识别Isoflavonoid Biosynthesis-Related R2R3-MYB转录因子Callerya叶(冠军。Benth交货)。散粒使用Transcriptome-Based Coexpression基因分析

文摘

R2R3-MYB家族是最大的植物转录因子(TF)家庭扮演重要的角色在国防、植物生长和次生代谢的生物合成。虽然这在许多物种基因家族进行了研究,isoflavonoid biosynthesis-related R2R3-MYB TFsCallerya叶(冠军。Benth交货)。传统的中草药,散粒知之甚少。在这里,总共有101 R2R3-MYB TFs被确定c .叶转录组数据集。25演化支分为五个功能组集群基于序列相似性和种系发生树。守恒的主题和领域分布、表达模式、和coexpression网络也被用来确认潜在R2R3-MYB TFs isoflavonoid生物合成的调控。在网上评估表明,推导出R2R3-CsMYB蛋白质含有高度保守的R2R3重复域的氨基端区域,这是签名的主题R2R3-type MYB TFs。八个潜在TFs (CsMYB17,CsMYB36,CsMYB41,CsMYB44,CsMYB45,CsMYB46,CsMYB72,CsMYB81)有高程度的coexpression四个关键isoflavonoid生物合成的基因(合作,CsCHS7,CsHID-1,CsCHI3),CsMYB36作为一个潜在的监管机构拥有最高的学位。高效液相色谱分析表明,芒柄花黄素和maackiain内容在块茎状的根的发展显著增加,这可能是由两个控制相关R2R3-CsMYBs isoflavonoid生物合成途径和结构基因。转录组数据进一步验证了实时逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)分析,和类似的表达谱之间TFs和关键结构基因被确定。本研究的第一步的理解R2R3-MYB TFs调节isoflavonoid生物合成c .叶。研究结果将为进一步的功能分析和质量改进提供信息通过基因操纵这些潜在R2R3-CsMYB基因c .叶。

1。介绍

Callerya叶(冠军。Benth交货)。散粒的药用植物蝶形花科家庭,在中国南方具有悠久的栽培历史和传统上用作医学浓缩的弱点,以及强化骨骼和肌肉。现代药理研究表明,c .叶可以增强免疫力、滋养肺具有抗炎和抗哮喘作用[1]。Isoflavonoids专业代谢物产生的块茎状的根c .叶,包括索引化合物maackiain和芒柄花黄素(2,3]。

Isoflavonoids报道是由几个结构基因(iso)类黄酮生物合成途径,这些结构特征基因分离和迄今为止保存在高等植物(4,5]。的isoflavonoid C6-C3-C6碳骨架来自p-coumaroyl-CoA,协调生产phenylpropanoid通路中的三个关键酶的反应:苯丙氨酸ammonialyase (PAL),肉桂酸4-hydroxylase (C4H)和4-coumarate-CoA连接酶(4 cl)。查耳酮合酶(CHS)可以促进p-coumaroyl-CoA,柚苷配基查耳酮本身,还是它的功能与查耳酮还原酶(杆)合成isoliquiritigenin查耳酮。产品进一步催化了查耳酮异构酶(CHI)收益率liquiritigenin [6]。然后,一些下游isoflavonoid途径的关键酶是2-hydroxyisoflavanone脱水酶(藏)、异黄酮合成酶(IFS)、异黄酮4 - - - - - -O-methyltransferase (HI4OMT)和vestitone还原酶(VR)、羟基化反应下,脱水,甲基化,糖基化,形成各种isoflavonoid衍生品(7]。最近,结构基因的协调表达(iso)的类黄酮生物合成途径分析了通过在一些豆科植物物种的转录组数据,如大豆、国内外葛根candollei,葛根(6,8,9]。在c .叶,我们曾报道,15个关键基因可能参与isoflavonoid生物合成途径,包括仿射,chs,工具与(10]。

