文摘

背景。趋化因子CXCL10专门调节实验开发期间的斑块不稳定的表型。在这项研究中,我们评估了这些发现在小鼠和人类功能的后果。方法和结果。在老鼠,我们诱发不稳定斑块与颈动脉使用flow-altering设备。从星期1到4,老鼠注射一种中和CXCL10抗体。9周后,CXCL10抑制导致一个更稳定的斑块表型:胶原蛋白增加了58% (),平滑肌细胞内容增加2倍(),而巨噬细胞MHC II类表达下降了50% ()。同时,坏死核的大小减少了41% ()。106年人类颈动脉内膜切除手术标本浓度增加我们发现CXCL10强烈与动脉粥样硬化斑块增加表型(方差分析,)、巨噬细胞高、低平滑肌细胞和胶原蛋白含量低。结论。我们在目前的研究表明,CXCL10与脆弱的斑块的发展在人类和老鼠。我们得出这样的结论:CXCL10可能对plaque-stabilizing治疗提供新线索。

1。介绍

动脉粥样硬化是一种进步的炎性疾病的动脉血管病变,可能会不稳定,这可能会导致损伤破裂。这些破裂的高死亡率与动脉粥样硬化斑块显示有关特定的组织学表型,特点是大量的脂质和坏死细胞碎片覆盖薄纤维帽和炎症细胞的存在在斑块的肩膀1]。

以前,我们开发了一个实验性动物模型与稳定和不稳定斑块的特征同时诱导在一个直动脉段(2]。随后我们确认具体的各种趋化因子基因的表达谱在脆弱的斑块发展(3]。在这些趋化因子CXCL10专门调节在早期阶段在脆弱的斑块的发展领域。

CXCL10是科学家的趋化因子家族的成员。与移行细胞对刺激(IFN -γ)表示,许多细胞类型,例如,单核细胞/巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞、自然杀伤细胞(4,5]。影响CXCL10介导的g蛋白耦合受体CXCR3,它表达的是休息和激活T细胞,NK细胞和外周血单核细胞的一个子集(5- - - - - -7]。此外,CXCL10在炎性疾病中扮演各种各样的角色,就像在T-helper-1的启动和维护——(Th1)极化免疫反应(8,9),迁移激活T细胞(10),但也自然杀伤细胞(11),单核细胞(12,13平滑肌细胞(SMC)]和[14]。

尽管有这些引人注目的研究文献中所描述的,在动脉粥样硬化CXCL10不完全的特征。在人类动脉粥样硬化,但不是在健康的动脉,内皮细胞,平滑肌细胞和巨噬细胞表达CXCL10 [15]。功能观察CXCL10基因敲除小鼠表明CXCL10施加pro-atherogenic效果,可能相关的具体招聘和保留Th1细胞激活的差别,对这些基因的调控t细胞反应(16]。虽然这些发现表明CXCL10在动脉粥样化形成过程中发挥作用,其影响斑块成分尚不清楚。基于我们以前的观测在基因表达在老鼠模型中,我们假设CXCL10介导脆弱的动脉粥样硬化斑块的发展。因此,我们评估是否CXCL10发挥了至关重要的作用不稳定斑块发展评估的影响抗体介入功能抑制CXCL10在我们脆弱的斑块病变表型小鼠模型。提供的证据发现鼠标承担人类动脉粥样硬化的相关性,我们也调查CXCL10浓度之间的关系和人类颈动脉内膜切除手术损伤斑块组成。

2。材料和方法

2.1。动物和外科手术

载脂蛋白e缺陷小鼠,15 - 20周的年龄,得到从杰克逊实验室(美国我巴尔港)。他们被喂以高脂肪、高胆固醇饮食组成的15% (wt / wt) 0.25%可可脂和胆固醇(wt / wt)(饮食W,希望农场,Woerden,荷兰)。两周后开始这种饮食的老鼠与剪切stress-altering设备仪器在右颈总动脉2%异氟烷麻醉,如前所述[2]。简单地说,这个设备逐步缩小血管腔~ 70%的原始直径。因此,剪切应力降低上游的设备,设备内逐渐增加,振荡是下游的设备17]。手术后,老鼠继续高脂肪、高胆固醇饮食的其余部分的实验。9周的设备保持原位。干预和控制组包括至少10动物/组。所有动物实验动物伦理委员会批准的机构和符合执行机构和国家的指导方针。

2.2。CXCL10抑制

小鼠静脉注射三次一个星期在手术后2 - 4周,anti-mouse bioactivity-neutralizing单克隆抗体CXCL10 (MAB466、研发系统,阿宾顿,英国)的剂量25μg在0.2毫升无菌PBS。未经处理的cast-instrumented老鼠作为控制。

