文摘
介绍。脂多糖内毒素(LPS)负责脓毒性休克和multiorgan失败,但与低剂量的预处理大鼠有限合伙人减少胰腺急性损伤。目的。我们调查的影响,内毒素诱导的早期生命toll样受体4 (TLR4),热休克蛋白60 (HSP60)和proapoptotic伯灵顿,caspase-9和3或凋亡bcl - 2蛋白表达在成年动物的胰腺腺泡的细胞。材料和方法。新生大鼠(25克)注射内毒素(大肠杆菌连续5天)。两个月后,胰腺腺泡的细胞被隔绝所有动物和受到caerulein刺激组(米)。蛋白表达是评估采用免疫印迹。检测细胞凋亡的DNA碎片梯试验。结果。新生大鼠的预处理与有限合伙人增加TLR4 Caspase-9和3水平,但未能影响基底HSP60的表情,伯灵顿,bcl - 2。随后caerulein刺激增加TLR4、bcl - 2,和还存在,但减少HSP60在胰腺腺泡的细胞和伯灵顿蛋白质。TLR4内毒素剂量依赖性增加,伯灵顿,HSP60,还存在两个蛋白质信号在胰腺腺泡,进一步抑制凋亡bcl - 2。结论。内毒素促进HSP60的感应通过TLR4在婴儿老鼠和参与LPS-dependent胰腺组织防止急性损伤。
1。介绍
内毒素脂多糖(LPS),这是一个组成部分革兰氏阴性细菌的外膜,起着非常重要的作用在感染性休克的发病机制1]。有限合伙人是触发的关键刺激巨噬细胞炎症级联通过toll样受体4 (TLR4)。有限合伙人也被确认为一个配体对TLR4和参与脓毒症的病理生理学综合症(2- - - - - -4]。已经提出的几个途径内毒素信号转导的细胞内毒素刺激。
toll样受体(通常),最初的同系物果蝇人数,属于interleukin-1受体超家族,5]。通常是最重要的家庭模式识别受体(PRRs) (6,7]。一些通常的存在使先天免疫系统识别病原体的不同群体,而启动适当的和不同的免疫反应,根据其分子模式(pamp) [8]。TLR4表达蛋白在细胞表面的受体变得革兰氏阴性细菌细胞膜组件,有限合伙人。刺激TLR4的有限合伙人是一个复杂的过程,其中包括几个分子的参与LPS结合蛋白(LBP), CD14、MD-2 [9,10]。TLR4可能参与诱导保护性和有害的对组织的影响。TLR4旁边,TLR4的其他配体,如透明质酸,诱发免疫反应启动上皮细胞修复,但在某些情况下TLR4参与内源性危险信号的传递动员高机动组盒1蛋白质或针对游离脂肪酸会导致组织损伤(11- - - - - -13]。一些报道指出TRLR4参与反应的可能性,热休克蛋白60 (HSP60)作为内源性配体TLR4 [14]。
HSP60参与蛋白质折叠、装配、拆卸、退化在正常情况下。类似于其他休克蛋白,这种蛋白质在细胞应力增加一个自适应保护策略15]。在过去十年里,调查人员发现,HSP60和胰酶共享一个公共的位置在胰腺腺泡的细胞,互动亲密(16,17]。此外,胰酶的分布特征、HSP60显示越来越梯度沿胰腺分泌通路搭配的粗面内质网和高尔基体发酵菌颗粒腺泡的细胞(16]。增加HSP60的转录和生产保护行动已经在胰腺炎(建议18- - - - - -20.]。
急性胰腺炎(AP)是一种新兴疾病常见的临床实践,但其复杂的发病机理仍然是难以理解的。科学家一致,美联社包括一连串的事件,和许多报告表明,其最初的一步是胰蛋白酶原的激活在胰腺腺泡细胞,导致损害引起的激活胰酶(21,22]。酶激活异常的机制,许多理论被认为是,例如:钙超载或组织蛋白酶B激活(23,24]。一个新的理论主张HSP60扮演着一个很重要的角色,保护胰腺组织免受损坏和故障或削弱HSP60效果在生理条件下负责初发酵菌激活AP (15,24]。
