1。介绍
增加实验和临床证据表明,血栓和动脉粥样硬化可能与炎症反应密切相关(
1]。炎症减少天然抗凝的活动机制,启动凝血和纤溶系统损害。事实上,促炎的分子参与的激活和白细胞迁移到网站血管损伤和炎症和可能导致释放凝血因子激活细胞,反过来,可能激活血小板和其他细胞类型(
2,
3]。
最近,人们一直十分重视推动止血剂障碍受试者中观察到影响免疫慢性炎症,如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS),炎症性肠病(IBD),可能代表增加心血管风险的原因中观察到这些病态
4- - - - - -
6]。多种因素可能牵涉其中。循环细胞因子和招募炎症细胞可能导致内皮细胞激活和障碍主要对凝血状态(
7,
8]。
Interleukin-17A (IL-17A)是最广泛研究IL-17细胞因子家族的成员。主要由辅助(Th) -17的淋巴细胞,并通过自然杀伤T (NKT)细胞,
γ
δT细胞(
γ
δ-17),细胞毒性CD8+T细胞(Tc17)和中性粒细胞
9- - - - - -
11]。IL-17A是促炎细胞因子(
12),高度在慢性炎性疾病患者,如风湿性关节炎、女士,炎症性肠病(
13- - - - - -
15]。IL-17A还参与动脉粥样硬化(
16];此外,在人类之间的正相关关系也被发现循环IL-17A水平和急性冠脉综合征(
17,
18]。这些发现表明,IL-17A可能发挥作用的心血管风险与系统性免疫紊乱有关。最近,在尝试找到一个炎症标记物与内皮功能障碍之间的关系,马德尔et al。
19]表明IL-17A是一种炎症标志物,可能与血管功能受损的标志呈正相关科目由风湿性关节炎的影响。与此一致的是,它也表明,在HUVEC, IL-17A减少CD39 mRNA表达与肿瘤坏死因子作用
α(肿瘤坏死因子
α),它能够诱导组织因子(TF)表达和表达下调thrombomodulin表达式(
20.]。众所周知,动脉血栓形成主要是由于血小板粘附在受损的血管和激活(
21]。激活后,内皮失去抗血栓形成的属性和血小板会激活(
2]。因此,IL-17A可以激活内皮细胞对凝血状态;然而,到目前为止没有
在活的有机体内这方面的证据。我们最近表明,腺苷IL-17A增加人类和小鼠血小板反应′二磷酸(ADP)。
在体外这种效应与血小板表面上增加P-selectin博览会(
22]。由于血小板主要参与动脉血栓形成(
21)和增加血小板反应性被发现与一些系统性免疫障碍有关,还涉及IL-17A [
6,
7,
23),在这里,我们试图调查IL-17A的效果
在活的有机体内动脉血栓形成。
2。材料和方法
2.1。铁Chloride-Induced血栓形成
雄性Wistar鼠(300 - 350克;哈伦Nossan, Correzzana、MI、意大利)是用于所有实验。标准条件下饲养的动物提供食物
随意和维护在12 h / 12 h光/暗周期
22
±
1
°C。所有的
在活的有机体内程序都按照意大利立法法令(D.L.) 116号1月27日,1992年,欧洲共同体委员会指令和同事的指导方针的11月24日1986 (8676097 ecc)。所有的努力都是减少动物痛苦和减少他们的数量。
老鼠与氨基甲酸乙酯麻醉(wt / v 10%;10毫升/公斤ip。),放置在手术台上。动脉血栓被FeCl诱导3应用程序到正确的颈动脉的表面,所述的Kurz et al。
24]。局部应用IL-17A也是评估的影响。总之,手术后,一块滤纸(绘画纸n°1, 3×5毫米)浸泡在10
μL FeCl的解决方案3(5%)或重组鼠标IL-17A (100
μ克/毫升盐酸4 mM,研发系统,阿宾顿、英国)应用到外部表面对颈动脉30分钟。后来被和船了
原位60分钟,使血栓形成。在另一组实验中,一个IL-17A (100
μ克/毫升)或车辆(HCl 4毫米),浸泡滤纸是应用于船舶应用FeCl前30分钟3(5%),如上所述。60分钟的尽头,一块约2厘米的长度对颈动脉切除和称重(及其侧)。血栓大小评估治疗血管之间的重量上的差异及其侧。
2.2。形态分析
