慢性乙型肝炎肝内B淋巴细胞的临床特征

摘要

体液免疫是对抗病毒感染的主要防御机制。然而，在慢性乙型肝炎病毒(HBV)携带者中，肝损伤与B细胞群的关系尚未得到很好的研究。本研究以57例乙肝表面抗原(HBsAg)阳性和HBeAg阴性患者为研究对象，采用免疫组化方法检测肝活检切片中B细胞表面标记物CD20的表达。患者肝活检时的临床资料来自其病历。HBV DNA与ALT (那)及组织活性指数(HAI)总分(那),分别。所有57份膜下和膜下染色的肝活检标本中都表达了CD20，其表达与HAI总分显著相关(那)及纤维化分期(那）.对乙肝病毒易感的B淋巴细胞可能与乙肝病毒诱导的肝损伤的免疫介导炎症的发展有关。目前的数据也支持肝脏可能是继发性淋巴器官之一。

1.介绍

慢性乙型肝炎(CHB)病毒(HBV)感染是肝硬化和肝细胞癌(HCC)的主要原因[1］．hbv相关慢性肝病的发病机制尚不清楚。然而，很明显，与抗病毒反应相关的免疫机制是导致慢性乙型肝炎结局的原因[2-4.］．人肝脏中淋巴细胞的存在是一种病理情况[5.］．这一概念源于对慢性乙型肝炎的观察，即t细胞可能既参与对hbv感染细胞的免疫清除，又参与肝细胞损伤的发病机制[6.］．此外，肝硬化患者的B淋巴细胞和血浆细胞的数量显着高于具有活性慢性肝炎的那些患者[7.那8.］．大量产生IgM和IgG的肝内b细胞和浸润到肝小叶的浆细胞也在hbv相关的慢性活动性肝炎中被发现[9.］．b细胞通过分泌效应细胞因子促进免疫反应，已有研究表明幼稚型和记忆型b细胞亚群优先产生不同的效应细胞因子[10.那11.］．

在与在树突细胞上可接近的特定蛋白质接触后，通过在B细胞受体（BCR）基因的免疫球蛋白可变区中，通过体细胞增长的体细胞素utation进行成熟。然后通常由两种同种型膜IgM和IgD组成的高亲和力抗原受体继续成熟至IG分泌血浆细胞或记忆B细胞[12.］．与抗原初次反应相比，免疫记忆具有在抗原再次暴露后增加更快、更有力的体液反应的能力[13.］．虽然早期研究报道了针对乙肝核心抗原(HBcAg)的抗体相关机制，但关于CHB患者肝脏中B淋巴细胞群体的数据很少。细胞标记是识别和分类细胞类型的唯一标记。CD20是一种b细胞特异性表面抗原，除早期b细胞或浆细胞外，在b细胞发育的所有阶段均有表达，并在b细胞激活和增殖中发挥重要作用[14.］．

为了阐明肝内B细胞在慢性乙型肝炎发病机制中的作用，我们采用免疫组化方法研究了这些患者肝组织活检中B细胞上CD20标记的表达。

2.材料和方法

２.１.病人

肝脏活检标本从57例HBV相关慢性肝病患者没有肝脏肿瘤，在德黑兰医学科学大学西兰迪医院肝炎诊所进行了研究。通过患者血清中的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的阳性诊断出HBV感染。所有患者都是HBEAG阴性，具有家族性HBV感染的历史，没有人类免疫缺陷病毒（HIV）或其他肝炎病毒的繁殖。患者没有自身免疫性肝炎或其他肝脏相关疾病。患者肝活检时的临床资料来自其病历。没有患者在肝脏活组织检查之前接受抗HBV治疗。本研究的议定书由Shariati医院的伦理委员会批准。

２.２.肝脏的组织学研究

通过改性的组织学活动指数（HAI）评分系统评估CHB，纤维化阶段和组织学活性[15.]，苏木精-伊红和天狼星红染色。

２.３.肝组织活检标本的免疫组化及分析

使用市售CD20单克隆抗体(克隆UCHT1, Dako)对3.0进行染色μ通过常规微波抗原检索和辣根过氧化物酶（二氨基苯并异辛胺）试剂盒（Dako，Carpinteria，CA），遵循制造商的说明，肝活组织检查的M部分。免疫组织化学评分范围为1至5分（匹配0-10％，10-25％，25-50％，50-75％，> 75％CD20阳性细胞），具有较高的分数，表明阳性细胞比例更高（从阳性对照中确定。对于CD20阳性B细胞的枚举，通过该图像采集完成那,目的:在全视野内计数染色细胞相当于30毫米的组织面积²．在细胞膜的细胞质侧进行CD20阳性染色。阳性染色细胞无明显浆细胞样形态，胞质呈颗粒状，核呈分叶状。淋巴结切片作为CD20抗原的阳性对照。

