白细胞介素-17A加重氯化铁诱导的大鼠颈动脉血栓形成

摘要

白细胞介素-17A（IL-17A）是IL-17细胞因子家族中研究最广泛的成员，是一种对宿主防御以及自身免疫性疾病发病机制起关键作用的细胞因子。此外，IL-17A参与心血管疾病的发病机制，如动脉粥样硬化和急性冠状动脉综合征，以及与心血管相关的风险与此相一致，我们最近发现IL-17A增加了人类和小鼠血小板对ADP的反应。在这项研究中，我们扩大了先前的观察，并首次描述了体内细胞因子的血栓前作用。我们的结果表明，IL-17A与低FeCl协同作用_3.我们的研究结果表明，IL-17A可能是止血和炎症界面上的一个重要分子。

“本文致力于阿尔弗雷多博士教授的记忆”

1.介绍

越来越多的实验和临床证据表明，血栓形成和动脉粥样硬化可能与炎症反应密切相关[1]．炎症降低天然抗凝机制的活性，启动凝血，并损害纤维蛋白溶解系统。的确，促炎分子参与了白细胞向血管损伤和炎症部位的激活和迁移，并可能促进活化细胞释放血栓前因子，进而激活血小板和其他细胞[2那3.]．

最近，在受免疫慢性炎症影响的受试者中观察到的血清腺关节炎（RA），多发性硬化症（MS）和炎症性肠病（IBD）中可能代表心血管危险的原因在这些病理学中观察到[4.-6.]．可能涉及多个因素。循环细胞因子和募集的炎症细胞可能导致内皮激活和功能障碍，导致普形孕态[7.那8.]．

白细胞介素-17a（IL-17A）是IL-17细胞因子家族最广泛研究的成员。它主要由T-辅助（TH）-17淋巴细胞产生，以及天然杀伤T（NKT）细胞，γδT细胞(γδ-17），细胞毒性CD8⁺T细胞(Tc17)和中性粒细胞[9.-11].IL-17A是一种促炎症细胞因子[12，在风湿性关节炎、多发性硬化症和IBD等慢性炎症性疾病患者中大量产生[13-15]．IL-17A也参与动脉粥样硬化[16]; 此外，在人类中，循环IL-17A水平与急性冠脉综合征之间也存在正相关[17那18]．这些发现表明，IL-17A可能在与系统性免疫疾病相关的心血管风险中发挥作用。最近，在试图发现炎症标志物和内皮功能障碍之间的联系，Marder等[19]证明IL-17A是一种炎症标记物，可能与类风湿性关节炎患者血管功能受损的标记物呈正相关。与此相一致的是，在HUVEC上，IL-17A降低CD39 mRNA的表达，并与肿瘤坏死因子协同作用α(肿瘤坏死因子α)它能够诱导组织因子（TF）的表达并下调血栓调节蛋白的表达[20.]．众所周知，动脉血栓形成的主要原因是血小板粘附在受损血管上并激活[21].激活后，内皮失去其抗血栓特性，血小板可能被激活[2]．因此，IL-17a可以激活内皮细胞朝向癌细胞;但是，到目前为止没有体内证据。我们最近证明IL-17A将人和小鼠血小板反应增加对腺苷-5'-二磷酸（ADP）。体外这种效应与血小板表面P-选择素的暴露增加有关[22].由于血小板主要参与动脉血栓的形成[21[已发现血小板反应性增加，其中几种系统性免疫疾病，其中IL-17A也涉及[6.那7.那23，在此我们试图研究IL-17A对体内动脉血栓形成。

2.材料和方法

2.1.三氯化铁诱导的血栓形成

雄性Wistar大鼠（300-350只） g、 所有实验均使用哈兰·诺桑（意大利密苏里州科雷扎纳市），动物在标准条件下进食随意并保存在一个12 h/12 光/暗循环°C.所有体内程序符合1992年1月27日1992年1月27日的意大利立法法令（D.L.）第116号。1986年11月24日（8676097ECC）的欧洲社区委员会指令的联系人。所有努力都是为了尽量减少动物痛苦并减少他们的数量。

用乌拉坦（10%）麻醉大鼠 重量/体积；10 毫升/千克 并放在手术台上。FeCl诱发动脉血栓_3.根据Kurz等人的描述，右颈动脉表面的应用[24]简单地说，手术后，一张滤纸（Whatman 1,3×5 mm）浸泡在10 μFeCl溶液的L_3.（5％）或重组小鼠IL-17A（100 μg/mL, HCl 4mm, R&D System, Abingdon, UK)应用于右颈动脉外表面30分钟。之后，纸被移除，容器被留下原位60分钟，以启用血栓形成。在另一组实验中，IL-17A（100 μ在施加FECL之前，在容器上施加浸泡滤纸，浸泡滤纸，浸泡滤纸30分钟_3.(5%)，如上所述。60分钟结束时，切除一块约2厘米长的右颈动脉(及其对侧)并称重。血栓大小通过治疗血管和对侧血管之间的重量差异来评估。

