协会OTX1rs17850223在汉族特发性癫痫患者中的多态性

摘要

本研究旨在探讨正牙本质同源盒1的相关性(OTX1)汉族人群的基因多态性与特发性癫痫。我们对147例特发性癫痫患者和150例健康对照者进行了病例对照研究。从1 ml经乙二胺四乙酸（EDTA）处理的血液中提取基因组DNA。这个OTX1将编码序列分成三部分，用PCR扩增，用Sanger测序法对产物进行基因分型。全部OTX1编码序列除了位于第五外显子上的rs17850223外均保守。特发性癫痫患者与对照组的CC、CG和GG基因型频率无统计学差异。rs17850223 G等位基因在原发性癫痫患者和对照组之间的分布也相似。有趣的是，GG基因型在全身性癫痫患者中的频率明显高于对照组（分别为12.2%和2%， ),与对照组相比，全身性癫痫患者中rs17850223 G等位基因的分布也更广（18.3%对10%， ).rs17850223可能在中国特发性癫痫患者全身性癫痫活动中起重要作用。

1.介绍

癫痫是脑的慢性间断非传染性疾病，由于异常过度的或同步的神经元活动。这种疾病会影响约50万人在世界范围内，和原发性癫痫代表了广大癫痫发作疾病[1个–三]. 越来越多的证据表明遗传因素在特发性癫痫的发展中起着关键作用；这些发现主要是基于流行病学的研究，包括家族聚集、单卵双胞胎和有癫痫病史的家族[4个–6个]。

Orthodenticle同源框1（OTX1)是其中一个同源盒基因，属于第一项家庭(OTX1,OTX2,OTX3，和CRX）7个,八]。该OTX1基因编码对靶基因上的TAATCC/T元件具有高亲和力的转录因子[9个]参与胚胎发生过程中的大脑区域化、皮质生成和器官发育感觉[10]。OTX1表达逐渐下降，但在成熟的大鼠的深皮质层[保持在检测水平11]。该OTX1突变体小鼠显示出一个圆圈运行行为，这显示出由上肢阵挛例举自发的癫痫发作，饲养，下降，和惊厥开始于第四产后周[12]。在这些小鼠中，在皮质中的神经元群体中抽搐发作显示异常电活动[13]。

本研究的主要目的是评估的多态性OTX1基于这些多态性有可能预测癫痫的假设，中国患者队列中的编码序列。

2.患者和方法

2.1。病人

自2015年7月至2018年7月，我院共收治特发性癫痫患者147例，健康人121例。所有患者均符合国际癫痫联盟特发性癫痫分类的要求[14]。患有其他可能与大脑结构改变有关的合并症的患者，如颅内肿瘤、脑血管疾病、代谢性脑病、痴呆、语言障碍和活动障碍，均被排除在外。对照组中没有人有中枢神经系统紊乱或任何其他疾病的病史。

2.2。DNA提取和基因分型

我们使用QIAamp DNA小型试剂盒（Qiagen，批号51304）从EDTA抗凝血样中纯化基因组DNA。DNA提取后，用NenoDrop2000（Thermo）检测DNA的浓度和纯度。可接受260/280比值约为1.8且浓度大于50 ng/ml的DNA。利用primer 5软件设计引物序列。如果设计的引物不能进行第一次扩增，我们对其他引物进行了检测，选择了最佳的引物进行扩增。这个OTX1编码序列，分为3个部分（图1（甲）)并使用PrimeSTAR®Max DNA聚合酶（Takara，批号R045Q）进行PCR扩增。PCR反应管（50 μl） 包括25 μ超级巨星麦克斯预混片的l, 4μ引物长(0.25μM), 2μl的基因组DNA模板(100ng)， 19μl无核酸酶水(Thermo, AM9932)按照PrimeSTAR®Max DNA聚合酶手册的说明。所有扩增均在98℃条件下进行。将DNA在98℃变性5min, 98℃循环10s, 60℃循环15s, 72℃循环60s(共32个循环)，72℃循环10min(保存)。为OTX1放大，我们也放大β-肌动蛋白（约500 bp）为阳性对照，无核酸酶水为阴性对照。幸运的是，β-肌动蛋白扩增在OTX1扩增的三个部分中普遍存在。PCR产物送上海赛默飞世尔有限公司进行Sanger测序和分析。表中列出了用于PCR和测序的引物序列1个。

2.3条。统计分析

变量被描述为平均值和标准偏差或比例。使用卡方分析法分析有和无原发性癫痫参与者之间的差异。一个的<0.05值被认为是统计学显著。所有统计分析使用SPSS软件17（IBM，卡里，NC）进行。动力分析采用电源和样本量计算软件（进行http://powerandsamplesize.com/Calculators/).该OTX1对照组基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（HWE）。一个的> 0.05的值表示HWE。