一般来说,代谢物积累可以更好地控制(即协调监管的关键基因。TFs)的多个步骤,而不是修改一个结构基因(11,12]。更多潜在的TFs及其目标基因需要的特征。成髓细胞瘤(MYB) TFs植物中普遍存在,具有守恒MYB dna结合域n端,形成一个helix-turn-helix (HTH)结构约53个氨基酸残基(13]。R2R3-MYB IFs,最大的MYB亚家族TFs,包含两个不完美的重复MYB dna结合域。他们的行为通过直接绑定到结构生物合成途径中的基因的启动子或通常形成一个三元复杂基本helix-loop-helix (bHLH)和WD-repeat蛋白质14]。他们报告在次生代谢发挥重要作用,在植物生长激素信号,对压力的反应与发展(15]。例如,几个R2R3-MYB IFs确定调节类黄酮的生物合成,包括花青素、黄酮醇,原花青素,isoflavonoids。AtMYB11和AtMYB12积极监管黄酮醇的生物合成16),而AtMYB111 proanthocyanidin生物合成中发挥了至关重要的作用拟南芥(17]。几个R2R3-MYB蛋白质(GmMYB29 GmMYB12B2、GmMYB176 GmMYB133, GmMYB58,和GmMYB205)大豆被确定为活化剂isoflavonoid生物合成的调控的关键结构基因的表达(11,12,18- - - - - -20.]。LjMYB14R2R3-MYB编码蛋白质l .粳稻,积极phenylpropanoid调制结构基因和isoflavonoid生物合成途径(21]。PmMYB18 PmMYB75可能积极监管机构isoflavonoid生物合成的p . candolleivar. mirifica [9]。GbMYBFL参与类黄酮生物合成,类黄酮素和花青素积累中发挥了至关重要的作用银杏叶(22]。考虑到R2R3-MYB TFs次生代谢的重要角色,R2R3-MYB TFs的识别和表征c .叶可以帮助进一步研究isoflavonoid生物合成的调控。到目前为止,没有一个R2R3-MYB TFs的基因参与调节isoflavonoid生物合成的研究c .叶。

在目前的研究中,transcriptome-wide R2R3-MYB TFs的识别c .叶利用转录组数据。同源域和主题的特点组成R2R3-MYB成员进行调查。我们进一步分析了coexpression关系isoflavonoid biosynthesis-related基因和假定的R2R3-MYB TFs,可能参与isoflavonoid生物合成的调控。最后,我们验证潜在R2R3-MYB TFs的表达模式和关键结构基因isoflavonoid RT-qPCR生物合成途径的分析。因此,进一步的功能分析的起点R2R3-MYB TFs执行在这项研究中,可为进一步的研究提供候选人R2R3-MYB TFs识别这些基因的角色isoflavonoid生物合成c .叶。

2。结果

2.1。识别R2R3-MYB亚基因c .叶

删除短序列和冗余序列后,综合比较分析发现101基因编码R2R3-MYB蛋白质MYB转录组数据集的亚科c .叶,名叫CsMYB1-CsMYB101。翻译假定的蛋白质序列的长度范围从105年到1050年的氨基酸。计算分子量(MW)的R2R3-CsMYBs范围从12.16 kDa 116.22 kDa。计算理论等电点(π)从4.77到9.77不等。CsMYB11拥有最长的和1050个氨基酸序列最大的116.22 MW kDa,而最短的蛋白质(105个氨基酸)与最小的MW CsMYB60 12.16 kDa。α螺旋和随机线圈R2R3-CsMYBs主要的二级结构。蛋白质亚细胞定位预测结果表明,所有R3R3-MYB局部细胞核(ESM_1)。

多重序列比对也由Clustal X2.0确定同源域101年R2R3-CsMYBs的特点。如ESM_所示2R2R3-CsMYBs包含典型的R2重复,R2基本结构[- w - (X19) - w - (X18) - w -]。一个高度保守的色氨酸(W)的三驾马车是包含在R2重复残留,而且每个色氨酸被18或19个氨基酸分离。除了高度保守的W, R2的几个守恒的位置也确定了重复,如谷氨酸(E)、天冬氨酸的(D)和精氨酸(R)。在R3重复,大多数R2R3-CsMYBs的基本R3结构[- F - (X18) - W - (X18) - W -],其中第一个保守W是代替其它氨基酸,如苯丙氨酸(F)、异亮氨酸(我)和亮氨酸(L)。MYB高度保守序列的dna结合域主要是位于helix-turn-helix (HTH)主题(第二个和第三个色氨酸之间的两个R重复),该功能在识别目标序列。