2.2。形态分析

在另一组动物中，如上所述进行实验，并切除各处理过的容器的区段（2cm），在盐水中冲洗以除去血液过量，然后在福尔马林中固定（4％v / v; carlo erba，意大利）24小时。将样品加工并嵌入石蜡中。部分（10. μ然后用苏木精和伊红（Carlo Erba，意大利）染色以进行形态学分析。在所有情况下，使用标准光学显微镜（×5和×10物镜）对每只动物至少5个切片进行分析。图像由徕卡DFC320摄像机（意大利米兰徕卡）拍摄使用徕卡应用套件软件V2.4.0连接到徕卡DM RB显微镜。

２．３．CD39的Western Blot分析

在部分实验中，如前所述，局部使用IL-17A或其载体(HCl 4mm)治疗30分钟后，通过Western blot分析评估颈动脉切片匀浆中CD39的表达。为此，在局部处理后，颈动脉立即在液氮中冷冻，然后保存在−80°C。在分析当天，用液氮将组织均质在以下的裂解缓冲液中:Tris-HCl pH 7.5, 50 mM;氯化钠,150毫米;原钒酸钠，1mm;β甘油磷酸盐,20毫米;EDTA, 2毫米;PMSF 1毫米;亮抑酶肽,5μg/mL；抑肽酶，5 μg / mL;胃酶抑素、5μg/mL。通过Bio-Rad蛋白质分析试剂盒（意大利Bio-Rad）测定蛋白质浓度。蛋白质样品（35 μg)在8%聚丙烯酰胺SDS凝胶上进行电泳，然后转移到硝化纤维素转移膜上(德国，proan, Schleicher & Schuell)。用脱脂奶粉(5% wt/v)在添加0.1% (v/v) Tween 20 (PBS- t)的PBS中室温孵育1小时，然后用山羊单克隆抗cd39抗体(a -16, Santa Cruz, CA)(稀释倍数:200)孵育，在4°C过夜。依次洗涤膜，然后与与辣根过氧化物酶结合的二抗，抗山羊IgG-HRP(稀释1:20 00，丹麦Dako)在室温下孵育2小时。使用增强化学发光(ECL)检测试剂盒和Image Quant 400 GE Healthcare软件(GE Healthcare, Italy)检测蛋白条带。采用GS 800成像密度计软件(Biorad, Italy)定量蛋白质条带。

2.4.酶测定

在颈动脉切片匀浆上，采用Saucedo等人所描述的改进方法评估ADP水解活性[25].用于测定ADPase活性的反应介质包含120 毫米氯化钠，5.0 嗯 KCl，60 葡萄糖，5 嗯 氯化钙₂，及50 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.5，最终体积为200 μL.样本量为20 μL（10. μ将G蛋白质加入到反应介质中并在37℃下预孵育10分钟。然后通过在终浓度为2mM的浓度下加入酶反应，并在37℃下孵育40分钟。通过添加去离子H来进行对照₂O添加到每个样品中，而不是ADP。通过添加200%的ADP停止反应 μ三氯乙酸(TCA) 10%。样品3000rpm × 10 min离心。作为ADPase活性的测量，释放的无机磷酸盐(Pi)通过比色法Sensolyte测定试剂盒(AnaSpec)进行量化，并以释放的nmol Pi表达每μ蛋白质的G [26]．

2.5. 统计分析

数据以平均值±S.E.表示，并通过单因素方差分析（ANOVA）进行分析，然后进行Bonferroni多重比较检验，或通过非配对双尾Student检验进行分析T.以及在适当的时候。在某些情况下，一个样本T.-测试用于评估假设零值的显著性被认为是重要的。

3.结果与讨论

血小板反应性增强、内皮功能障碍和动脉粥样硬化斑块不稳定性是全身免疫炎症性疾病患者的共同特征，可能是这些患者心血管风险增加的原因[1那5.那23]．然而，哪些因素主要负责促进血管发生的紊乱，并且慢性自身免疫疾病中的心血管事件仍然未知。最近，IL-17A批判性地参与自身免疫性疾病的发病机制，已被要求作为参与内皮功能障碍和增加心血管风险的可能候选者[19那20.]．在这些基础上，我们的工作旨在评估体内IL-17A在氯化铁诱导动脉血栓形成模型中的作用。我们发现了FeCl的应用_3.（5%）引起血管内血栓 镁(;一个示例T.-test)其质量显著增加(毫克;。颈动脉经IL-17A预处理(100μg/mL)，在FeCl前30分钟_3.应用程序。IL-17A单独应用于大鼠颈动脉外表面产生本质上小的血管内血栓(毫克;;)而在车辆暴露后观察到无显著影响(毫克;） （数字1）.

