微分作用的雷帕霉素和通润/ KU63794 CA-MRSA 264.7原始巨噬细胞的炎症反应刺激

文摘

背景。雷帕霉素抑制RAW264.7巨噬细胞介导的炎症反应,但在低剂量诱导。在目前的研究中,我们测试了炎症反应的抑制mTOR 1和2抑制剂的存在,通润和KU63794。方法。与10 RAW264.7细胞被刺激了18小时⁶到10⁷CFU /毫升接种物的社区——(CA)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分离,USA400应变对象,在万古霉素的存在。然后,在连续的实验中,我们添加了通润,KU63794,雷帕霉素单独和各种组合。上层清液收集和化验TNF、il - 1、il - 6,正无穷,没有。结果。雷帕霉素诱发炎症级联的10 - 20%剂量的0.1 ng / mL,抑制60%剂量的10 ng / mL。感应废除在通润KU63794的存在。通润和KU63794持续抑制细胞因子生产50 - 60%。结论。之间有一个微分响应雷帕霉素(mTOR-1抑制剂)和通润KU63794 (mTOR 1和2抑制剂)。通润和KU63794表现出剂量相关的抑制。雷帕霉素展览一个重要induction-suppression两相的反应。知识的反应可能允许操作临床感染性炎症级联的优势。

1。介绍

顺序从巨噬细胞释放细胞因子推动感染的炎症反应。压倒性的细胞因子释放简单感染变成脓毒症(1,2]。主人似乎山两相的细胞因子释放反应:首先安装一个促炎和抗炎反应消除细胞激素风暴的正反馈循环(3]。抗炎反应或“immunoparalysis”指的是身体的能力下降和挂载一个适当的细胞激素风暴和免疫反应,并可能导致继发感染(4,5]。

我们先前的研究集中在信号通路对CA-MRSA小鼠巨噬细胞的反应。我们已经表明,NMDA受体激动的增加和相同的受体减少肿瘤坏死因子拮抗反应(6]。下游的NMDA, phosphoinositide-3激酶/ akt (PI3 / akt)等也会影响反应(6,7]。下一个下游信号分子是哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR复杂)。mTOR的角色作为一个中央控制器的细胞生长,增殖和代谢被描述,但许多方面尚不清楚(8,9]。之前有我们小组的研究表明,抑制mTOR的雷帕霉素对TNF分泌有两相的反应存在剂量依赖的相关性(7]。以非常低的剂量,雷帕霉素TNF产量增加,但是,在10倍剂量,TNF分泌减少。雷帕霉素通过绑定胞质FK-binding蛋白质12 (FKBP12)和这些形成一个复杂的绑定mTOR复杂1 (mTORC1) [10- - - - - -15]。mTORC1是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸激酶功能作为氧化还原传感器,调节细胞生长和增殖16]。雷帕霉素可能还mTOR2但还不清楚这种途径影响炎症级联(17]。CD-34派生树突细胞凋亡当暴露于雷帕霉素,但单核细胞和巨噬细胞(18]。

众所周知,这些有各种合成代谢和分解代谢的活动;然而,mTORC1的相对作用和mTORC2巨噬细胞细胞因子刺激是未知的。

存在两个mTORC1和2抑制剂:KU63794通润;虽然他们的角色还不清楚,但它似乎表现出更完整的mTORC比雷帕霉素抑制[19,20.]。本研究探讨了他们的角色在炎症级联相比,雷帕霉素的行动。炎症通路的调查是很重要的,因为雷帕霉素和通润目前正在使用和癌症患者具有重要的意义。此外,知识的途径也可能提供优势在脓毒症的免疫调节。在本文中,我们假设mTORC 1和2抑制剂对细胞因子的刺激会有不同的影响比雷帕霉素在CA-MRSA刺激小鼠巨噬细胞模型。

2。方法

细菌。本研究的细菌都是选CA-MRSA菌株MW-2,中西部应变导致严重的侵袭性疾病。MW-2应变是代表美国- 400隔离,在美国的一个主要CA-MRSA病原体(21]。细菌生长在37°C到对数生长期后期大豆胰蛋白酶的肉汤(Becton, Dickinson和公司,火花,医学博士,美国),然后在endotoxin-free磷酸盐洗。菌落计数被用来确定细菌的浓度。基于我们以前公布的数据与CA-MRSA我们目标浓度的细菌cfu /毫升(6,7,22]。的最低抑制浓度确定使用电性能测试方法在微生物实验室Le Bonheur儿童医院(LBCH)和与麦克风的< 0.5对万古霉素敏感μ克/毫升。