它已经表明,低剂量的内毒素(LPS)可以防止胰腺caerulein-induced胰腺炎(CIP) [25- - - - - -28]。内毒素的乳儿老鼠减弱急性胰腺炎和外分泌功能的障碍在体外和在活的有机体内在成人年龄模型(29日- - - - - -32]。
本研究的目的是调查在成年动物的胰腺腺泡的细胞分离,放弃婴儿的影响大鼠内毒素TLR4、HSP60和pro-apoptotic伯灵顿,caspase-9和3或凋亡bcl - 2蛋白表达。
2。材料和方法
研究进行雄性Wistar鼠(重:新生儿25克;成人:170 - 200克)。动物被关在笼子里在标准条件下,商业颗粒食物,水随意,在室温下12 h光明与黑暗周期。
2.1。试剂
脂多糖从Sigma-Aldrich有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)和caerulein(佐藤)法玛西亚GmbH,埃朗根,德国,被用于实验。
2.2。试验协议
实验协议一般被分为两个部分:在活的有机体内和在体外研究。
2.3。在活的有机体内实验
新生大鼠体重25克被分为五个主要组:(1)对照组:老鼠注射了200μL汽车生理盐水腹腔内(i.p),一天一次,连续5天。(2)有限合伙人(大肠杆菌)组:老鼠处理有限合伙人在200年解散μL汽车盐水,和动物受到ip每天注射一次,连续5天。这老鼠分成三个独立的子组是一剂LPS处理:
2.1组:5毫克/公斤/天×5天(总剂量25毫克/公斤);
2.2组:10毫克/公斤/天×5天(总剂量50毫克/公斤);
2.3组:15毫克/公斤/天×5天(总剂量75毫克/公斤)。
每个部分的研究包括几个实验的老鼠,6 - 8老鼠在每一个组。
2.4。在体外实验
两个月后两车的注射生理盐水或有限合伙人的解决方案,在成年动物的年龄,胰腺腺泡的细胞被胶原酶消化分离(如前所述33,34),受到caerulein(10浓度的增加−12,10−10或10−8米)。这些细胞被孵化的测试物质:0、0.5、1、3、5、7 h。随后,10−8M caerulein浓度被认为是最有效的(数据没有显示)和选择进行进一步的实验。时间进程实验表明,5 h孵化时间是最有效的,已经挑出了所有进一步研究(数据未显示)的一部分。最后所有的实验都重复三次。这里给出的结果从最具代表性的实验。
本研究所有实验程序中执行盖隆大学动物实验伦理委员会批准。
2.5。免疫印迹
其它地方描述的全细胞提取准备(35]。等于负载的蛋白质在每个样本评估使用QantiPro BCA分析工具包(σ,美国)。蛋白质与蛋白质印迹样品样本煮SDS-polyacrylamide凝胶缓冲和加载12%。电泳和转移的样本后,PVDF膜(美国BioRad)被阻断缓冲区(PBS) 5%的脱脂奶粉1 h在室温。阻塞过程又与1 h接触主要抗体稀释1:1000和二级抗体稀释1:1000阻碍缓冲区。
每个抗体探测膜后洗了三次,持续15分钟。TBST缓冲区(0,1米三pH值8 0;1、5 M氯化钠;0,5% tritonx - 100)。膜结合蛋白的检测是使用BM执行化学发光吸水物质(勃,曼海姆,德国)。这些墨迹被探测和GAPDH加载文档平等蛋白质。所有在连续4的实验结果,提出代表观察到的现象。下列事项中使用免疫印迹反应是购自圣克鲁斯生物技术(Santa Cruz):鼠单克隆抗体anti-HSP60免疫球蛋白1(sc - 136291),鼠标单克隆免疫球蛋白anti-caspase 91(sc - 81663),鼠标单克隆anti-Bcl-2免疫球蛋白1(sc - 7382),鼠标单克隆anti-Bax免疫球蛋白1(sc - 70408),鼠标单克隆anti-GADPH免疫球蛋白1(sc - 137179),山羊多克隆anti-caspase 3免疫球蛋白(sc - 1225),兔多克隆anti-TLR4免疫球蛋白(sc - 30002),兔抗体免疫球蛋白合(sc - 2768),和山羊anti-mouse免疫球蛋白1合(sc - 2060),山羊anti-rabbit IgG-HRP (sc - 2030)。