三。结果

共147例原发性癫痫患者符合纳入标准，纳入本研究。平均年龄为39.2岁（19.8-55.2岁），男女比例为66-81，癫痫持续时间为4.1年（0-32岁）。111例出现全身性癫痫，46例出现局灶性癫痫。特发性癫痫患者的人口学和临床特征如表所示2个. 同时招募150名年龄和性别相匹配的健康人作为对照组参加研究。

经过反复PCR扩增和基因分型，在exon-5中发现一个单核苷酸多态性(SNP)，该位点的基因序列为CACTCACATCACCACCCGCACCAGCT[C/G] AGCCCCATGGCACCCTCCTCCATGC (Figure)1（b）). 在SNP数据库中对该序列进行了爆破后，发现SNP编号为rs17850223。

对照组rs17850223多态性基因型分布与HWE一致( ),说明我们的研究群体来自孟德尔群体，具有很好的代表性。如表所示三，进一步的分析表明，有在基因型频率或rs17850223等位基因G ^分布患者之间没有差异显著患有​​自发性癫痫和对照个体。

在比较广义惊厥患者与对照组之间的差异时，我们发现广义惊厥患者的GG基因型频率明显高于对照组(12.2%比2%， ),与对照组相比，全身性癫痫患者rs17850223 G等位基因的分布也更广( )（表4个).然而，在基因型频率或rs17850223等位基因G ^分布中的患者局部癫痫发作和对照之间没有发现差异显著（表5个).

4.讨论

癫痫是一种主要的神经状况所引发的破坏异常电化学活动的大脑。特发性癫痫主要由遗传因素引起，无明显的脑结构损伤或神经系统异常[4个–6个]。该OTX1该基因编码含有转录因子的同源结构域的二倍体亚家族的一个成员。编码蛋白作为一种转录因子，可能在大脑和感觉器官的发育中起作用[15,16]。早期的动物研究表明OTX1空白小鼠出现自发性癫痫发作，表现出主要影响整个背侧端脑皮层的异常，在颞叶和鼻炎周围区域的影响更为明显[12,17]。最近，Zhang等人发现OTX1表达对大脑皮层V层锥体细胞的树突形态、内在电生理和突触动力学的正常发育至关重要[18]。与此一致，另一项使用双标记镶嵌分析的研究发现OTX1在皮质祖细胞敲除减少皮层神经元[的单一输出19]。

之前的基础研究考虑到了这一点OTX1效力于大脑的发育和进化至关重要的作用，其对癫痫有保护作用。然而，之间的关系OTX1原发性癫痫的基因和患者尚未得到彻底的研究。根据我们的结果，与对照组相比，患有全身性癫痫的特发性癫痫患者的rs17850223突变数量显著增加。癫痫患者G G基因型和rs17850223g等位基因频率明显高于对照组。对SNP数据库进行爆破后，发现同源密码子为CTC，部分癫痫患者存在CTG突变。然而，CTC和CTG编码相同的氨基酸（L-亮氨酸），这表明是同义突变。

由于遗传密码的简并性，在基因编码区域发生的同义突变不会改变编码蛋白质的氨基酸组成。然而，证据表明同义突变也可能产生功能性后果[20–24]可能导致异常的mRNA剪接导致人类疾病[20]。研究还表明，同义的SNP可能影响mRNA的稳定性，因此蛋白的表达和酶活性[21]. 此外，SNPs还可以影响蛋白质构象，从而产生功能和临床效应[22]。

我们的研究结果表明rs17850223在全身性癫痫发作患者中起关键作用。然而，这项研究有一些局限性。首先，相对较少的患者可能导致假阳性结果，特别是考虑到在遗传研究中，样本量是一个决定性因素。第二，我们评估的多态性OTX1编码区，但没有评估非编码区，这也可能在特发性癫痫中发挥作用。此外，应在具有不同种族和族裔背景的其他人群中验证所确定的联系。由于这是一项初步的研究，所以应该进行更多的研究，在更大的不同种族患者队列中观察整个基因序列，以阐明OTX1多态性与癫痫。

总之，本研究比较了OTX1基因多态性与中国汉族汉族人原发性癫痫。我们发现，rs17850223可能在患者起着至关重要的作用与全身性发作。这项研究的结果提供了关于患者患有自发性癫痫癫痫发作的产​​生新的认识。

数据可用性

本文包含了支持本研究结果的数据。

的利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

致谢

笔者想感谢借光陈（温州医科大学）提出了这个数据分析。我们也感谢在临床实验室技术人员，凌云李，吕雷利和友发丁，谁与实验帮助。本研究是由丽水的公共项目（批准号。2017ZDXK03）由丽水科技局，资助这项工作的数据分析和材料贡献提供。