2.2。系统发育分析和假定的R2R3-MYB TFs的函数

十八R2R3-MYB蛋白质,以前一直认为调节类黄酮生物合成催化剂/抑制剂(ESM_3)在一些植物和完整的R2R3-MYB亚科的成员拟南芥(ESM_4)收集。neighbor-joining (NJ)拔起系统树构建使用101 R2R3-CsMYBs 126 R2R3-AtMYBs, 18岁的函数R2R3-MYBs各种植物(图所示1)。结果表明,25演化支细分在101 CsMYBs基于树的拓扑(ESM_5)。这些演化支指定C1这件和分离不同的颜色,包括7特定演化支(30蛋白质)答:芥蛋白质和18共同演化支(213)之间c .叶和答:芥。

在同一进化枝同源蛋白质簇可能具有类似的功能。根据function-annotated R2R3-MYBs答:芥101年R2R3-CsMYB蛋白质的功能,属于18共同演化支,是预测。这些蛋白质主要是分为五个功能组(ESM_5)。组1,包括24蛋白质在两个演化支(C5和C13),主要是参与胚胎发生(如种子、胚乳和细胞分化)和表皮细胞的发展。组2,其中包括37名蛋白质在五个演化支(C2, C15,使用C18, C21 C22),参与应对生物和非生物压力。组3,包括20蛋白5演化支(C8, C10, C11、C19,和这件),负责次级代谢产物生物合成的规定,如花青素、硫配糖体和类黄酮。有趣的是,大多数(75%)的函数R2R3-MYB蛋白质在不同植物物种分类组3。4组,包括9蛋白质在三个演化支(C4、C12和C14),扮演了重要的角色在调节木质素的沉积和监管,纤维素和半纤维素。蛋白质组5包括11三个演化支(C3、C7和C16),其功能是未知的。因此,这些结果表明,R2R3-CsMYBs可能扮演不同角色的成长和发展,对压力的反应和次生代谢的生物合成c .叶,R2R3-MYB蛋白质分类组3可能参与isoflavonoid生物合成c .叶。

2.3。域和图案组成c .叶R2R3-MYB家族蛋白质

进一步调查的特点之间的同源域成员R2R3-CsMYBs(101蛋白质),在线MEME工具应用于分析主题分布区域和最普遍的频率氨基酸在每个位置。最多10个主题由101 R2R3-CsMYB序列被选中,共享和MEME的标志图片下载网站(ESM_6)。结果表明,三类划分在所有R2R3-CsMYB-translated假定的蛋白质序列根据标志作品,包括I, II, III。蛋白质三级包含dna结合蛋白质REB1残渣(红色),而其他人PLN03091(绿色)或PLN03212(黄色)残留。其中,主题3(粉红色),主题1(绿色),主题2(黄色)出现在所有序列。略有不同的成员类别II和III,和类别的成员我存在主题9(紫色)的主题3,这属于演化支C6-C16 C19-C25,暗示主题9可能与dna结合相关网站运作的监管次生代谢。同样,12的101年三级R2R3-MYB翻译假定的蛋白质序列具有高度保守的图案,3、1、2、6、4、5、7、8,这可能参与胚胎发生(图的规定2)。在这些R2R3-CsMYBs,主题3和前面的一部分主题1组成的典型的R2重复,而后者的一部分主题1和整个主题2是典型的由R3重复。除了三联体的色氨酸,R2和R3重复还包含其他几个守恒的残留物,如谷氨酸(E)天冬胺酸(D)残留(ED)、亮氨酸(L)残留,和甘氨酸(G)残留物(图3)。