2.6。DNA碎片
分析DNA碎片由于诱导细胞凋亡,细胞(5×106/样本)lyzed有150μL低渗的裂解缓冲(依他酸10毫米,特里同x - 100 0.5%, Tris-HCl, pH值7.4),持续15分钟。在冰和沉淀有2.5%聚乙二醇和1 M氯化钠,持续15分钟。在4°C。在13000×g离心后10分钟。在室温下,上层清液处理蛋白酶K (0.3 g / L) 37°C 1 h和异丙醇沉淀在20°C。离心机颗粒溶解在10μL (Tris-EDTA (pH值7.6)和分析采用含溴化乙锭1.5%琼脂糖凝胶电泳。DNA模式可视化在紫外线照射下。
2.7。统计分析
所有的实验都在一式三份。结果表示为±SEM手段。统计分析采用方差分析和双向方差分析测试在适当的时候。差异与被认为是重要的。
3所示。结果
研究脂多糖的影响(大肠杆菌)和/或Caerulein TLR4、bcl - 2、Bax、HSP60、Caspase-9, Caspase-3蛋白质水平和PancreaticAcinar细胞凋亡。
的toll样受体4 (TLR4)蛋白在胰腺腺泡的细胞在成年鼠在所有调查样本(数据决定1和2)。TLR4的比例/ GAPDH蛋白水平在对照组和明显的剂量依赖性增加组大鼠在生命的早期治疗与5、10或15毫克/公斤/天剂量的有限合伙人连续5天。蛋白质的丰度最高的细胞样本中,检测出从动物LPS处理剂量的10年或15毫克/公斤/天和TLR4的比例/ GAPDH达成和分别(图1)。
应用caerulein (10−8米)的腺泡细胞显著调节TLR4蛋白质水平,与对照组相比,TLR4 / GAPDH的比率经过5个小时的潜伏期(图2)。
在新生大鼠内毒素诱导增加剂量的有限合伙人(5、10或15毫克/公斤/天×5天)导致了重大和TLR4蛋白质含量的增加存在剂量依赖的相关性与caerulein腺泡孵化(10−8M)和集团受到caerulein孤单。最显著增加细胞中检测出孤立从老鼠LPS处理剂量的10年或15毫克/公斤/天。TLR4的比例/ GAPDH扩展到这些组和分别(图2)。
凋亡的线粒体分子bcl - 2的所有调查样本中,检测出的胰腺腺泡的细胞从成年动物(获得数据3和4)。bcl - 2 / GAPDH蛋白质比对照组和明显的剂量依赖性的方式减少组大鼠与LPS无治疗剂量的15毫克/公斤/天×5天。bcl - 2 / GAPDH达到的比例(图3)。
应用caerulein (10−8米)的腺泡细胞获得控制老鼠导致重大upregulation bcl - 2蛋白水平,而控制,未经处理的caerulein文化。bcl - 2 / GAPDH的比率经过5个小时的潜伏期(图4)。
内毒素的吸收剂量的增加引起的动物,有限合伙人(5、10或15毫克/公斤/天×5天)显著和剂量依赖性的方式表达下调bcl - 2蛋白水平在胰腺腺泡孵化caerulein (10−8米)相比单独caerulein-treated组。最强的信号检测腺泡了从动物LPS处理剂量的10年或15毫克/公斤/天。这些团体的比率bcl - 2 / GAPDH达成和分别(图4)。
proapoptotic线粒体伯灵顿蛋白水平在胰腺腺泡的细胞从成年动物获得的所有调查样本中,检测出(数字5和6)。伯灵顿的比例/ GAPDH蛋白质水平在对照组无治疗组中并没有改变和增加剂量的有限合伙人5、10或15毫克/公斤/天×5天(图5)。