2.3。小鼠组织的分离和分析

牺牲后,血液收集和老鼠刷新系统PBS。接下来,颈总动脉被隔离,嵌入在10月化合物(Tissue-Tek,樱花,日本),并在液氮snap-frozen。组织学,8μm cryosections被削减和常规组织学染色(Hematoxylin-Eosin,他),脂质(油红O),胶原蛋白(Picrosirius红色),巨噬细胞(AbD Serotec anti-CD68,牛津大学,英国),巨噬细胞激活(anti-Major组织相容性复合体(MHC)二类,克隆M5/114,写明ATCC矿- 120),和平滑肌细胞(anti-SMCα肌动蛋白,Sigma-Aldrich、荷兰)。随后,高分辨率图像被使用一个奥林巴斯BX-40显微镜或蔡司LSM5元共焦显微镜(德国蔡司耶拿)。胶原蛋白染色评估使用了圆偏振过滤器。计算病变大小和细胞内容相对于斑块面积,分析了所有图片数字化后通过自动图像分析软件(Clemex技术公司、加拿大)应用染色区域的阈值。坏死核心(定义为hypocellular斑块蛀牙缺乏胶原蛋白,含有胆固醇结晶)评估基于他和Picrosirius红染色部分和测量相对于病变区域。血清中总胆固醇水平测定样品的酶比色法(美国和光诊断胆固醇E, kouichi)。

2.4。动脉内膜切除术手术

所有患者在本研究参与者的前瞻性研究,旨在调查斑块特征的预测价值长期结果(Athero-Express),描述了研究方法的广泛(前18]。简而言之,所有患者接受颈动脉内膜切除手术,在此期间,动脉壁组织。接下来,罪魁祸首病变,定义为最大斑块的部分负担,组织学检查处理。除了他染色,部分彩色的胶原蛋白(Picrosirius红色),SMC (α肌动蛋白)和巨噬细胞(CD68)内容。组织学评估进行了半定量的方式(没有,轻微、中等、重),在两个独立的观察者的基础。结果反驳后,第三个独立观察者是咨询。随后,斑块被指定为纤维(脂质构成<损伤面积的10%),fibroatheromatous脂质(10 - 40%),或动脉粥样硬化(脂质> 40%)基于胶原染色。此外,斑也被指定为SMC主导或巨噬细胞主要基于流行的细胞类型获得特定的染色。

5毫米段直接相邻的罪魁祸首病变在液氮粉碎,随后总蛋白提取使用1毫升TriPure隔离试剂(德国勃林格曼海姆),根据制造商的协议。然后,CXCL10浓度测定的酶联免疫吸附剂测定(ELISA)按照生产厂家的说明书(Quantikine人类CXCL10免疫测定、研发系统,阿宾顿,英国),从组织学和临床数据蒙蔽。

2.5。统计分析

SPSS(15.0版本,SPSS Inc .)、美国)是用于分析。测试之间的差异处理和控制老鼠在9周的位置,一个学生的t以及使用。当这些数据有非高斯分布,非参数t以及使用。动脉内膜切除术的样本,比较CXCL10水平分类基准和斑块形态变量之间,克鲁斯卡尔-沃利斯和Mann-Whitney测试为非高斯分布的数据。调查持续基线变量和CXCL10之间的差异,患者分为四分位数,命名为1到4基于CXCL10浓度增加。随后,这些四分位数被用来排序所有其他变量。单向方差分析是用来比较连续变量。四分位也用于可视化CXCL10浓度和斑块形态学之间的关系。数据被描述为平均数±标准差或中位数(内部四分位范围)。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

作者完全访问数据,并对其完整性负责。所有作者已阅读及同意写的手稿。

3所示。结果

3.1。抑制CXCL10生物活性抑制易损斑块的形成

正如我们之前发现CXCL10表达具体发展中不稳定的病变(3),我们也调查如果CXCL10功能参与斑块易损性的发展使用鼠标模型之前,我们开发了(2]。ApoE-deficient老鼠,剪切stress-altering设备应用,被注射了一种bioactivity-neutralizing抗体出现斑块的形成。正如预期的那样,血清总胆固醇水平之间没有差别对待和控制老鼠(30.13±4.6和29.92±6.7更易/ L,)。短期抑制CXCL10斑块发展的程度没有影响,因为我们没有发现病变大小差别对待和控制老鼠9周后剪切应力的改变。因为巨噬细胞泡沫细胞是动脉粥样硬化的特点,我们测量两个斑块脂质(31.3±8.0%和29.5±7.0%治疗控制)和巨噬细胞内容(31.7±7.6%和27.8±7.0治疗控制;图1(一)在CXCL10抑制),均保持不变。