在另一组动物,实验进行如上所述,一段(2厘米)的每个治疗血管切除,在生理盐水冲洗去除血液过度,然后浸泡在福尔马林溶液(4% v / v;卡洛Erba、意大利)24小时。在石蜡样本处理和嵌入式。部分(10
μ米厚的)被苏木精和伊红染色(意大利)卡洛•Erba为了形态学分析。在所有情况下,至少5部分/动物进行分析通过使用一个标准的光学显微镜(×5×10的目标)。图像是由徕卡DFC320摄像机(徕卡、米兰、意大利)连接到一个徕卡DM使用徕卡应用程序套件软件V2.4.0 RB显微镜。
2.3。免疫印迹分析CD39
在子集的实验中,与IL-17A或局部治疗后的车辆(HCl 4毫米)30分钟,如上所述,CD39表达评估颈动脉部分匀浆免疫印迹分析。为此,当地治疗后,颈动脉被立即在液态氮冷冻储存在−80°C。当天的分析、组织均质使用液态氮在接下来的裂解缓冲:Tris-HCl pH值7.5,50 mM;氯化钠,150毫米;原钒酸钠,1毫米;
β甘油磷酸盐,20毫米;EDTA, 2毫米;PMSF 1毫米;亮抑酶肽,5
μg / mL;抑肽酶5
μg / mL;胃酶抑素、5
μ克/毫升。蛋白质浓度是由Bio-Rad化验设备(Bio-Rad、意大利)。蛋白质样品(35
μg)受到8% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移到一个硝基转移膜(Protran, Schleicher & Schuell,德国)。细胞膜被孵化饱和与脱脂奶粉(5% wt / v)在PBS补充0.1% (v / v)渐变20 (PBS-T) 1 h在室温下,然后用一只山羊单克隆抗体anti-CD39孵化(16,圣克鲁斯,CA)(稀释1:200),在一夜之间在4°C。先后,膜清洗,然后用二次孵化抗体结合辣根过氧化物酶,抗体IgG-HRP(稀释1:2000年,Dako丹麦),在室温下2小时。蛋白质乐队使用增强化学发光检测(ECL)检测设备和图像定量400通用电气医疗集团软件(通用电气医疗集团、意大利)。蛋白质带量化使用GS 800成像密度计软件(Biorad、意大利)。
2.4。酶测定
颈上节匀浆,ADP水解活动评估使用的修改方法描述Saucedo et al。
25]。反应介质用于测定ADPase活动包含120毫米氯化钠,氯化钾5.0毫米,60毫米葡萄糖,CaCl 5毫米2,50 mM Tris-HCl缓冲区,pH值7.5在200年最后一卷
μ20 l .样本的体积
μL (10
μg蛋白)添加到反应介质和preincubated 10分钟37°C。酶反应是开始的ADP的最终浓度2毫米和孵化了40分钟37°C。通过添加去离子的控制进行H2O为每个样本,而不是ADP。在200年的反应是停了
μL(三氯乙酸(TCA) 10%。样本然后离心机在3000 rpm×10分钟。作为衡量ADPase活动,无机磷酸盐(Pi)发布由比色测定量化Sensolyte分析工具包(AnaSpec)和表达为nmolπ释放
每
μg蛋白(
26]。
2.5。统计分析
数据表示为均值±S.E.和分析单向方差分析(方差分析),其次是Bonferroni测试多个比较,或未配对的双尾的学生
t以及在适当的时候。在某些情况下,一个示例
t以及用于评估意义对假想的零价值。的值
P
<
0.05
被认为是重要的。
3所示。结果与讨论
血小板反应性增加,内皮功能障碍和动脉粥样硬化斑块的不稳定是常见的科目的特点受到系统性免疫炎性疾病和可能代表增加心血管风险的原因中观察到这些患者(
1,
5,
23]。然而,主要负责哪些因素诱发止血干扰和心血管事件在慢性自身免疫性疾病仍然是未知的。最近,IL-17A,极度参与自身免疫性疾病的发病机制,一直视为一种可能的候选人参与内皮功能障碍和心血管疾病的风险增加
19,
20.]。在此基础上,我们的工作旨在评估
在活的有机体内IL-17A的影响在一个铁chloride-induced动脉血栓模型。我们发现FeCl的应用3(5%)的血管内血栓引起的
1.10
±
0.23
毫克(
n
=
9
;
P
<
0.01
一个示例
t以及)的质量显著增加(
1.91
±
0.23
毫克;
n
=
8
。
P
<
0.01
)在颈动脉使用IL-17A (100
μg / mL), FeCl前30分钟3应用程序。应用IL-17A独自在大鼠颈动脉的外部表面生成