２.４.统计分析

所有数据均以均数±标准差(SD)表示。采用Pearson相关系数分析变量间的相关性或Spearman等级相关系数,如适当。一个值<0.05认为有统计学意义。

3.结果

３.１.病人的特点

本研究共纳入57例HBeAg阴性患者。基线人口统计资料见表1．平均±SD年龄为年龄和40岁(70%)为男性。患者肝纤维化和坏死性炎症的HAI评分平均值±SD见表1．9例(15.7%)明显纤维化大于或等于3例。


变量		最低	最大	的意思是	Std.偏差

年龄(年)	57	21.	55	33	9.
HBV DNA (Copies/mL)	57	1.19	6.30	3.05	1.21
ALT (IU / L)	57	18.	132.	40	24.
HAI评分为全部坏死性炎症和纤维化	57	1	9.	3.65	1.54
纤维化阶段	57	0.	5.	1.61	1.031
肝脏CD20(分数)	57	1	4.	1.95	0.71
肝脏IGD（得分）	57	1	4.	1.95	0.91

３．２．临床研究结果

将CD20表达评分、年龄、性别、log病毒载量、血清ALT、坏死炎症和纤维化的HAI总评分纳入多变量校正logistic回归模型，分析b细胞群体对CHB患者的影响。HBV DNA与ALT和HAI总得分之间存在显著相关性(那,那),分别。血清ALT与HAI总分呈正相关，但无显著性差异(那）.年龄、性别与HBV DNA、ALT之间无交互作用及多重共线性关系，CD20 b细胞标志物表达与血清ALT、HBV DNA水平无显著相关性。

3.3。肝脏b细胞流行的免疫组化检查

肝脏通过CD20阳性B细胞疏入渗透，作为门岩区域的聚集体分布，作为小叶内的单细胞。CD20阳性B细胞在所有57个肝脏活组织检查中表达，潜水胆囊和膜质染色图案（图1）.CD20的表达与HAI总分数显着相关（那)及纤维化分期(那）.CD20阳性的b细胞呈小簇状出现。CD20阳性b细胞15例，2例31例，3例10例，4例1例。

（一种）

（b）

（C）

(d)

(e)

图1

CD20标记的代表性显微镜子通过免疫组织化学在乙型肝炎病毒相关的慢性肝病中。（（a），（b））CD20在没有纤维化和低纤维化的慢性乙型肝炎患者中的表达（原始放大倍数，200）。（（c），（d），（e））在整个高纤维化慢性乙型肝炎患者的门户区域（原始放大倍数，100,200和400）中观察到CD20免疫反应性。

4.讨论

在本研究中，我们研究了肝内b细胞在CHB感染发病机制中的作用。本研究肝脏活检的免疫组化结果表明，b细胞在CHB的发病机制中发挥了重要作用，其驱动因素是CD20阳性b细胞数量的增加。我们的证据显示CD20阳性b细胞聚集在门脉区或作为单个细胞聚集在小叶内，并与坏死炎症和纤维化相关，这与之前的研究一致[9.］．事实上，我们的组织学发现与急性乙型肝炎引起的肝衰竭患者的组织学图相似，反射性B细胞应答可能与HBV核心蛋白(HBcAb)抗体的大量表达有关。然而，很少有研究报道这一内容。我们的研究表明，b细胞参与了破坏感染细胞的炎症反应。因此，它们在CHB感染的免疫应答中发挥重要作用。

与HBsAg和HBeAg不同，HBcAg的免疫原性能够在淋巴管外和t细胞缺乏的情况下直接激活b细胞产生特异性抗体[9.］．此外，已经证明b细胞的激活，在t细胞独立的途径中，在肝脏中产生免疫球蛋白和细胞因子，改变了纤维化反应[11.那16.］．我们最近的研究表明，IgD阳性B细胞与慢性乙型肝炎纤维化期的相关性[17.］．肝内淋巴细胞被认为是长寿命的循环b细胞，类似于脾B2细胞，产生细胞因子IL-2, IL-4, TNFα，具有促炎功能的IL-6，并促进抗体 - 独立的时尚的疾病发病机制，也许通过调节T细胞反应来促进T细胞[16.那18.］．早期研究表明，b细胞通过产生促纤维化细胞因子IL-6，诱导肝星状细胞向肌成纤维细胞分化，并提高胶原合成，明显促进了肝纤维化的发展[16.那18.那19.］．均为属于B2亚群的肝脏成熟B淋巴细胞[16.静止的b细胞通常有CD20受体[14.］．因此，我们建议CD20标记物作为原始和预记忆b细胞的代表性标记物。

评估肝内b细胞群对于确定b细胞如何对HBV感染作出反应非常重要。在这种情况下，来自当前研究的证据表明，暴露于病毒抗原可以增加肝脏中携带枯竭表型的b细胞的比例，从而导致功能障碍。我们目前的数据也支持肝脏作为一种免疫系统的特性，这可能潜在地影响各种肝病的发病机制。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

所有作者均致力于研究和讨论，他们已阅读并批准最终纸张。

致谢

本文作者希望藉此机会感谢所有参与这项研究计划的患者。这项研究得到了德黑兰医学科学大学消化疾病研究所的资助。

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