文摘

背景。小分子核糖核酸(microrna)演示了在多种恶性肿瘤表现出重要的监管角色,包括肝细胞癌(HCC)。hsa - mir - 497 - 5 - p据报道,包括在癌症的发展过程中,在多种肿瘤预后不良。然而,的表达及其临床意义hsa - mir - 497 - 5 - p在HCC尚不清楚。方法。在目前的研究中,我们调查的表达hsa - mir - 497 - 5 - p在肝癌和分析临床特征和预后的校正。的表达水平hsa - mir - 497 - 5 - p和潜在目标基因在肝癌和相邻的非癌变组织进行了分析使用癌症基因组图谱(TCGA)基因表达数据库和综合(GEO)数据集。实时定量逆转录聚合酶链反应(存在)是用于分析hsa - mir - 497 - 5 - 328肝癌组织和30 p水平搭配相邻非癌组织。总生存期(OS)和无进展生存(PFS)的肝细胞癌患者使用kaplan meier评估方法和生存率较。结果。hsa - mir - 497 - 5 - p表达水平下降,及其目标基因ACTG1 CSNK1D, PPP1CC, BIRC5调节肝细胞癌组织与正常组织相比。低水平的hsa - mir - 497 - 5 - p表达和更高水平的四个目标基因与更高的肿瘤直径显著相关。此外,较低的病人hsa - mir - 497 - 5 - p和更高的目标基因表达水平较短的操作系统。结论。的表达水平hsa - mir - 497 - 5 - p在HCC可能发挥重要的监管作用,与肝细胞癌密切相关进展,患者预后不良。hsa - mir - 497 - 5 - p可能是一个特定的治疗肝癌的治疗目标。

1。介绍

肝细胞癌(HCC),代表大约90%的原发性肝癌,是第二个最常见的癌症相关的死亡原因在全球范围内(1- - - - - -3]。几个因素发挥重要作用在肝癌的进展,包括肿瘤微环境和基因突变4- - - - - -6]。尽管不同的治疗方案,肝细胞癌的高发病率和死亡率是由于快速扩散,癌症复发和远处转移(7- - - - - -10]。因此,新的治疗靶点的识别或有用的生物标志物是急需提高肝癌的临床治疗结果。

小分子核糖核酸(microrna),一个普遍的小非编码RNA内生,可以与信使核糖核酸(mRNA)来调节靶基因表达在转录后的层面,影响许多重要的生物过程,如细胞增殖、入侵和肿瘤发生11- - - - - -13]。大量的研究表明,microrna是与肝细胞癌发生和发展紧密相关14- - - - - -16]。此外,一些研究表明,microrna的扮演角色致癌基因或肿瘤抑制,可以用来预测生物标志物和治疗在临床应用的目标(17- - - - - -20.]。

hsa - mir - 497 - 5 - p位于人类染色体17 (17 p13.1)和来自miR-15家族21]。hsa - mir - 497 - 5 - p是在体内广泛分布,及其表达水平是密切相关的不良预后和肿瘤进展(22- - - - - -24]。结果表明,过度的hsa - mir - 497 - 5 - p可以调节Smad3的表达,导致细胞周期阻滞于G0 / G1期[25- - - - - -27]。超表达mir - 497 - 5 - p的内容可以减少胰岛素受体和HFD-MES诱导胰岛素抵抗大鼠(28- - - - - -30.]。此外,mir - 497 - 5 - p的表达与肝细胞癌的发生和发展有关。张等人报道,mir - 497 - 5 - p是调节肝细胞癌样本,和高表达mir - 497 - 5 - p导致肿瘤大小和数量的增加。更重要的是,mir - 497 - 5 - p的沉默会抑制肝癌细胞增殖和迁移31日]。相反,徐等人报道,mir - 497 - 5 - p在肝癌临床样本和细胞株表达下调,和低表达mir - 497 - 5 - p与侵略性的肿瘤特征以及病人的肝细胞癌患者的预后(32]。因此,它仍然是有争议的mir - 497 - 5 - p是否致癌基因和肿瘤抑制基因在肝细胞癌。