2.4。基于转录组数据R2R3-CsMYB基因的表达分析

评估潜在的监管功能R2R3-CsMYB isoflavonoid生物合成基因,其表达谱进行了分析通过构造一个热图使用的转录组数据c .叶。结果显示显著差异表达谱的R2R3-CsMYBs块茎状的根在四个不同的发展阶段(6、12、18、30个月后萌发(MAG))。十二R2R3-CsMYB基因高度调节12和18个杂志,等CsMYB36,CsMYB41,CsMYB56。此外,23 R2R3-CsMYB基因的表达水平是专门调节18岁杂志,而22基因高表达在12杂志。R2R3-CsMYB基因在3组,fivegenes (CsMYB16,CsMYB40,CsMYB42,CsMYB44,CsMYB8818岁)显示高表达杂志,而六个基因(CsMYB7,CsMYB14,CsMYB45,CsMYB73,CsMYB78,CsMYB46)尤其high-expressed 30杂志。CsMYB36和CsMYB41都是高度表达在12和18杂志。然而,其他三个基因的表达(CsMYB17,CsMYB72,CsMYB8112)在高水平杂志(图4)。因此,我们推测isoflavonoid生物合成的复杂的监管下可能促进这些基因在增厚c .叶块茎状的根。

2.5。Coexpression模式R2R3-CsMYBs与Isoflavonoid生物合成的基因

我们以前报道,15假定的结构基因参与isoflavonoid生物合成,包括HI4 OMT,2工具与3气,2chs3hid灯,2仿射,I3 H,4 cl(10]。这些基因有不同的表达模式在四个不同的发展阶段(6、12、24和30杂志)。两个chs(CHS1和CHS7)都是高度表达12杂志。然而,显示更多的基因低表达水平12杂志,等HID-1,仿射,I3 H,工具与,HI4 OMT(数据5(一个)和5 (b))。确定哪些TFs可能isoflavonoid生物合成中扮演关键的角色c .叶、基因coexpression网络分析了20组TFs 3至15 isoflavonoid生物合成途径中的关键结构基因。结果表明,16 R2R3-CsMYB基因coexpressed与这些结构基因,造成8名CsMYBs拥有高学位的coexpression四isoflavonoid-related基因(合作,CsCHS7,CsHID-1,CsCHI3),来显示他们的潜在贡献isoflavonoid生物合成(图5 (c))。CsMYB36显示最高程度的coexpression isoflavonoid生物合成的基因,如CHI1,HID-1,HI4 OMT,VR-like,CHS7。芒柄花黄素和maackiain内容的进一步分析表明,期间他们都显著增加块茎状的根(图的发展5 (d)),这表明isoflavonoid积累可能是增加了移植R2R3-CsMYBs和结构性isoflavonoid生物合成有关的基因。代谢通量可以更好地协调控制的监管。

2.6。验证候选基因参与Isoflavonoid新陈代谢

关键基因的相对表达水平与isoflavonoid积累进行分析评估的转录组测序数据的准确性。12个基因包括八TFs和四isoflavonoid生物合成的基因选择分析。结果表明,RNA (FPKM值)测序结果总体一致的值选择的基因。重要的皮尔森FPKM之间的相关性所有测试值也发现基因( ; , )(图6)。因此,RT-qPCR分析证实了转录组数据的有效性。与此同时,RT-qPCR结果表明TFs之间有相似的表达谱和关键结构基因,如CsMYB72,CsCHS7,CsMYB17,CsCHI3,这表明这些TFs可能激活关键结构基因的启动子活动调节isoflavonoid生物合成。

3所示。讨论

的R2R3-MYB亚TFs扮演重要角色在荷尔蒙信号,压力反应和次生代谢物积累在植物14,23]。类黄酮代谢产物生物合成通常是由R2R3-MYB激活蛋白,包括isoflavonoids大豆(大豆)[11,12,18- - - - - -20.),花青素在牡丹(24),和类黄酮银杏叶(22]。c .叶已被用来作为民间医药在中国数百年来。Isoflavonoids是最重要的有效成分c .叶(25]。Isoflavonoids确定药物的质量,和isoflavonoid内容各不相同的开发过程中结节性根(10]。然而,isoflavonoid生物合成的分子机制和积累导致的变化isoflavonoid内容基本上仍是无人涉足。因此,研究R2R3-MYB TFs有助于理解潜在的转录基因的isoflavonoid生物合成及其调控网络c .叶。