评估斑块易损性,我们确定病变的胶原蛋白,这是主要的稳定斑块的组件。有趣的是,我们发现胶原蛋白的相对数量增加57%后的斑块CXCL10抑制(17.8±6.5%和11.3±5.5%,;图1 (b))。胶原蛋白斑块的数量基本上是胶原蛋白沉积和分解之间的平衡的结果。因此,胶原蛋白的增加可以减少分解的结果主要是通过激活巨噬细胞分泌的蛋白酶。确定免疫激活的程度,我们通过免疫组织化学方法测定MHC II级。血小板的细胞形态、位置和空间协会MHC II级与巨噬细胞染色法染色,CD68在相邻的部分抗体(数字1(一)和1 (c))强烈表明,MHCII-positive细胞的细胞表达这种激活标记。我们发现斑块MHC II级水平减少50%之后CXCL10抑制(6.3±3.3%和12.6±7.4%,;图1 (c))。此外,SMC的数量,这是众所周知的,产生胶原蛋白,CXCL10-suppressed组几乎翻了一番(13.5±8.4%和6.3±7.0%,;图1 (d)),这表明胶原蛋白含量的差异可能是由几个因素来解释。

坏死核心组件的一个特点是脆弱的斑块。测试是否CXCL10抑制减少坏死核心形成,我们分析了两个病变坏死核心的数量以及它们的相对大小。我们发现CXCL10抑制导致更少的坏死核心:38.9±22.1%和57.7±20%的部分覆盖整个病变坏死核心(包含)。此外,也坏死核心抗体治疗后下降的相对大小从26.4±11.4%至15.6±6.1%的斑块面积(;图1 (e))。

3.2。病人的特点

在这项研究中动脉内膜切除术106例标本进行了分析。概述在表提供病人的特征1。组织学病变的例子所示之前发布Verhoeven et al。18]。标本中的CXCL10浓度范围从察觉到384.8 pg / mL,中位数(四分位范围)的38.34 pg / mL (14-39 pg / mL)。比较连续CXCL10水平分类变量,患者分为四分位数(图2)。被测试的变量在四分位的变化。没有发现差异比较动脉粥样硬化疾病的危险因素。使用药物的四分位数之间没有显著差异。

3.3。高CXCL10浓度识别更脆弱的斑块患者表型

几个重要的斑块成分和CXCL10水平之间的关联被发现。动脉粥样硬化病变更突出CXCL10更高浓度比分为纤维(排名53岁和45岁)。同时,更高CXCL10浓度与更多有关macrophage-dominant斑块(排名56和41岁的),更少的平滑肌细胞(排名39和74,),和更少的胶原蛋白(排名37和63,)。

随后,我们分析了斑块成分和CXCL10水平之间的关系,通过将患者分成四分位数基于CXCL10浓度。有更多的动脉粥样硬化病变中四分位数越高,而纤维病变更经常下四分位数(图中3(一个))。Macrophage-dominant病变主要是发现CXCL10最高四分位数的内容,而SMC优势降低CXCL10浓度(图3 (b))。但是,没有差异被认为在四分位数之间的巨噬细胞染色(图4(一))。这个悖论是成反比关系的结果平滑肌细胞染色和增加CXCL10浓度(图4 (b))。此外,更多的胶原染色的下四分位数(图斑4 (c))。

4所示。讨论

本研究可以总结出它的两个主要发现。首先,我们展示了一个功能性的作用CXCL10易损斑形成不稳定的动脉粥样硬化疾病的实验小鼠模型。我们观察到抑制CXCL10 bioactivity-neutralizing抗体导致斑块减少巨噬细胞活化,与更多的SMC和随后的胶原蛋白含量增加而控制。减少数量和规模的坏死核心的病变治疗动物进一步证实这些结果。这导致病变表型与内在稳定性。

其次,我们发现在人类的颈动脉斑块,CXCL10水平与病变形态有关。这是显示动脉粥样硬化斑块的数量增加而增加CXCL10浓度,与不稳定斑块的特征,如巨噬细胞优势和降低平滑肌细胞和胶原蛋白的存在。

之前的研究表明,抑制抗体CXCL10的肠道炎症动物模型是一种有效的方式来抑制其功能(19,20.]。这些研究的结果归因于Th1细胞的减少数量,招募到患病的网站和降低炎性细胞因子的生产(19]或导致炎性疾病恶化[20.),根据T细胞在疾病的发病机理中的作用。

lesion-stabilizing效应我们观察到通过抑制CXCL10可能被类似的机制解释如上所述,因为它已被证明在此之前抑制CXCL10-CXCR3途径减少lesional T细胞的数量(16,21]。Veillard等人报道,基因删除CXCR3 ApoE基因敲除小鼠减少早期病变的形成,这与增加lesional FoxP3-positive调节性T细胞(21]。最近,据报道,在动脉粥样硬化易感基因删除CXCL10老鼠也会导致较小的病变,含有更少的CD4 + T细胞(16]。令人惊讶的是,尽管总体降低t细胞在病变的存在,FoxP3的表达以及更高的抗炎细胞因子il - 10和TGF -β信使rna。这表明一个更突出的作用,调节性T细胞在这个模型。FoxP3和TGF -类似的增加β表达式在一项研究中发现使用肽得罪CXCR3 LDL受体基因敲除小鼠,导致较小的病变在主动脉根和主动脉(22]。