的差别,我们发现对这些mir - 497 - 5 - p与肿瘤发生密切相关,在肝细胞癌预后不良。这项研究的目的是分析mir - 497 - 5 - p的表达及其潜在目标基因以及其功效在总生存期(OS)和肝细胞癌患者的无进展生存(PFS)通过生物信息学分析和逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR),讨论其潜在的临床意义。

2。材料和方法

2.1。病人和样品

新鲜肝癌肿瘤组织样本和邻近的正常组织收集通过手术切除2004年8月至2014年9月。共有328名原发性肝癌样本收集,包括肿瘤和相邻nontumor肝组织,其中30与相邻正常组织。已经认可了这个研究机构研究上海第十人民医院伦理委员会批准。shsy - iec - 2019 K10)。所有的参与者提供书面知情同意之前的调查研究。

2.2。数据检索和下载

RNA表达数据的肝癌病人,TCGA (https://cancergenome.nih.gov/)、地理(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)数据库选择进行分析。的测序数据372肝癌组织和正常组织的microrna的表达是从TCGA采购的。microrna的原始数据从三个地理数据集(GSE36915、GSE97098 GSE31383)下载。hsa - mir - 497 - 5的表达- p在肝细胞癌组织和邻近正常组织进行了分析。癌症细胞系百科全书(CCLEhttps://portals。http://broadinstitute.org/ccle)是用于验证的表达和DNA甲基化mir - 497 - 5 - p在肿瘤细胞系。

2.3。度筛选和生存分析

肝癌样本和非癌变组织之间的度是决定使用磨边机软件包[33]。 或≤0.5和 被选为初级筛选参数的聚类分析。层次聚类被用来屏幕度的多个实验观众(兆电子伏)4.7.1软件程序(http://www.tm4.org)。在那之后,我们进行了生存分析,分析使用GraphPad棱镜8.0.1 (http://www.graphpad.com/)软件。

2.4。RNA分离和定量逆转录酶聚合酶链反应

总RNA肝癌细胞株隔绝,肿瘤样本,和正常组织样本的试剂盒试剂(美国表达载体,沃尔瑟姆,MA),根据制造商的指导。获得cDNA从总RNA逆转录和mir - 497 - 5 - p的存在得到使用TaqMan microrna存在工具包(HaiGene,哈尔滨,中国)。每个样本都应独立测试至少一式三份。U6小核RNA用于内部控制。的表达水平mir - 497 - 5 - p和四个潜在目标基因在每个样本计算和表达ΔCt值,2−ΔΔCT方法应用于分析相对hsa - mir - 497 - 5 - p的表达水平。

2.5。细胞系

人类肝癌行Huh7 Hep3B, HepG2购自中国科学院细胞银行(中国上海)和在媒体DMEM培养(美国卡尔斯巴德英杰公司)和补充了10% ( )胎牛血清(的边后卫),100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升。细胞系是常规检测支原体污染和与短串联重复验证分析。细胞培养是由37°C湿润有限公司5%2孵化器。

2.6。细胞增殖检测

细胞增殖检测,1000个细胞被播种到96孔板在一夜之间文化。接下来,CCK8 (10 l)试剂被添加到每个好,吸光度( )后以450海里1 h,相对细胞生存能力率计算。所有实验进行了一式三份。

2.7。生物信息学分析

分层聚类是使用多个实验执行查看器(兆电子伏)4.7.1软件程序(http://www.tm4.org/mev/)。我们使用在线目标基因预测软件DIANA-miRPath (http://http://snf - 515788. vm.okeanos.grnet.gr/),miRDB (http://mirdb.org/miRDB/),miRTarBase (http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)和米兰达(http://www.microrna.org)预测几个潜在的目标基因hsa - mir - 497 - 5 - p。随后,预测目标基因受到KEGG通路在线分析。四个潜在目标基因的表达水平在LIHC获得GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/)。