本身一个小血管内血栓(
0.42
±
0.17
毫克;
n
=
10
;
P
<
0.05
汽车暴露(后)而无意义的效果观察
0.1
±
0.05
毫克;
n
=
7
)(图
1)。
大规模由FeCl IL-17A对血栓的影响3应用大鼠颈动脉。一个过滤器纸浸泡在FeCl3(5%)或重组鼠标IL-17A (100
μg / mL)的外表面上应用正确的颈动脉,30分钟;后来被和船了
原位60分钟,使血栓形成。在另一组实验中,一个IL-17A (100
μ克/毫升)或车辆(HCl 4毫米),浸泡滤纸应用到船舶应用FeCl前30分钟3(5%)。60分钟的尽头,一块约2厘米的右颈动脉和侧切除和体重。血栓大小评估治疗血管之间的重量上的差异及其侧。所有控件进行运用车辆(H2O或盐酸4毫米)。# #
P
<
0.01
与FeCl3,* * *
P
<
0.001
与IL-17A,°
P
<
0.05
与车辆(一维方差分析Bonferroni紧随其后的测试;
n
=
8
-10)。
![]()
船部分的形态分析证明,颈动脉的支架表面从控制部分是由一个连续内皮。此外,血管腔并不是总量(图的特征
2(一个))。有趣的是,从IL-17A获得的部分
+FeCl3显示一个使血栓闭塞而IL-17A(图
2 (b))或FeCl3(图
2 (c))治疗颈动脉。此外,内皮受损,出现血管壁厚度减少(图
2 (d))。
显微照片显示苏木精和伊红组织学横截面的颈动脉后当地治疗方法部分中描述(放大×50)。(一)车辆(HCl 4毫米);(b) IL-17A (100
μg / mL);(c)车辆(HCl 4毫米)
+FeCl3(5%);和(d) IL-17A FeCl3。
![]()
![]()
![]()
![]()
众所周知,动脉血栓形成主要是由于血小板粘附和激活受损船(
21]。激活后,内皮失去抗血栓形成的属性和血小板会激活(
2]。FeCl模型3全身血栓可以包括血小板和止血的几个组件
27),包括特遣部队(
28]。
CD39 / ATP diphosphohydrolase (ATPDase)对血管内皮细胞在很大程度上是表达和转换ATP和ADP一磷酸形式(AMP)它代表的关键调制器血管止血和血栓形成。CD39在激活内皮细胞的缺失导致血小板封存和TF upregulation,血栓形成的关键事件(
29日]。尽管如此,CD39也可能提供保护心肌缺血再灌注损伤,因为它促进ADP退化,从而支持,配合CD73 (ecto-5′核苷酸酶)、腺苷积累表示心血管保护分子(
30.]。结果表明,小鼠缺乏CD39 prethrombotic状态的血管特征,表现为纤维蛋白沉积在几个血管床(
31日]。最近,它已经表明,IL-17A减少CD39 mRNA表达人类内皮细胞
在体外同时,它增加TF表达(
20.]。在此基础上,考虑到CD39起着至关重要的作用在维持内皮细胞抗血栓形成的特性,分析了其表达和ADP水解活动后对大鼠颈动脉
在活的有机体内IL-17A。应用程序后的结果表明,颈动脉表面IL-17A CD39的表达明显减少而唯一的应用车辆(HCl 4毫米)(图
3)。与此同时,ADP水解活动也减少了减少无机磷酸盐生产,与ADP孵化后,从IL17A治疗颈动脉相比,车辆(图
4)。CD39,差别因此,通过对这些IL-17A可能导致启动的船FeCl最小的影响3浓度。
(a)代表结果CD39表达的免疫印迹分析大鼠颈动脉与车辆或IL-17A治疗30分钟。(b)光密度分析西方的污点;(光密度)规范化
β肌动蛋白。*
P
<
0.05
与车辆(学生的
t以及;
n
=
3
)。
![]()
![]()
量化生产的无机磷酸盐(Pi)大鼠颈动脉匀浆处理车辆或IL-17A。π生产评估是衡量ADP水解活动(详情,请参阅方法部分)。*
P
<
0.05
与车辆(学生的
t以及;
n
=
3
)。
![]()
我们的假设,将符合观察IL-17A不会引起
本身一个动脉内的闭塞性血栓,但它会诱发这些内皮功能特殊的凝血状态。事实上,缺乏水解ADP由于在内皮细胞不会差别CD39对这些刺激的血栓形成,但最有可能的是,增加血小板的聚集在血管损伤的网站,这将促进血栓性剂的效果。