non-model植物尚未测序的基因组,转录组测序是一种相对经济和可靠的方法,为筛查和基因转录分析提供数据集(26]。增加转录因子已经从植物中分离出使用转录组数据集,如大麦和51 R2R3-MYB基因(27),银杏叶有45 GbMYBs [15),而绞股蓝皂与125年GpAP2 /小块土地[26]。在目前的研究中,101 R2R3-CsMYBs存在守恒的域c .叶被确定通过转录组测序(图1)。先前的研究显示,不同数量的R2R3-MYB基因存在于不同的物种。全基因组分析大豆和Medicago truncatula已经确定了244年和150年R2R3-MYB蛋白质在豆科物种,分别为(13,28]。的数量等一些植物基因分离甜橙(100)(29日),丹参(110)(30.)相似,但低于R2R3-MYB蛋白质拟南芥(126)(31日]。虽然我们可能没有确定整个R2R3-CsMYBsc .叶这些基因的转录组数据,识别可以进一步丰富的资源c .叶在基因库。

高度保守的色氨酸(W)残留分布在第三螺旋MYB蛋白的dna结合活性很重要,这可能表明保护功能在不同的植物物种17,32]。R2R3-CsMYBs的成员c .叶包含相同的Trp氨基酸残基在第三螺旋,揭示他们的高度保守的特征(ESM_2)。一般来说,所有这些蛋白n端拥有一个高度保守的dna结合域,和每个R结构尤其下半年守恒(13,31日]。在目前的研究中,主题3(粉红色),主题1(绿色),和主题2(黄色),由典型的R2和R3重复,出现在所有R2R3-CsMYB的n端序列(数字2和3)。除了他们,类别的成员我存在主题9分布式主题前3,而三级拥有一个高度保守的主题10的主题3。这些结果表明,高保护出现在R2R3-CsMYB蛋白质。R2R3-CsMYBs的三螺旋结构是守恒的比其他两个螺旋结构,这与以前的研究结果是一致的(13,33]。我们假设第三螺旋结构可能反映R2R3-CsMYBs的功能稳定。另一方面,R2R3-CsMYBs的特有功能可能导致变异的关键氨基酸在这个地区。例如,脯氨酸(P)(位于58)链接器地区取代了16 R2R3-CsMYBs丝氨酸(S),这是减少报道protein-DNA复杂的稳定性,甚至导致dna结合活性的损失(34,35]。此外,类似于以前的研究(23,33),种特异的序列可能分布在糖基(图2它们有别于其他亚科和影响他们的转录活动。这一发现进一步支持R2R3-CsMYB功能的多样性。

更好地分类R2R3-CsMYB蛋白质和预测功能,系统发育关系的综合分析是由比较同源蛋白在其他物种(图1)。基于独特的图案的存在守恒MYB以外的领域,大多数的拟南芥R2R3-type MYBs被分为22子组(31日]。由于的功能拟南芥R2R3-MYB TFs已经被研究和实验验证,我们预测的功能根据R2R3-MYB R2R3-CsMYBs TFs答:芥。七MYB子组已被证明的激活一个或多个分支phenylpropanoid新陈代谢R2R3-MYB蛋白质的功能注释答:芥,包括子组S3、S4 S5, S6, S7, S12,向33,36,37]。在目前的研究中,25演化支细分在101 R2R3-CsMYBs基于树的拓扑和R2R3-MYB TFs的分类,包括7特定演化支(30蛋白质)答:芥蛋白质和18共同演化支(213),表明之间的密切关系答:芥和c .叶。不同的基因结构隐含多样的基因功能。五官能团根据类似的功能分散在这项研究中,包括增长和发展,对压力的反应,和次生代谢(ESM_5)。值得注意的是二十个蛋白质组3,包括五个演化支(C8, C10, C11、C19,和这件),存在主题9分布式的主题3我在类别和集群一起AtMYBs属于S4, S5, S6, S7和S12,表明主题9可能与类黄酮生物合成的调控。18的系统发育关系function-reported R2R3-MYB TFs在不同植物物种也支持我们的结果,这表明R2R3-CsMYB蛋白分布在3组可能isoflavonoid生物合成中扮演重要角色c .叶。R2R3-CsMYB的转录功能蛋白质组3权证更详细的调查。