2.8。统计分析

统计分析是由GraphPad棱镜(http://www.graphpad.com/)软件。总生存期(OS)和无进展生存(PFS)被kaplan meier曲线,评价和存活率差异使用生存率较检查。操作系统计算从诊断的第一天到最后一次随访的时间或死亡。PFS被评估为区间随机分配到第一个记录疾病进展或死亡,因为任何原因。

3所示。结果

3.1。聚类分析在HCC microrna的表达

372年共有2166 miRNA-seq数据LIHC癌症患者组织(癌症)和50例邻近正常组织(正常)从TCGA下载。符合标准的基因 或≤0.5和 值< 1.0 - - - - - -10。95度LIHC之间的选择和控制样本,这是62年由调节基因和33个表达下调的基因。层次聚类分析的热图是获得通过使用MEV4.7.1软件(图1)。


图1
聚类分析在HCC microrna的表达。聚类分析的microrna的表达肝细胞癌是由软件(版本4.7.1)兆电子伏。
3.2。度在肝细胞癌的表达与预后

根据褶皱变化,显示在图2microrna的表达水平在前20度(前10 -和表达下调基因)LIHC组织与相应nontumor正常组织。


图2
前20度在肝细胞癌的表达水平。符合标准的基因 或≤0.5 值< 1.0 - - - - - -10。

此外,有372 LIHC样品完成总生存期(OS)信息;前20名的六度与患者的预后相关(图3)。

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图3
前20名的六度与肝细胞癌患者的预后有关。总生存期(OS)的前20度评估的kaplan meier曲线,和存活率差异使用生存率较检查。

接下来,从GEO数据库提取原始数据(GEO加入。GSE36915)。在本研究中,我们研究了microrna的表达水平在肿瘤组织和正常组织的89名肝癌患者。十大度microrna筛选使用MEV4.7.1软件(图4(一))。因此,我们发现三度(hsa - mir - 497 - 5 - p, hsa - mir - 139 - 5 - p,和hsa - mir - 139 - 3 - p)也显著度TCGA-LIHC数据库。此外,三度也高表达的肿瘤组织与正常组织相比(数字4 (b)- - - - - -4 (d))。

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图4
mir - 497 - 5 - p的水平表达肝癌样本。(一)前十度microrna筛选使用MEV4.7.1软件。mir - 497 - 5 - p (b), mir - 139 - 5 - p (c),和mir - 139 - 3 - p (d)也高表达的肿瘤组织与正常组织相比。(e)前二十度之间选择肝癌和控制样品。(f)的表达水平,mir - 497 - 5 - p明显高于在肝癌组织与nontumor组织。

进一步识别的可靠性microrna基因相同的分析是用于验证下一个数据集从NCBI GEO数据库(GEO加入。GSE31383)。前二十度之间选择肝癌和控制样品(图4 (e))。我们的结果表明,mir - 497 - 5 - p的表达水平明显高于( )在肝癌组织中与nontumor组织(图4 (f))。

3.3。mir - 497 - 5 - p的水平表达肝癌样本

mir - 497 - 5 - p的含量表达式进行评估肝癌样本( )与正常样本( )中存在。在肝细胞癌组织标本,结果表明,mir - 497 - 5 - p的表达水平明显表达下调与相邻的非癌变组织( ;FC, 0.36;图5(一个))。

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图5
联系mir - 497 - 5 - p的表达与肝细胞癌的预后和临床特征。(a)的表达水平,mir - 497 - 5 - p明显表达下调与相邻的非癌变组织。(b)显著降低mir - 497 - 5 - p在人类肝细胞癌标本与相邻的非癌变标本。(c)皮尔森相关mir - 497 - 5 - p在肝细胞癌肿瘤组织与邻近的正常组织。(d, e)低mir - 497 - 5 - p PFS差的表达显著相关(d)和操作系统(e)。(f, g)肿瘤直径与PFS的持续时间降低显著相关(f)和操作系统(g)的肝癌患者。(h i)患者mir - 497 - 5 - p水平低和大型肿瘤直径(≥5厘米)与短PFS (h)和操作系统(i)。