细胞培养。细胞培养包括RAW264.7鼠macrophage-like细胞从写明ATCC购买。细胞培养在杜尔贝科修改鹰的介质(美国弗吉尼亚州Mediatech,赫)和补充10%胎牛血清(美国UT HyClone,洛根)和2毫米谷氨酰胺(美国纽约GIBCO,大岛)。在实验中,细胞被放置在每个24-well组织文化板块(美国新泽西州,正欲富兰克林湖)。

万古霉素是在美国药店购买从Hospira LBCH(美国森林湖,IL)和用于中度耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的不受控制的增长和大规模TNF生产。临床上可实现的万古霉素的浓度,20μg / mL之前添加到细胞培养的葡萄球菌。

这是并行完成各种托林的优势(Tocris生物科学,英国布里斯托尔)和KU63794 (Tocris生物科学,英国布里斯托尔)来创建一个剂量曲线。下面的这些上层的收获和分析(方法)和托林的最佳剂量和KU63794被确认。万古霉素的检测浓度,雷帕霉素,通润,KU63794没有影响的可行性RAW264.7细胞由单层的视觉检查在低功率下微观。

一旦通润的最佳剂量和KU63794是已知的,与托林的组合实验重复了,雷帕霉素(0.1,1、10和100 ng / mL) (18,23),KU63794。控制水平TNF、il - 1、il - 6、INF和没有(雷帕霉素作为控制)与刺激的存在的各种组合mTORC1抑制剂雷帕霉素,和mTORC 1、2点抑制剂托林,mTORC 1、2点抑制剂KU63794。

孵化后,收集浮在表面的游离和化验为细胞因子浓度使用固相为TNF -夹心酶联immunoabsorbent试验美国圣地亚哥(eBioscience CA),干扰素(PBL生物医学,皮斯卡塔韦,新泽西,美国),il - 1(研发系统,明尼阿波利斯,美国),和il - 6 (eBioscience、圣地亚哥、钙、美国)。没有检查使用浓度格里斯反应(WI Promega,麦迪逊,美国)。TNF分泌测量验证与平均三个复制执行三次,共计9个样本。存在内在实验变异在TNF、il - 1、il - 6,正无穷,也没有生产在不同的细胞培养瓶由于独特的细胞培养和内源性巨噬细胞差异,这是符合我们之前的研究(6,7,22,24]。细胞从相同的人口被用来最小化所有实验和排名反应的变化。

mTOR激活。mTOR的激活是估计MSD磷蛋白质测定整个细胞溶解产物工具包。磷比例(Ser2448) /总mTOR 5计算μ在3 g细胞溶解产物重复。细胞暴露在没有添加mTOR耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,以及随后的雷帕霉素0.1,1、10和100 ng / mL,托林1和5 ng / mL, KU63794 1和5 ng / mL。

细胞生存能力。KU63794,通润,雷帕霉素剂量用于我们的实验没有影响的可行性RAW264.7细胞由单层的低功耗显微镜检查和排除0.2%台盼蓝染料。细胞生存能力被证实使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) 2 (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium内盐(MTS)根据制造商的指示(WI Promega,麦迪逊,美国)25]。MTS试剂是降低新陈代谢活跃的细胞变成彩色甲瓒产品然后测量其吸光度。总之,MTS的解决方案是添加到井的96 -微量滴定板,细胞培养2 h。然后在490 nm吸光度测量。

数据分析。数据分析与R 2.12.2软件。所有结果排名和表达为百分比控制成倍增加。百分比可以很容易地转化为实际价值,因为实际控制价值(pg / mL)为每个实验。例如,当肿瘤坏死因子的响应是控制和实际控制的80%价值33561 pg / mL,然后响应pg / mL = 26849 pg / mL。没有测量的浓度m .数据画箱线图的意思和1.96 SE。

mTOR计算的活化磷的与总mTOR的一小部分,画箱线图。

3所示。结果

3.1。通润和KU63794

首先,0的影响,2.5,5日和10 pg / mL剂量的通润和KU63794测试。没有托林,对象CA-MRSA RAW264.7刺激巨噬细胞产生33561 pg / mL TNF生产被用作控制,也就是说,100%的回应。2.5 ng / mL的加入降低了反应- 22821 pg / mL或68% ()。进一步增加添加托林的5和10 ng / mL减少了TNF - 16109 pg / mL(48%)和15438 pg / mL (46%)。这些削减是不同的控制()和2.5 pg / mL托林,而不是统计不同。减少对其他细胞因子的影响也显示的控制。il - 1产在555 pg / mL没有托林(100%)控制和减少到244 pg / mL (44%)、239 pg / mL(43%),和245 pg / mL(44%)剂量的2.5,5日和10个pg / mL,分别。比控制(虽然都是不同的),他们并没有统计上的不同。因此,剂量效应减少2.5和5或10 ng / mL的托林观察TNF和il - 1未见。减少il - 6,正无穷,没有生产类似的模式与il - 1。通润影响TNF、il - 1、il - 6正,没有展示在表1(上部)和描绘成图在图1(一)。