胰腺腺泡细胞的孵化与caerulein (10−8米)引起的伯灵顿蛋白水平明显降低,与caerulein比未经处理的控制。伯灵顿的比例/ GAPDH蛋白质组经过5个小时的潜伏期(图6)。
新生大鼠由于增加剂量的内毒素LPS(5、10或15毫克/公斤/天×5天)造成重大和伯灵顿蛋白质水平的增加存在剂量依赖的相关性与caerulein腺泡孵化(10−8米)。最强的信号检测动物处理10或15毫克/公斤/天的有限合伙人。在这些团体伯灵顿的比率/ GAPDH达成和分别(图6)。DNA碎片的梯试验获得的数据与结果apoptosis-related蛋白质的分析,揭示了最强的DNA模式凋亡损伤胰腺腺泡的文化隔绝预先处理动物最高剂量的有限合伙人和受到caerulein (10−8(图)刺激7巷3)。在胰腺腺泡的控制文化和那些受到caerulein刺激没有上述预处理与LPS apoptosis-related DNA损伤模式观察(图7通道1、2)。
HSP60蛋白水平检测胰腺腺泡细胞的所有检查样品从成年动物(获得数据8和9)。HSP60的比例/ GAPDH蛋白质水平在对照组组治疗阶段,未能改变通过增加剂量LPS 5、10或15毫克/公斤/天×5天(图8)。
caerulein (10−8M)胰腺腺泡的细胞培养获得与有限合伙人未经处理的动物明显HSP60蛋白水平降低,与对照组相比。HSP60 / GAPDH的比率经过5个小时的潜伏期(图9)。
相反,内毒素在乳儿产生显著增加老鼠HSP60蛋白水平检测腺泡文化孵化与caerulein (10−8米),而细胞受到caerulein(图9)。最明显的蛋白质水平检测细胞培养与有限合伙人来自动物的治疗剂量的10年或15毫克/公斤。在这些团体HSP60 / GAPDH比率的明显增加和分别是注意到(图9)。
proapoptotic发起者caspase-9蛋白质水平没有发现在胰腺腺泡的细胞从成年动物在未经处理的控制文化(获得数据10和11)。新生大鼠由于增加剂量的内毒素LPS(5、10或15毫克/公斤/天×5天)是caspase-9表达式的刺激因素。caspase-9 / GAPDH达到的比例(图10)。
胰腺腺泡细胞的孵化与caerulein (10−8米)引起caspase-9蛋白质水平的显著增加。caspase-9 / GAPDH蛋白质的比例在这个组经过5个小时的潜伏期(图11)。
前通过增加剂量的内毒素诱发有限合伙人(5、10或15毫克/公斤/天×5天)标志和剂量依赖性upregulation caspase-9蛋白质水平引起的胰腺腺泡孵化与caerulein (10−8M)相比caerulein-treated组单独与最高的表达式值检测腺泡文化从动物LPS处理剂量的10年或15毫克/公斤/天。这些团体的比率caspase-9 / GAPDH达成和分别(图11)。
Caspase-3蛋白中没有检测到胰腺腺泡的细胞从成年动物获得控制样本(数据12和13)。我们发现高水平caspase-3蛋白质的腺泡隔离动物受到阶段由于增加剂量的内毒素LPS(5、10或15毫克/公斤/天×5天)的比率caspase-3 / GAPDH达到(图12)。
应用caerulein (10−8米)的腺泡细胞显著调节pro-apoptotic caspase-3蛋白质水平。的比率caspase-3 / GAPDH是水平的经过5个小时的潜伏期(图13)。
有限合伙人之前(5、10或15毫克/公斤/天×5天)内毒素导致显著和caspase-3蛋白质的增加存在剂量依赖的相关性水平与caerulein腺泡文化孵化(10−8米)相比单独caerulein-treated组。最强的信号检测细胞培养获得的老鼠接受剂量LPS的10年或15毫克/公斤/天。caspase-3 / GAPDH这些群体扩展的比率和分别(图13)。