评估mir - 497 - 5 - p的表达水平分为肝细胞癌和正常组织,我们检测到肿瘤组织的表达在30双和相邻的非肿瘤的肝组织使用中存在。特别是,目前的结果表明显著降低mir - 497 - 5 - p在人类肝细胞癌标本与相邻的非癌变标本( ;FC, 0.16;图5 (b))。

随后,进一步分析之间的皮尔逊相关mir - 497 - 5 - p在肝细胞癌肿瘤组织与邻近正常组织是负相关( ;图5 (c))。

3.4。联系mir - 497 - 5 - p的表达与肝细胞癌的预后和临床特征

进一步确定的预后意义mir - 497 - 5 - p表达肝细胞癌,GraphPad软件被用来评估协会mir - 497 - 5 - p progress-free生存之间的表达式(PFS)和总生存期(OS)。结果表明,低mir - 497 - 5 - p与贫穷PFS(图表达明显相关5 (d)(图)和操作系统5 (e))。因此,mir - 497 - 5 - p水平显著相关的概率增加PFS和操作系统在肝细胞癌患者。

我们的结果进一步表明,肿瘤直径明显与PFS(图的持续下降5 (f)(图)和操作系统5 (g))的肝癌患者。生存分析显示,mir - 497 - 5 - p水平和肿瘤直径也发现关心PFS和操作系统。是观察到患者mir - 497 - 5 - p水平低和大型肿瘤直径(≥5厘米)与短PFS和操作系统比高mir - 497 - 5 - p表达式和小肿瘤直径(数字5 (h)和5(我))。

3.5。表达和生物作用mir - 497 - 5 - p在肝细胞癌在体外

探索的表达式和生物作用mir - 497 - 5 - p表达肝细胞癌在体外,我们进行了DNA甲基化分析mir - 497 - 5 - p在癌症细胞系的癌症细胞系百科全书(CCLE)数据集,发现DNA甲基化分析,mir - 497 - 5 - p在大多数肿瘤细胞系(图很低6(一))和肝癌细胞系(图6 (b))。mir - 497 - 5 - p的表达水平在肝癌细胞株Huh7 Hep3B, HepG2显著低于正常肝细胞株LO2从地理数据集GSE71108(图6 (c))。

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表达和生物作用mir - 497 - 5 - p在肝细胞癌在体外。(a)的DNA甲基化mir - 497 - 5 - p在癌症细胞系的癌症细胞系百科全书(CCLE)数据集。(b)的DNA甲基化mir - 497 - 5 - p在28肝癌细胞系CCLE数据集。(c) mir - 497 - 5 - p的表达水平在正常肝细胞株LO2和4从地理数据集GSE71108肝癌细胞系。(d)中存在的水平测量mir - 497 - 5 - p在Huh7 mRNA,前后Hep3B, HepG2细胞过度的mir - 497 - 5 - p。数据显示 三个独立的实验。(e) Huh7、Hep3B HepG2细胞计数在96孔板与消极的控制或转染后mir - 497 - 5 - p表示天超表达质粒。统计分析与单向方差分析( , ,和 比正常)。

调查的生物作用mir - 497 - 5 - p在肝癌细胞中,我们使用的功能执行的研究mir - 497 - 5 - p在Huh7过表达质粒,Hep3B, HepG2细胞(图6 (d))。如图6 (e)过度,mir - 497 - 5 - p显著地抑制Huh7的增长率,Hep3B, HepG2细胞转染mir - 497 - 5 - p过表达质粒与消极control-transfected细胞。

3.6。联系mir - 497 - 5 - p目标基因表达和与肝细胞癌预后的临床特征

接下来,我们寻找潜在目标基因mir - 497 - 5 - p使用四个公开的目标基因预测数据库包括DIANA-miRPath miRDB miRTarBase,米兰达预测的潜在目标基因mir - 497 - 5 - p。