与下游转录因子往往coexpressed结构基因。类似的表达模式通常是一个有效的方法来识别转录因子调节次级代谢。几个MYB基因国内外葛根candolleivar。Mirifica (PmMYB18,PmMYB23,PmMYB75,PmMYB76显示相似的表达模式与关键isoflavonoid生物合成的基因在结节性皮质(9]。在土豆,StAN1R2R3-MYB活化剂,以前命名的StAN2在一些研究中,anthocyanin-pigmented块茎中高度表达,显示与结构基因的转录水平正相关,与花青素含量(38]。我们以前的研究表明仿射,chs,hid灯,气,HI4 OMT,工具与关键是isoflavonoid生物合成的基因(10]。正如所料,组3中的表达模式显示,大多数R2R3-CsMYBs表现出相似的表达模式与关键isoflavonoid生物合成的基因。coexpression进一步分析发现,八个潜在TFs (CsMYB17,CsMYB36,CsMYB41,CsMYB44,CsMYB45,CsMYB46,CsMYB72,CsMYB81)高度coexpressed四个关键isoflavonoid生物合成的基因(合作,CsCHS7,CsHID-1,CsCHI3),因此促进了芒柄花黄素和maackiain积累(数字4和5)。TFs之间的相似的表达谱和关键结构基因,如CsMYB72,CsCHS7,CsMYB17,CsCHI3(图6),建议这些TFs可能充当催化剂促进isoflavonoid积累c .叶的根源。

一般来说,一个特遣部队可以同时控制多个结构基因的表达和一个基因可以同时由多个TFs [39,40]。在这项研究中,CsMYB36显示最高程度的coexpression isoflavonoid生物合成的基因,如CHI1,HID-1,HI4 OMT,VR-like,CHS7。有趣的是,进一步研究CsMYB36与关键isoflavonoid生物合成的基因c .叶。此外,类黄酮生物合成途径由MBW转录监管复杂。MBW复杂的活化或抑制作用主要是通过绑定由MYB转录因子的结构基因的启动子,一起共同bHLH和WD40因素。目前市面上的任何信息如何MBW发生在复杂的执行它的功能和机制c .叶。增加的isoflavonoid生物合成水平c .叶,MBW复杂函数应该考虑在未来。

4所示。结论

本研究的第一个transcriptome-wide详细分析R2R3-MYB亚基因c .叶。总共有101 R2R3-CsMYBs被确定,分为25演化支根据他们的系统发育关系。推断R2R3-CsMYB蛋白质含有高度保守的R2R3重复域的氨基端区域,这是签名的主题R2R3-type MYB TFs。守恒的主题和领域分布、表达模式和coexpression网络帮助识别潜在R2R3-CsMYB TFs isoflavonoid生物合成的调控。八个潜在TFs (CsMYB17,CsMYB36,CsMYB41,CsMYB44,CsMYB45,CsMYB46,CsMYB72,CsMYB81)有高程度的coexpression四个关键isoflavonoid生物合成的基因(合作,CsCHS7,CsHID-1,CsCHI3),CsMYB36作为一个潜在的监管机构进一步调查显示最高的学位。进一步分析芒柄花黄素和maackiain内容时显著增加块茎状的根的发展,表明相关的代谢通量可能由两个控制R2R3-CsMYBs参与isoflavonoid生物合成和结构基因。这些发现不仅可能加速新品种的遗传改良进程isoflavonoid含量高,但也提供了新颖的见解R2R3-CsMYB底层isoflavonoid生物合成的分子调节机制在这个中草药与扩大的根源。

5。材料和方法

5.1。植物材料

幼苗的c .叶在黑暗条件下湿珍珠岩孵化 直到发芽。后两天发芽,幼苗培养在温室配有温度监测系统( ),相对湿度( ),和自然在广西植物园药用植物光周期(中国南宁),相同的栽培技术措施。块茎状的根在四个发展阶段(6、12、18、30杂志)c .叶收集。三种不同的植物被用作生物复制。样本收集后立即在液态氮冷冻和储存在-80°C,直到进一步的使用。

