文摘
lncRNAs收购增加相关性作为广泛的生物过程的监管机构。极端异质性在这些分子的作用机制,然而,使他们很难研究,特别是关于其分子功能。小说lncRNA最近被确定为最丰富记录鼠标发展甲状腺。由于其基因组定位编码Klhl14基因反义,我们叫它Klhl14-AS。在这篇文章中,我们强调鼠标Klhl14-AS产生至少5剪接变体,其中一些还没有先前描述。Klhl14-AS表达一种特殊的模式,其特点是不同亚型的相对丰度在不同的老鼠组织。我们检查整个表达式的Klhl14-AS水平的成年小鼠组织,表明它是表达在甲状腺,肺、肾、睾丸、卵巢、大脑和脾脏,尽管在不同级别。原位杂交分析显示,各器官的上下文中,Klhl14-AS显示细胞特定类型的表达式。有趣的是,人类Klhl14-AS数据库报告类似的表达谱。这我们的观察表明,lncRNA可以在多个器官和细胞特定类型角色铺平道路的功能描述这个基因在适当的生物环境。
1。介绍
在过去的几年里,不同物种基因组比较突出,在进化规模,有机体的复杂性与非蛋白编码的程度直接相关(以下简称非编码)总基因组的分数(1,2]。此外,发现绝大多数基因组转录表明真核转录组的非编码部分很大程度上超过了蛋白质编码,在丰富和复杂性(3,4]。这些观察和积累的证据大量rna介导基因调控网络,强烈建议,因此,非编码rna是关键球员在建立生物复杂性2,5]。
非编码rna主要分类根据其长度成小和长非编码rna (lncRNAs)。LncRNAs RNA分子超过200个核苷酸,没有任何明显或守恒的开放阅读框。他们通常5′封顶,描述了腺苷、拼接和表达水平低于蛋白编码基因,但更多的组织和特异性的方式(6- - - - - -10]。许多这样的成绩单已报告有潜在的功能直接同源不同物种,尽管低序列保护(8,11- - - - - -13]。尽管只有很少有lncRNAs功能特征(14,15],lncRNAs确认的数量在不同的细胞类型和关联不同的生物过程一直在上涨1,16,17]。这样增加强烈表明,他们有多个相当大的功能,主要是由他们与不同种类的生物分子的能力。事实上,长非编码RNA可以能够绑定到其他核酸(DNA或RNA)通过碱基配对互补序列和/或绑定到折叠蛋白质的二级结构(1,18- - - - - -20.]。然而,内在多向性的这些分子的作用机制代表了研究的重大挑战每个lncRNA的功能作用。
最近很差的特征基因,报告为长非编码RNA,成为最丰富E10.5小鼠甲状腺芽转录组,比整个胚胎(21]。我们所知,只有少数数据文献中关于这种基因存在,本质上是基于全基因组表达分析lncRNAs在鼠标9]。我们首先将其命名为Thybe1(甲状腺芽丰富1);然而,基因定位的分析显示,它与蛋白质编码基因反义和部分重叠Klhl14交头接耳地安排;因此,一个更标准的名字可以Klhl14-AS这个基因。在本文中,我们分析了Thybe1 / Klhl14-AS表达模式在成年小鼠组织内,通过定量实时逆转录酶——(qRT) PCR及原位杂交(ISH)。我们还确定未知的拼接亚型的基因在小鼠和人类Klhl14-AS探索可用数据表达,从而提供一个重要的贡献这本小说lncRNA的表征。
2。结果与讨论
2.1。基因组组织和识别替代鼠标Klhl14-AS基因的转录
阐明Klhl14-AS表达谱,我们看着NCBI等不同的数据库22),加州大学(23),和运用24)获得基因结构和表达的信息。老鼠基因组的基因命名4930426 d05rik和映射到染色体18 qa2报道运用。在人类基因组中,其直接同源AC012123.1命名和映射到染色体18 q12.1。对比老鼠和人类基因组上下文的轨迹揭示了地区显然是syntenic守恒并展示优质块序列。在这两个基因组,Klhl14-AS部分重叠与蛋白质编码基因Klhl14肉搏战反义安排(图1(一))。