KU63794的反应是相同的。没有KU63794,对象CA-MRSA RAW264.7刺激巨噬细胞产生和平均32865 pg / mL TNF(稍微不同的平均33561 pg / mL观察通润系列),这一般被用作控制,也就是说,100%的回应。添加KU63794 2.5、5、10 ng / mL减少了生产22677 pg / mL (69%)、17417 pg / mL(53%)和16.104 pg / mL (49%)。这些价值观都是不同的控制(2.5 ng / mL)和反应是不同的反应5 ng / mL或10 ng / mL ()。il - 1产在432 pg / mL没有托林(100%)控制和减少到202 pg / mL (47%)、203 pg / mL(47%),和190 pg / mL (44%) 2.5 pg / mL, 5 pg / mL,分别和10个pg / mL。所有KU63794添加不同的控制(),但不是从对方;也就是说,不存在剂量效应。KU63794影响TNF、il - 1、il - 6正,没有展示在表1(下部)和描绘成图在图1 (b)。剂量曲线实验表明,托林和KU63794减少抑制(~ 80 - 99%的控制)在剂量的2,1.5,1 ng / mL和高原不显著不同的值剂量0.9,0.7,0.5,0.3,0.1,和0.01 ng / mL。

细胞的生存能力测试中描述的部分2。没有变化的光谱测试剂量。

3.2。雷帕霉素和托林

0,0.1的影响、10和100 ng / mL雷帕霉素比较相同的雷帕霉素剂量和托林5 ng / mL。刺激巨噬细胞产生平均32758 pg / mL的TNF没有雷帕霉素,这是用作控制(100%)。当雷帕霉素添加剂量的0.1,10或100 ng / mL, TNF的平均生产37672 pg / mL (115%)、21620 pg / mL(66%),和20965 pg / mL(64%),分别为。所有的反应都不同的控制()。然而,0.1 ng / mL剂量响应是不同的比10 ng / mL和100 ng / mL,增加而不是抑制肿瘤坏死因子的响应。il - 1的反应没有雷帕霉素486 pg / mL(建立控制100%)和类似的响应的雷帕霉素0.1 ng / mL (486 pg / mL: 100%)。然而,在10和100 ng / mL雷帕霉素,il - 1响应减少到301 ng / mL(62%)和297 ng / mL (61%);两个显著不同的控制。托林5 ng / mL时添加到同样的实验(雷帕霉素剂量0、0.1、10和10 ng / mL),减少49%,43%,和41%,分别被注意到。都显著不同的控制响应34231 pg / mL (),但不明显不同于对方。因此,细胞因子的增加反应观察到0.1 ng / mL的雷帕霉素单独被淘汰(100%响应没有与通润通润和49%)。与其他细胞因子也发现类似的结果。其他细胞因子的结果展示在表2和图2。细胞的生存能力在实验测试中描述的部分2。

3.3。雷帕霉素和KU63794 5 ng / mL

的影响类似于Rapamycin-Torin实验,0,0.1,10,100 ng / mL的雷帕霉素比较相同的雷帕霉素剂量和KU63794 5 ng / mL。控制没有雷帕霉素32865 pg / mL,添加0.1 ng / mL雷帕霉素TNF平均增加到42171 pg / mL, 120%,是观察在前面的实验。10和100 ng / mL的雷帕霉素除了降低TNF控制水平为65%和64%,所有的这些显著不同()。5点KU63794 ng / mL钝化0.1 ng / mL Rapamycin-induced TNF响应控制的69%。10和100 ng / mL的雷帕霉素5 ng / mL KU63794分别为53%和49%,明显不同于控制(0.05),而不是彼此。il - 1的反应有一个类似的模式增加0.1 ng / mL的雷帕霉素(113%的控制),但减少到43%的控制,当KU63794 5 ng / mL补充道。这项研究的结果发表在表3并在图描绘成图3。细胞的生存能力测试中描述的部分2。