5.2。芒柄花黄素测定和Maackiain内容

芒柄花黄素和maackiain被检测到的内容根据Chen等人描述的方法(2]。总之,diamonsil C₁₈(2)列用作色谱柱。流动相是 1.0毫升的流量最小¹。检测波长被设定在248和310海里。列温度保持在35°C和注射量20μl·芒柄花黄素的校准曲线线性良好/ 0.0025−0.0610的范围μg ( )。平均回收率为100.0%,RSD = 2.00% ( )。maackiain的校准曲线线性良好/ 0.0387−1.0152的范围μg ( )。平均回收率为100.6%,RSD = 0.70% ( )。

5.3。RNA图书馆建设和转录组测序

根的总RNA提取根据试剂盒方法(目录15596 - 018;英杰公司生活技术,美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)按照制造商的指示。对于每一个样本,等量(20μg)的总RNA ( )应用构造cDNA文库与姚明et al。(描述的方法10]。最后,十二个库(三个复制/样本)在pair-end测序( )格式bgiseq - 500测序平台,阅读是加工和新创组装,由华大基因研究院技术解决方案和结果分析了有限公司有限公司(BGI科技)(深圳华大基因研究院,中国)。

5.4。转录组的分析数据

适配器序列(读取模棱两可的基地“N”)和低质量的读(读有超过20%的基地 )被过滤。过滤后的原始数据,我们得到153153 unigenes总长度为217.31 Mb,将军2167个基点(ESM_的价值7)。过滤后的洁净读取NCBI SRA存储库中可以发现,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/加入,没有。SRP223620。的新创组装、注释和富集分析unigenes进行根据的方法么10]。unigenes的微分表达式是通过使用DEGseq相比R包(1.18.0)的阈值 在每一个成对比较, 和值< 0.05。此外,多个测试修正进行了通过控制错误发现率(罗斯福)小于0.05。最后,isoflavonoid-related基因的表达热图集群生成和可视化使用TBtools软件41]。

5.5。R2R3-MYB基因的鉴定c .叶

隐马尔科夫模型(HMM)剖面MYB绑定域(PF00249)从包含获得30.0数据库(http://pfam.xfam.org/)[42)被用作查询的搜索c .叶使用HMMER(转录组数据库http://hmmer.org/)[43)的初始阈值 选择ID数字序列包含MYB域。总共有142重叠群被发现。所有这些重叠群下载从转录组数据库和检查,以确保它们含有的保守域智能version 7 (44)(http://smart.embl-heidelberg.de/)和NCBI的保守域数据库(CDD) [41]。后删除短序列(< 100个基点)和争论冗余序列共享> 95%匹配26),序列与R2R3-MYB守恒的域被认为是R2R3-MYB总科的成员c .叶。然后,我们得到了完整的cd 101 R2R3-CsMYB序列。这些蛋白质的理化参数被进一步分析。的预测多工作站系统和πR2R3-CsMYB蛋白质预测ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)[33]。R2R3-CsMYB蛋白质的亚细胞定位预测PSORT在线程序(http://www.genscript.com/psort.html)。此外,R2和R3 MYB重复的序列R2R3-MYB蛋白质都是一致的Clustal X2.0程序可视化守恒的dna区域。R2R3-MYB基因的表达式的热图集群使用TBtools可视化软件(41]。

5.6。系统发育树和守恒的主题分析MYB蛋白

多重序列比对(MSA)的245 R2R3-MYB蛋白质进行了包括101 R2R3-MYB蛋白质c .叶126年,从答:芥,从其他植物和18。的氨基酸序列答:芥从TAIR下载(http://www.arabidopsis.org/)数据库(31日](ESM_4)。十八岁的蛋白质从NCBI检索(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/protein/),已报告规范isoflavanoid生物合成(ESM_3)。245年6.0大型蛋白质是一致的建设系统树(45]。neighbor-joining (NJ)系统发育树构建基于对齐的结果用以下参数:泊松修正,成对删除,引导分析1000年复制。R2R3-CsMYB蛋白质的功能c .叶分类和预测是根据系统发育树。R2R3-CsMYB蛋白质的守恒的主题进行了分析使用多个主题抽取5.1.1期望最大化(MEME5.1.1:http://meme-suite.org/tools/meme)[46),用以下参数:最小和最大主题宽度6和50岁的分别,图案的最大数量10。最后,Tbtools软件(41)是用于可视化系统发育树,守恒的图案,和域R2R3-CsMYB蛋白质。