鼠标Klhl14-AS产生几种不同的成绩单(图1 (b))不同数据库之间在数量和结构(见附加图可以在网上https://doi.org/10.1155/2017/9769171),而在人类,据报道产生一个同种型(图1 (c))。我们因此被称为运用进行进一步的分析,因为它报告更多的替代记录鼠标。在图1 (b),结果表明,老鼠Klhl14-AS产生四个记录命名002 d05rik 4930426, 003, 004, 005。这些记录不同的转录起始站点和/或外显子,主要在5′一半,而四分之三的显示类似的3′末端,只有Rik04显示长3′外显子。然而,所有亚型共享三个区域显示在图1 (b)由蓝色、橙色和绿色的矩形。
(一)
(b)
(c)
在发展中甲状腺(Klhl14-AS被确认21),我们决定调查的报告记录在成年小鼠表达腺。我们这样设计合适的引物总小鼠甲状腺cDNA集和放大。令人惊讶的是,只有一个使用的益生元集,包括最内部的,引发了扩增子(见图和表年代)。这促使我们实验图5′和3′末端甲状腺亚型进行实验。为达此目的,我们开始从5′端常见的地区的蓝色盒子和3′端常见地区绿色框(图1 (b)),通过识别5′末端和腺苷3′末端(数据没有显示)。此外,我们还考虑更上游的笼子在编码网站报道,在一个地区共享大多数5′Rik002外显子和Rik005亚型。两个不同的引物设计思路是这样,从刚刚描述假定的结束。低聚糖从5′种族序列用于设置1,而低聚糖从最上游序列报告数据库是用于设置2(图(S)。对于每个益生元组,反向引物是专门设计来优化放大条件下,尽管反向引物在很大程度上是重叠的,非常密切地映射到3′末端被竞赛。rt - pcr进行低聚糖组1生产两种产品,命名为A和B,而与益生元组执行2产生三个片段,名为C, D, E(图2,见甲状腺车道)。亚型放大的序列映射到鼠标基因组(mm10)使用咩咩的叫声(见材料与方法),揭示,只有他们两个,A和D,对应于之前剪接变异特征,分别Rik004和Rik005。重要的是,我们发现三个新的亚型,B, C和E,以前没有注释(图)1 (b))。值得注意的是,我们发现一个地区只使用低聚糖组1(图放大1 (b)粉红色的矩形)。保留这个地区仅在A和B记录表明,至少存在两个不同的tss可以为这个基因。发现Klhl14-AS转录在几个不同的亚型在同一机关表明他们可以通过绑定不同的扶少团团员扮演不同的角色。此外,多个TSS的存在表明Klhl14-AS转录可能在不同条件下不同的监管。
2.2。表达谱的Klhl14-AS成年小鼠组织
我们问Klhl14-AS表示在其他器官。要回答这个问题,我们进行了上述放大描述在不同的成年小鼠组织。这种分析表明Klhl14-AS成绩单是在不同的组织差异表达,两套使用益生元放大相同的分子物种在所有测试组织(图2)。事实上,A和B亚型表达在甲状腺、肾脏、睾丸、卵巢、大脑,和脾脏,尽管在不同区段。主要是代表在睾丸和卵巢,也强烈表达在甲状腺和肾脏。B是相对更丰富的大脑比其他器官。成绩单C主要表达在甲状腺和肾脏。D是弱表达在甲状腺和肾脏,虽然只在大脑中高度表达。E代表主要是在甲状腺、睾丸、卵巢和大脑。值得注意的是,所有的标识在甲状腺转录表达,而没有记录放大由低聚糖组2表达的脾脏。最后,肝脏和心脏Klhl14-AS表达的是负面的,而肺显示微弱信号只与低聚糖组1。这些数据揭示的修复模式Klhl14-AS替代文本的表达式。