3.4。激活mTOR

磷酸化/总mTOR细胞分数控制(由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细胞刺激没有抑制剂)为1.82。雷帕霉素0.1,1、10、100 ng / mL,结果分别为1.56,0.82,0.46,和0.43;因此,增加剂量的雷帕霉素表现出递增的抑制。

当托林或KU63794剂量1或添加剂量5 ng / mL,分数为0.75,0.32,0.81和0.35分别。因此,磷酸化/总mTOR分数抑制剂的存在,雷帕霉素,托林,在所有抑制剂或KU63794,摄入量有关。激活分数是一样的雷帕霉素10或100 ng / mL,托林5 ng / mL,或KU63794 5 ng / mL使用()去图4。

4所示。讨论

雷帕霉素的角色,一个不完整的mTORC抑制剂存在剂量依赖的相关性,更有效mTOR通润/ KU63794探索中严重的炎症。

符合我们之前的研究,我们发现低剂量的雷帕霉素不抑制,而是刺激肿瘤坏死因子生产(7]。在高剂量,雷帕霉素抑制这些细胞因子的生产。然而,结合通润或KU63794时,我们发现感应效应不再存在。高剂量的雷帕霉素单独或与托林或KU63794抑制细胞因子的生产。这个数据显示抑制与肿瘤坏死因子的生产是一致的,正无穷,il - 1、il - 6,没有。虽然雷帕霉素0.1 ng / mL感应相对较小(10 - 20%),有显著不同的反应是否与60%相比与高剂量抑制诱导。这样的差异(60%)可能使重要的细胞因子和败血症的临床反应操作在不同阶段。这可能解释临床过程的可变性偶尔出现在败血症的病人服用雷帕霉素。通润KU63794抑制TNF,正无穷,il - 1、il - 6,没有50%的控制在一个没有表现出的剂量相关的模式归纳。

磷(Ser2448) /总mTOR的评估在不同的雷帕霉素剂量无法解释两相的肿瘤坏死因子海拔,因为它是剂量依赖性。同样,通润和KU63794也表现出剂量依赖性抑制。

雷帕霉素被描述为剂量依赖性癌症细胞代谢抑制剂(26- - - - - -28]。托林的更完整的抑制和KU63794一般归因于mTORC2抑制,虽然更完整的抑制mTORC1是可能的(19,29日]。雷帕霉素的mTORC抑制也依赖于磷脂酶D的活动。磷脂酶D升高似乎增加了雷帕霉素抵抗mTOR抑制(26,27,30.,31日]。

我们推测,抑制细胞因子的生产是一个相对量的抑制的结果mTORC1 mTORC2,因为磷脂酶D活动之间的类似实验。因此,比例抑制mTORC2或更完整的抑制mTORC1似乎抑制影响细胞因子的生产在小鼠巨噬细胞模型。

有一个固有的限制适用性当比较体外小鼠巨噬细胞的体内模型。葡萄球菌中毒性休克的雷帕霉素的影响研究(32,33]。然而,我们发现雷帕霉素的存在剂量添加细胞因子生产双相的影响。这样的效果不存在其他mTOR通润和KU63794。

5。结论

雷帕霉素提供了一个重要的两相的诱导和抑制炎症级联。通润和KU63794提供一剂抑制炎性细胞因子有关。通润和KU63794似乎钝雷帕霉素诱导和将它转换为一个剂量相关的抑制。本研究在细胞培养败血症仿真模型描述了不同但需要更多的研究来定义的具体贡献mTOR1 mTOR2。然而,理解和进一步探索mTOR的微分响应炎症会导致临床优势细胞因子调制基于雷帕霉素剂量或通润和KU63794组合。脓毒症中特别是在免疫抑制病人需要了解免疫过度活跃和免疫抑制的平衡。小而果断的规定在适当的阶段可能提供重要的临床优势。

突出了

(我)雷帕霉素展品剂量相关的炎症级联两相的影响。(2)通润和KU63794 (mTOR 1和2抑制剂)抑制炎症反应。(iii)的托林或KU63794转换雷帕霉素对抑制的反应。

利益冲突

作者没有利益冲突与本文相关的披露。

作者的贡献

丽贝卡•k h . Shappley和托马斯·Spentzas导致数据的采集。丽贝卡•k h . Shappley和托马斯·Spentzas导致的概念和设计和解释数据。托马斯Spentzas促成了统计分析。托马斯·Spentzas和利百加k h . Shappley给了最后批准。

确认

这项研究是由格兰特(没有支持。641001)儿童基金会研究所Le Bonheur儿童医院。在第42部分本文提出了重症监护国会,圣胡安,波多黎各,2013年1月19号,(抽象)。

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