5.7。Coexpression网络建设

记录之间的关键结构基因的表达谱R2R3-CsMYBs,这可能是负责次生代谢的规定,被用来构建coexpression网络。相关矩阵的表达式生成与Cytoscape v3.5.1测量两两基因之间的相似性的表达。基因对 (积极coexpression)或 (负coexpression)被认为是明显coexpressed。

5.8。RT-qPCR分析

验证候选TFs和isoflavonoid-related基因的表达谱c .叶,RT-qPCR实验进行SYBR®预混料交货Taq™(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。共有1μg的RNA是reverse-transcribed cDNA使用PrimeScript RT试剂与gDNA橡皮擦工具(豆类,大连,中国)。之前准备的互补脱氧核糖核酸是稀释5倍反应系统。RT-qPCR分析后是由MIQE指南(47]。在使用引物5.0 (ESM_ gene-specific引物的设计8深圳华大基因研究院)和合成。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)被选为一个内部参考基因。对于每个引物,一个放大的预期长度1.0%琼脂糖凝胶电泳和唯一的解离曲线的峰值RT-qPCR分析验证。扩增子的大小范围之间的80个基点和280个基点。基因的扩增效率从115%到95不等。与没有模板PCR反应控制也表现为每一对引物。反应是在总量的20倍μL包含10μL SYBR®预混料Taq™, 2μL cDNA、1μL每10μM底漆,6μL ddH₂o .实时pcr进行使用光周期计®480 ii实时系统(罗氏),根据供应商的手册。所有pcr在下列条件下进行:一个周期15分钟在95°C的激活,紧随其后的是40 10秒的周期在95°C, 30秒60°C, 30秒72°C。三种技术进行了复制三种生物复制。候选基因的相对表达的计算公式(48]。皮尔森相关分析之间FPKM和2^−ΔΔCq使用R包了。

5.9。统计分析

汇总统计的数据分析了使用IBM SPSS 19.0统计软件(Ehningen、德国)和呈现 三个复制为每个样本。统计学意义是由方差分析。值数据标有不同小写和大写字母在0.05和0.01明显不同概率水平,分别。使用软件的数据绘制GraphPad棱镜5 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。

数据可用性

为本研究可以发现生成的数据集在NCBI SRA库,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/加入,没有。SRP223620。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

SY和LY设计研究;SY、LY和詹样品制备,进行总RNA提取,RT-qPCR分析和数据收集;SY和DH RNA-seq数据执行,检测芒柄花黄素和maackiain内容和统计分析;SY和DH写的手稿;DP、RH和刘日东修订后的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

作者要感谢博士Qingxiao,夏威夷大学,编辑稿件。这项工作是由美国国家科学基金会支持的中国(批准号82060685和82060685),美国国家科学基金会的广西(2018 gxnsfaa281287和2017 gxnsfda198001号),广西创新驱动发展的基金(没有。AA17204056),该项目广西壮族和姚明民族医学重点实验室(20-065-14号),和1000名中青年骨干教师的培训计划在2020年广西高等教育机构。

补充材料

补充1。ESM_1: R2R3-MYB家庭成员的物理化学性质c .叶。

补充2。ESM_2:多个对齐101 R2R3-MYB域的氨基酸序列c .叶。

补充3。ESM_3:列表18 R2R3 MYB蛋白/基因从其他植物和报告功能。

补充4。ESM_4: 126 R2R3-MYB蛋白/基因的列表拟南芥。

补充5。ESM_5:总结R2R3-MYB总科基因及其预测函数c .叶。

补充6。ESM_6:每个主题的标志序列10守恒的主题分享R2R3-MYB亚科的蛋白质。

补充7。ESM_7:总结bgiseq - 500 RNA-Seq数据分析。

补充8。ESM_8:引物序列为RT-qPCR分析而设计的。

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