4所示。讨论
急性胰腺炎(AP)是一个胰腺非特异性炎症过程带来许多病理机制的激活胰管梗阻等,腺泡的oversecretion,和胰腺缺血21- - - - - -24]。正如上面的结果处理先天免疫系统参与炎症级联的发展。通常toll样受体触发这个反应受到怀疑。目前认为,通常扮演着重要的角色在内源性或外源性抗原的识别和信号转导的启动炎症反应在美联社(36- - - - - -38]。因此,调查的组织表达这些受体胰腺和探索他们的角色澄清美联社的发病机制可能是重要的。
在这项研究中我们将演示的存在对胰腺腺泡细胞TLR4从成年老鼠获得。在正常胰腺TLR4主要定位在上皮(胰管上皮)和内皮组织(动脉、静脉、微血管内皮)[39,40]。这里我们发现,TLR4在胰腺腺泡剂量依赖性增加蛋白质含量的动物,在生命的早期治疗和增加剂量的有限合伙人(大肠杆菌)。自有限合伙人已被确认为TLR4的配体,一般认为通常由免疫抑制调节炎症条件下和表达下调(2- - - - - -4,41- - - - - -43]。在我们的研究中暴露引起的胰腺腺泡细胞caerulein upregulation TLR4蛋白质的水平。据报道,这些受体迅速调节在老鼠caerulein-induced胰腺炎的早期阶段(CIP),可能与诱导细胞凋亡有关通过内在和外在的激活凋亡信号通路(39,43,44]。另一方面,这些受体表达下调的后期阶段严重急性胰腺炎(SAP) [45]。此外,TLR4活动与细胞凋亡的增加(46- - - - - -51]。治疗的腺泡caerulein导致TLR4蛋白质含量的增加存在剂量依赖的相关性在哺乳期大鼠内毒素受到的生活。
腺泡的细胞死亡和实质坏死是一种严重的并发症和死亡率的主要原因在人类胰腺炎(52,53]。在美联社腺泡的坏死和凋亡细胞死亡。实验胰腺炎的严重程度直接与坏死和强度有关,相反,与细胞凋亡53- - - - - -55]。伯灵顿和bcl - 2家族蛋白是细胞凋亡的重要监管机构和他们的比率决定了细胞的敏感性这一过程(56,57]。因此,调解机制的说明腺泡的细胞死亡在美联社对理解很重要的监管疾病和临床意义。
在本研究证明胰腺腺泡细胞凋亡的线粒体bcl - 2分子的剂量依赖性降低在治疗组大鼠在生命的早期最高剂量的有限合伙人。应用的腺泡细胞导致upregulation caerulein bcl - 2和伯灵顿蛋白水平的降低,而控制细胞。美联社bcl - 2可以移植,而伯灵顿信使rna是抑制58- - - - - -60]。我们的研究结果显示,胰腺腺泡的细胞从老鼠在婴儿期进行内毒素,获得caerulein导致剂量依赖性:downregulation bcl - 2凋亡和upregulation pro-apoptotic伯灵顿蛋白质水平,单独caerulein-treated细胞相比,表明细胞凋亡易感性的文化。我们的假设被证实与DNA碎片试验。胰腺腺泡细胞从老鼠受到获得在婴儿期内毒素和刺激在体外与caerulein体现典型的细胞凋亡的DNA损伤模式。