工具书类

1. 世界卫生组织（WHO）癫痫：公共卫生势在必行，世界卫生组织，日内瓦，2019年，许可证：CC BY-NC-SA 3.0 IGO。
2. G、 S.Bell和J.W.Sander，“CPD——癫痫流行病学的教育和自我评估：问题的大小，”癫痫发作，第10卷，第4期，第306-316页，2001年。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
3. 国际抗癫痫联盟癫痫发作类型的业务分类:ILAE分类和术语委员会的立场文件，"癫痫，第58卷，第4期，第522-530页，2017年。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
4. D.埃斯卡兰特-圣地亚哥，I. A.博览会-Romero的，R. M.里巴斯-Aparicio等人，“MDR-1和MRP2在墨西哥癫痫儿科患者复杂部分性发作基因多态性，”神经科学前沿卷。5，P。184 2014。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
5. D、 C.Rojo，L.Hamiwka，J.M.McMahon等人，“婴儿迁移性部分癫痫发作中的新SCN1A突变，”神经内科卷。77，没有。4，第380-383，2012。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
6. A. Rozycka, B. Steinborn和W. H. Trzeciak，“CHRNA4的1674+11C>T多态性与青少年肌阵挛性癫痫有关，”癫痫发作，第18卷，第8期，第601-603页，2009年。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
7. A、 Simeone，E.Puelles和D.Acampora，“Otx家族”遗传学与发展的最新观点卷。12，没有。4，第409-415，2002。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
8. M. G. Nielsen, E. Popodi, S. Minsuk，和R. A. Raff，“直接发育海胆的五分体成年雏形中Otx表达的进化收敛，”发育基因与进化，第213卷，第2期，第73-82页，2003年。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
9. W、 H.Klein和X.Li，“Otx蛋白质的功能和进化”生物化学和生物物理学研究通讯，第258卷2，第229-233页，1999。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
10. D.阿坎波拉，M. P. Postiglione的，五Avantaggiato，M.迪鲣鱼和A.西蒙尼，“在大脑发育OTX和OTP基因的作用，”国际发育生物学杂志，第44卷，no。第669-677页，2000。查看位置：谷歌学术搜索
11. G、 Frantz，J.Weimann，M.Levin和S.McConnell，“Otx1和Otx2定义了大脑皮层和小脑发育的层次和区域。”神经科学杂志，第14卷第1期10，页5725-5740,1994。查看位置：谷歌学术搜索
12. D、 Acampora，S.Mazan，V.Avantagiato等人，“缺乏Otx1基因的小鼠癫痫和大脑异常，”自然遗传学，第14卷，第2期，第218-222页，1996年。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
13. D、 Acampora，P.Barone和A.Simeone，“皮质发生和大脑发育中的Otx基因”大脑皮层1999年，第9卷，第6期，第533-542页。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
14. 国际抗癫痫联盟分类和术语委员会，“癫痫病和癫痫综合征修订分类提案”癫痫，第30卷，第389-399页，1989年。查看位置：谷歌学术搜索
15. M、 R.Panto，A.Zappala，F.Tuorto和F.Cicirata，“Otx1基因在哺乳动物皮层细胞分化中的作用”欧洲神经科学杂志，第19卷，第10期，第2893-29022004页。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
16. G、 Sancini，S.Franceschetti，T.Lavazza等人，“皮层NMDA和GABA介导的Otx1神经传递的潜在致痫性功能障碍”^-/-老鼠。”欧洲神经科学杂志，第14卷第1期7，页1065-1074,2001。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
17. J、 M.Weimann，Y.A.Zhang，M.E.Levin，W.P.Devine，P.Br戥let和S.K.McConnell，“皮层神经元需要Otx1来细化对皮层下靶点的大量轴突投射。”神经元，第24卷，第4期，第819-8311999页。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
18. Y. F.章，L. X.柳，H. T. Cao等人，“促进OTX1基础树枝状生长，并调节在小鼠运动皮层V层的锥体神经元的电生理特性和突触属性，”神经科学，第285卷，第139-154页，2015年。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
19. P、 Gao，M.P.Postiglione，T.G.Krieger等人，“新皮质神经元的确定性祖细胞行为和单一性产生”细胞卷。159，没有。4，第775-788，2014。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
20. L. Cartegni, S. L. Chew和A. R. Krainer，《倾听沉默和理解无意义:影响剪接的外显子突变》遗传学自然评论，第3卷，第4期，第285-2982002页。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
21. A、 G.Nackley，S.A.Shabalina，即Tchivileva等人，“人类儿茶酚-O-甲基转移酶单倍型通过改变mRNA二级结构调节蛋白质表达，”科学卷。314，没有。5807，第1930至1933年，2006年。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
22. C、 Kimchi Sarfaty，J.M.Oh，I.W.Kim等人，“MDR1基因中的一个“沉默”多态性改变了底物特异性，”科学，第315卷，第5811号，第525-5282007页。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
23. Z. E.桑拿和C.泡菜Sarfaty，“了解同义突变与人类疾病的贡献。”遗传学自然评论，第12卷，第10期，第683-6911911页。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索
24. K、 Ogasawara，K.Sasaki，K.Isa等人，“日本弱D等位基因：约960G>影响D表达的RHD基因第7外显子沉默突变，”肝病杂志，第110卷，第2期，第179-184页，2016年。查看位置：出版商网站|谷歌学术搜索

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