图1

_{3. 3.} μ 原位 μ _{3. 2} ^## _3. IL-17A对FECL诱导的血栓肿块的影响应用于大鼠颈动脉。浸有FeCl的滤纸（5％）或重组小鼠IL-17A（100 g/mL）涂抹于右侧颈动脉外表面，持续30分钟；之后，纸张被移除，容器被留下6.。0分钟，以启用血栓形成。在另一组实验中，IL-17A（100 g/mL）或载体（盐酸，4 在施用FeCl之前，将浸泡过的滤纸涂抹在容器上30分钟(5%)。60分钟结束时，切除右侧颈动脉和对侧的一块约2厘米长的颈动脉并称重。血栓大小通过治疗血管和对侧血管之间的重量差异来评估。所有对照只应用载具(HO或HCl 4毫米)。与FeCl那＊＊＊与IL-17A和°与载体（单因素方差分析，然后进行Bonferroni试验；-10)。

血管切片的形态学分析表明，对照组颈动脉切片的管腔表面被连续的内皮细胞覆盖。此外，血管腔没有聚集物（图1）2（a））.有趣的是，从IL-17A获得的部分+FeCl_3.与IL-17A相比显示闭塞性血栓（图2（b）)或FeCl_3.（数字2（c）)此外，内皮细胞受损，血管壁厚度极度减少（图2（d））.

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图2

μ + _{3. 3.} 显微照片显示局部治疗后的颈动脉苏木精和伊红组织学横切面，如方法切片所述(放大×50)。(a)车辆(HCl 4毫米);(b) IL-17A (100g / mL);(c)车辆(盐酸4mm)FeCl（5%）；和（d）IL-17A和FeCl。

众所周知，动脉血栓形成主要是由血小板粘附和损坏容器的活化引起的[21].激活后，内皮失去其抗血栓特性，血小板可能被激活[2]．FeCl的模型_3.-已证明诱导的血栓形成涉及血小板和几种止血成分[27]，包括TF [28]．

CD39/ATP二磷酸水解酶（ATPDase）主要通过将ATP和ADP转化为单磷酸形式（AMP）在血管内皮细胞上表达它是血管止血和血栓形成的关键调节剂。活化内皮细胞上CD39的缺失导致血小板隔离和TF上调，这是血栓形成的关键事件[29]尽管如此，CD39也可能对心肌缺血再灌注损伤提供保护，因为它促进ADP降解，从而与CD73（外-5′-核苷酸酶）一起促进代表心血管保护分子的腺苷积累[30.]结果表明，缺乏CD39的小鼠具有血栓前状态的血管特征，其特征是纤维蛋白沉积在多个血管床中[31]．最近，有研究证实IL-17A可降低人内皮细胞中CD39 mRNA的表达体外同时，它增加了TF的表达[20.]在此基础上，考虑到CD39在维持内皮抗血栓特性方面起着关键作用，我们分析了CD39在大鼠颈动脉的表达及其ADP水解活性体内IL-17A。结果显示，在颈动脉表面应用IL-17A后，CD39的表达与应用唯一的载体(HCl, 4 mM)相比显著降低(图)3.)同时，与载体相比，经IL17A处理的胡萝卜素与ADP孵育后，其无机磷酸盐生成量减少，证明ADP水解活性也降低（图4.）.因此，通过CD39的下调，IL-17A可能有助于启动血管达到最低FeCl的效果_3.专注。

(一)

(b)

(一)
(b)

图3

β T. (a) Western blot分析转染载体或IL-17A处理30分钟后大鼠颈动脉CD39表达的代表性结果。(b) Western blot密度分析;光密度归一化肌动蛋白。＊与车辆（学生的-试验；）.

图4

T. 定量测定经载体或IL-17A处理的大鼠颈动脉匀浆产生的无机磷酸盐(Pi)。产生的Pi作为ADP水解活性的测量来评估(详情，见方法部分)。＊与车辆（学生的-试验；）.

我们的假设与IL-17A没有引起的观察相一致本质上动脉内闭塞性血栓，但它会诱导那些特殊于癌细胞状况的内皮特征。实际上，由于CD39对内皮细胞下调的缺乏ADP水解不会是血栓发生的刺激，但最有可能用于血管损伤部位的血小板骨料的增加，这将有助于血栓形成剂的作用。

4.结论

我们的结果首次提供了体内IL-17A的普形细胞效应的证据可能与血管系统中CD39表达和活性的下调相关。因此，我们以前证明的结果体外这种细胞因子对人和小鼠血小板的影响[22]在本研究中，我们认为这种细胞因子可能是止血和炎症之间的一个重要分子。有趣的是，IL-17A促血栓形成作用的机制基础需要进一步研究。

利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项工作得到了意大利研究部(MIUR;2008 p9mr7y主要2008)。作者要感谢Antonio Baiano博士，Giovanni Esposito先生和Angelo Russo先生对动物的照顾和技术援助。

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