结果表明,一般有125预测目标基因在至少3预测结果。随后,预测目标基因受到KEGG通路分析,结果显示一些重要的癌症和stem-related通路包括河马信号通路,TGFb信号通路,Wnt信号通路(图7(一)),4基因(ACTG1, CSNK1D、PPP1CC BIRC5)都集中在河马信号通路。此外,ACTG1的信使rna表达水平,CSNK1D PPP1CC, BIRC5显著降低,mir - 497 - 5 - p超表达组与对照组相比(图7 (b)),这表明,ACTG1 CSNK1D, PPP1CC, BIRC5受mir - 497 - 5 - p和负相关,mir - 497 - 5 - p。

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图7
联系mir - 497 - 5 - p目标基因表达和与肝细胞癌预后的临床特征。(一)mir - 497 - 5 - p目标预测使用在线目标基因预测项目DIANA-miRPath miRDB, miRTarBase,米兰达KEGG共同预测目标基因的分析。(b)中存在被用来测量四个预测目标基因的mRNA水平ACTG1, CSNK1D, PPP1CC, BIRC5 Huh7, Hep3B, HepG2细胞转染后负控制或mir - 497 - 5 - p超表达质粒。(c)表达水平的ACTG1、CSNK1D PPP1CC, BIRC5在正常肝脏( )和肝癌( )样本GEPIA数据集。(d) mir - 497 - 5 - p的相关性与目标基因表达水平ACTG1, CSNK1D, PPP1CC, BIRC5肝癌样本( )TCGA的数据集。(e) kaplan meier生存分析评估ACTG1的预后价值,CSNK1D, PPP1CC, BIRC5表达式OS TCGA HCC患者的数据集。统计分析与单向方差分析( 和 )。

接下来,我们分析了ACTG1的表达水平,CSNK1D, PPP1CC, BIRC5 HCC在正常肝组织样本( )和肝癌( )样本GEPIA数据集。ACTG1、CSNK1D PPP1CC, BIRC5水平调节肝细胞癌组织( )(图7 (c))与正常肝组织相比。CSNK1D,此外,我们的研究结果表明,ACTG1 PPP1CC, BIRC5表达式是负相关,mir - 497 - 5 - p表达肝细胞癌肿瘤活组织检查( , ,-0.29、-0.24和-0.33,分别 ;图7 (d))。

然后我们评估ACTG1的预后价值,CSNK1D, PPP1CC, BIRC5表达肝细胞癌患者。操作系统在肝细胞癌患者的低表达ACTG1, CSNK1D, PPP1CC,或BIRC5长期相对于患者的高表达ACTG1, CSNK1D PPP1CC或BIRC5(图7 (e))。CSNK1D,我们的研究结果表明,ACTG1 PPP1CC, BIRC5表达呈正相关,降低肝癌病人的操作系统。

4所示。讨论

肝细胞癌是第五个世界上最常见的癌症类型(33- - - - - -36]。肝细胞癌的传统治疗策略是彻底的切除,但复发非常高,5年生存率低(37- - - - - -41]。因此,肝细胞癌的预后仍不满意。在过去的几年中,由于组合的应用分子生物学技术和肿瘤组织学检查,已经取得了伟大的进展的疾病(42- - - - - -46]。microrna被认为是理想的生物标志物与其他生物相比,microrna在临床诊断和治疗有足够的灵敏度(47- - - - - -50]。

