究还表明,LPS-induced VCAM-1表达导致动脉粥样硬化的起始过程(17,18]。我们的实验表明,有限合伙人诱发EOLA1表达随着VCAM-1感应,过度VCAM-1 EOLA1减少LPS-induced生产的ECV304细胞,和损耗EOLA1显著增强VCAM-1 LPS-induced生产。我们的研究结果表明,由有限合伙人EOLA1调节内皮细胞激活的程度和可能的负调节炎症免疫反应。

MT2A是一种低分子量蛋白质在细胞质中,在细胞代谢中扮演多个角色,有影响的抗炎、抗内毒素、抑制肿瘤的生长。最近的报告表明,MT2A减少细胞炎症反应通过抑制NF -的激活κB,我通过上调κB -α。我们的结果表明,EOLA1调节MT2A的表达和影响生产与MT2A VCAM-1的;因此ECV304细胞的过度激活可以避免,和优良的管理和及时控制炎症反应可能从而实现。这将避免过度炎症反应损伤的组织和细胞。的详细机制EOLA1协会与MT2A及其对NF -功能的影响κB信号通路需要进一步表征。

总之,EOLA1扮演一个消极监管作用LPS-induced VCAM-1表达式与MT2A下ECV304细胞。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

承认

这项工作得到了国家自然科学基金的研究资助中国(赠款。30670838)。

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