一般实验小鼠模型的局限性在于,很少有9周后诱导T细胞病变位置,大约每损伤截面2 - 4 (3]。因此,我们无法找到一个t细胞数量差异后CXCL10抑制(数据没有显示)。然而,降低T细胞在早期阶段可能发生的实际的抑制。我们在只有一个时间点进行测量,而存在的T细胞在损伤随时间的变化23]。同时,少量的T细胞的影响可能被证明是非常强大的24]。

少量的T细胞不允许产生足够可靠的数据来支持与老鼠的情况做一个比较缺乏CXCL 10基因打靶。这mRNA分析不能解决,因为没有RNA可以从动脉内膜切除术样品使用。除了促进白细胞的招聘,CXCL10也诱发和维持主导Th1-type响应增加干扰素的生产γ,提供了一个积极的反馈循环(25]。中和CXCL10可能因此导致干扰素-的浓度下降γ的病变被认为是疾病进展的关键细胞因子(26和巨噬细胞激活27]。这个概念是在协议与我们的研究结果对巨噬细胞活化状态以表达MHC II级(27],SMC的存在[27],和胶原蛋白积累[28]。

另一种斑块或额外的机制修改CXCL10抑制可能是有效的。不仅Th1和NK细胞,主要干扰素-γ生产商,CXCL10有所反应,但也血浆树突细胞(PDC)表达CXCR3和通过这种受体(招募29日]。循环PDC减少的数量在人类动脉粥样硬化,而免疫组织化学分析表明,他们招募了先进的斑块(30.,31日]。PDC已知生产大量的干扰素-α在激活,细胞因子函数作为动脉粥样硬化斑块的炎症放大器(32]。此外,一个小的子集单核细胞已被证明是通过招募CXCR3炎性环境(7),由此而导致斑块不稳定。

这还需要进一步的研究来理解机制CXCL10抑制的影响。例如,细胞凋亡可能观察到的差异的一个重要的角色在斑块成分和尺寸。可能感兴趣的详细研究SMC的角色为增殖和细胞凋亡染色串行部分一方面和α肌动蛋白在另一方面。此外,原位zymography研究可以得到一个清晰的思路可能的角色执行溶胶原的活动的病变。这将是非常有趣的了解促炎细胞因子微环境的作用在斑块与CXCL 10抑制实验。从目前的数据,我们不能排除,通过抑制CXCL10我们只是推迟了病变的形成和成熟的过程而不是永久地改变它。正在进行的讨论的这个论点,因为代表人类疾病动物模型的质量,我们也进行了平行研究人类。

马赫et al。15)首先将CXCL10与人类动脉粥样硬化,报告,CXCL10表达疾病的几个阶段。CXCL10被证明存在内皮细胞表面,在招聘和暗示作用粘附CXCR3阳性细胞的循环。他们还显示广泛的表达CXCL10 SMC和巨噬细胞在病变。人们很少知道CXCL10对人类动脉粥样硬化发展的影响和临床结果。先前的研究寻求相关血浆CXCL10水平与冠心病(CHD)的发生。在病例对照研究中发现相关的冠心病风险增加血清CXCL10 [33]。后面的前瞻性研究表明,确实水平的提高CXCL10存在冠心病之前,但并不被认为是一个独立的危险因素34]。我们的研究是第一个关联lesional CXCL10蛋白质含量与斑块形态在人类和斑块易损性的可能预测因子。显然,这不能直接衡量生活的病人,所以会很感兴趣的知道CXCL10 lesional和系统性水平之间的相关性。没有血浆样品可用来衡量系统性CXCL 10水平和关联到lesional水平,所以这个必须等待未来的工作。

总之,我们表明,趋化因子CXCL10发挥功能作用在老鼠和动脉粥样硬化斑块的不稳定是专门调节在人类脆弱的斑块。由于实验数据被类似的发现在人类不稳定的病变,平行CXCL10可能被视为一个新的铅变成理解斑块不稳定的过程。

确认

作者要感谢对我范Haperen(荷兰鹿特丹伊拉斯姆斯大学医学中心)和本范Middelaar(荷兰乌得勒支大学医学中心)与动物研究他们的帮助。这项研究受到了荷兰t45心脏基金会拨款2002。