到目前为止,许多研究已经证明,microrna的表达谱在肝癌和nontumor组织明显不同(51- - - - - -54]。某些microrna如miR-21, mir - 221, mir - 222经常在肝细胞癌(55- - - - - -62年]。这些microrna已经证明了促进肿瘤形成的负调节重要的肿瘤抑制蛋白编码基因在肝细胞癌(63年- - - - - -67年]。另一方面,microrna如mir - 122, mir - 125 b, mir - 139, mir - 101, let-7地表达下调在肝细胞癌(68年- - - - - -72年]。这些microrna起到肿瘤抑制作用,抑制致癌基因在肝细胞癌(73年- - - - - -75年]。microrna的放松管制是一个早期事件,可以发现在肝脏癌变前的发育异常的结节,而且可以进一步积累在肝脏致癌作用[76年- - - - - -79年]。

有趣的是,其他研究显示存在大量稳定的microrna在人类血清/血浆中,这对学习的作用奠定了基础血清/血浆microrna在肝细胞癌的诊断和预后80年- - - - - -83年]。差几个血清microrna的表达,包括miR-16 miR122, miR-21, mir - 223, miR-25, mir - 375, let-7f,肝癌患者,乙型肝炎患者和健康人是近日报道84年- - - - - -87年]。

的异常表达mir - 497 - 5 - p在肿瘤发生中起着至关重要的作用。mir - 497 - 5 - p已被证明是表达下调在非小细胞肺癌,胃癌、结直肠癌、卵巢癌、肾细胞癌、黑色素瘤(88年- - - - - -95年]。此外,在体外和体内研究表明,mir - 497 - 5 - p过度抑制肝癌细胞增殖,集落形成和转移96年]。因此,临床价值的更全面的了解mir - 497 - 5 - p在肝细胞癌,我们使用生物信息学和存在化验调查mir - 497 - 5 - p的表达水平在肝细胞癌组织,以及它与整体生存和progress-free生存。

在我们目前的研究中,来自TCGA地理数据库和数据库的原始数据集被用来分析mir - 497 - 5 - p HCC患者的表达式。结果表明,mir - 497 - 5 - p的表达水平显著表达下调与相邻正常组织相比,肝细胞癌。进一步的相关研究表明,肝癌低mir - 497 - 5 - p的表达与短的操作系统和不良预后显著相关。此外,我们使用定量实时PCR检测的表达hsa - mir - 497 - 5 - p在肝活检和paracancerous组织。这个发现符合我们前面分析数据;mir - 497 - 5的表达水平在HCC - p明显表达下调与相邻的非癌变组织。此外,低表达hsa - mir - 497 - 5 - p与贫穷相关临床病理的特点,如操作系统和PFS短。此外,相关性hsa - mir - 497 - 5 - p的表达和临床字符显示hsa - mir - 497 - 5 - p和积极差别表达对这些基因与肿瘤直径与操作系统和PFS和消极的联系。我们的结论与之前的研究相一致;hsa - mir - 497 - 5 - p被认为是一种肿瘤抑制,从而抑制肿瘤细胞的增殖和入侵肝细胞癌和非小细胞肺癌97年- - - - - -99年]。这些结果阐明,hsa的角色——mir - 497 - 5 - p对肿瘤抑制作用在临床肝癌样本。

总之,我们目前的研究澄清的临床和预后意义hsa - mir - 497 - 5 - p在肝细胞癌。hsa - mir - 497 - 5的表达- p不仅在发展中起着重要作用和肝细胞癌的进展还可以作为一个潜在的对肝癌病人诊断的生物标志物。结果还暗示hsa - mir - 497 - 5 - p可能是一种很有前途的和特定的治疗目标电感器的超表达;细胞水平的mir - 497 - 5 - p可能是一个新的临床治疗肝癌的治疗策略。

数据可用性

所有生成的数据或分析在本研究中包括这篇文章。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

玲玲田,本钱,江肖惠,Yu-Shan刘贡献同样这项工作。

确认

本研究支持部分由中国国家自然科学基金(81972214,81972214,81972214,81201535,81302065,81671716,81372175,81472209),基础研究基金为中央大学(22120170212)、上海自然科学基金(20 zr1472400),上海市卫生和计划生育委员会(201540228),吴Jieping医疗基金会(320.6750.14326),南通科技项目(JC2018125)。