我们发现HSP60蛋白在胰腺腺泡的细胞从成年动物,这证实了以前的观测获得关于HSP60蛋白的存在在胰腺和胰腺癌细胞株;AR42J [30.,31日,61年- - - - - -63年]。这个表达式在胰腺组织中HSP60的减少与长期刺激有限合伙人(64年]。大桥等。14]声称TLR4介导HSP60信号,作为一个公认的内源性配体TLR4的复杂。我们发现,博览会的腺泡细胞文化caerulein HSP60蛋白水平降低,与对照组相比。这是在协议与Rakonczay et al。65年)表明,重复注射CCK的超大的剂量老鼠可以减少胰腺HSP60。我们之前的数据也表明,caerulein刺激能够减少信使rna信号AR42J HSP60的细胞(62年,63年]。有趣的是,在大鼠胰腺caerulein在时间和剂量依赖性的方式增加mRNA但是矛盾的是减少大鼠胰腺HSP60蛋白水平(64年,66年]。内毒素的乳儿老鼠导致HSP60蛋白水平的增加胰腺腺泡的细胞,从成年动物,受到caerulein过度刺激。这是在协议与以前的报告显示胰腺upregulation HSP60 caerulein和有限合伙人(治疗后61年]。另一方面,不同的研究人员显示时间和剂量依赖性增加紧随其后的mRNA矛盾减少蛋白质水平应用后对大鼠胰腺HSP60 caerulein和有限合伙人64年]。我们之前的研究已经表明,内毒素诱导的早期生活限制美联社和减少胰腺外分泌功能以应对caerulein在活的有机体内和在体外在成人年龄模型(29日- - - - - -32]。可能pancreatoprotective效果,如细胞因子调制,超氧化物歧化酶(SOD)活性,并降低胰酶分泌,有关upregulation胰腺腺泡HSP60蛋白水平。有et al。18)和Rakonczay et al。19,20.,65年]表明,增加HSP60转录和生产和/或与细胞因子调制和自由基清除酶(例如,SOD)活动可能是重要的“适应性cytoprotection”美联社,Le Gall Bendayan [16李,et al。17]证明了假设HSP60将协助胰腺分泌蛋白质的正确折叠和组装,也可以防止其自体活动之前分泌,必须重要的质量控制和完整性。
在目前的研究中我们没有发现pro-apoptotic发起者caspase-9和凋亡刽子手caspase-3蛋白表达在胰腺腺泡的细胞从成年老鼠获得。然而Gukovskaya et al。67年)和Mareninova et al。68年)展示了积极的存在caspases-9和3在正常胰腺组织和胰腺腺泡。我们已经表明,在新生大鼠内毒素刺激都还存在从成年动物获得的腺泡的细胞中表达。这是与先前的研究一致表明,有限合伙人治疗caspase-3活动增加胰腺(69年]。我们已经表明,暴露的腺泡细胞caerulein (10−8米)调节pro-apoptotic caspase-9和3蛋白水平,与对照组相比,在协议的观察Gukovskaya et al。67年)和Mareninova et al。68年]。美联社的实验模型,腺泡细胞已被证明死亡通过坏死和凋亡68年]。我们发现吸动物诱发增加剂量的内毒素LPS引起剂量依赖性的upregulation pro-apoptotic caspase-9胰腺腺泡和刽子手caspase-3蛋白水平与caerulein孵化。莱恩et al。70年]表明LPS引起胰腺磷脂酶的释放2(中国人民解放军2)进入血液,其激活胰腺组织和腺泡细胞的凋亡。木村等。71年]表明,有限合伙人预处理的腺泡细胞凋亡发生率明显增加。这些结果表明,这种疾病的病理特征可能被修改的非致命的内毒素通过腺泡细胞凋亡的诱导。
总之,我们的数据表明,婴儿的老鼠LPS促进了HSP60的感应通过TLR4在他们的成年生活,反过来,伯灵顿/ bcl - 2和caspase-9 3激活。很可能,这一过程可能需要参与LPS-induced保护胰腺组织对急性损伤由caerulein过度刺激。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
本研究支持格兰特从大学健康科学学院,医学院的大学;不。K / ZBW / 000167。