克服或者拼接同种型表达式的复杂性,我们分析了Klhl14-AS表达式使用一套引物放大所有已知亚型之间的地区是很常见的(包括重叠区域之间的共同拼接结橙色和绿色的矩形图1)。整个Klhl14-AS成人组织中表达均通过存在,表明表达的几个器官在不同区段。这种定量分析证实了lncRNA不是表现在肝脏和心脏;大脑中弱表达,肺、卵巢、睾丸;而且更强烈的表达在肾、脾、甲状腺(图3)。然而,存在,如PCR先前执行的标准,衡量的RNA在整个器官,因此错过了可能的差异不同的细胞类型在相同的器官。这一技术限制可能会导致低估Klhl14-AS出现在特定的细胞类型。要处理这个问题,我们进行了伊什分析通过使用Klhl14-AS-specific探针,可以清晰地定义lncRNA分布在特定的细胞类型。某种意义上探针被用作控制(图)。伊什进行成年小鼠的器官,而确认中存在的结果,表明Klhl14-AS细胞type-restricted的方式表达的每一个器官。正如所料,Klhl14-AS染色缺席在肝脏和心脏(图4(一))。出乎意料,Klhl14-AS染色也缺席在肺部(图4(一)),存在显示检测虽然弱的积极性(图3)。一个可能的解释是,伊什比存在检测能力较低;因此,弱的表达式可以由伊什察觉。相反,其他所有器官Klhl14-AS阳性表达里面的存在显示一个明确的信号,与特定的细胞类型之间的差异分布(图4 (b))。在甲状腺,lncRNA滤泡细胞中高度表达,代表甲状腺滤泡上皮组成部分。在肾脏,Klhl14-AS主要表达在皮质的肾小体(见200 x放大)。在脾脏,表达了白髓的圆形区域组成的淋巴细胞,而不是发现红髓(参见25 x放大)。睾丸,lncRNA表达细精管,而产生的消极的睾丸间质细胞intertubular结缔组织(见200 x放大)。在卵巢,Klhl14-AS表示毛囊,显示一个强烈的信号在排卵期前的卵泡的颗粒细胞,虽然它是负面的卵母细胞和卵泡膜细胞(见200 x放大)。图4 (c)显示大脑的伊什,Klhl14-AS表达强烈发现在海马和皮层(见200 x放大)。
(一)
(b)
(c)
我们也做了一个调查关于人类的现有数据Klhl14-AS直接同源表达模式。Gtex注释在UCSC的数据库中,RNA序列,获得的报告,lncRNA强烈表达在甲状腺但在脾弱表达,睾丸,肾皮质,输卵管(补充图)(http://bit.ly/klhl14-as)。人类Klhl14-AS重叠部分的表达式模式所示在老鼠,至少在器官表达水平最高的。观察到的差异对某些器官(如脑,卵巢)可能是由于不同的实验方法或真正的两个物种之间的差异。
保护Klhl14-AS序列和基因组织,连同部分重叠的表达模式,Klhl14-AS的暗示是一种重要的生物作用。
3所示。结论
识别的生物作用和长非编码rna的作用机制在功能基因的研究中,最具挑战性的问题,设置适当的实验模型是一个关键问题,考虑到他们的组织特异性。Klhl14-AS是第一个lncRNA甲状腺中标识,在这里,我们表明,也表达了不同的组织如肾脏和大脑。此外,我们确认之前无特征Klhl14-AS或者拼接记录和描述微分表达式模式在一些器官,表明每个同种型可以扮演特定的角色在一个给定的生理环境。事实上,的功能特异性Klhl14-AS可以通过不同的组合产生变异细胞特定类型扶少团团员可能发生在不同的组织。综上所述,我们的数据代表的起点lncRNA的描述,这可能是参与相关的生物现象,可能在不同的疾病。
4所示。材料和方法
4.1。动物实验
所有动物实验进行按照意大利和欧洲的指南和当地伦理委员会批准,由意大利卫生部。动物是维持在特定的无菌条件下的动物房设施Dipartimento di药物Molecolare e Biotecnologie Mediche。共有8个野生型两性的C57BL / 6小鼠用于分子和组织学分析。
4.2。记录的映射
5′和3′末端进行使用3′竞赛系统(英杰公司18373 - 027年)和5′竞赛系统(英杰公司18374 - 041年)根据制造商的规格。
互补脱氧核糖核酸从成年小鼠组织放大与Pwo SuperYield DNA聚合酶(罗氏04 340 850 001)利用寡核苷酸代表目的通过竞赛实验和5′益生元设计第二上游笼网站报道UCSC-Klhl14-AS笼II: CGCGTACTGCATGCGGGTCTCA, Klhl14-AS 5′竞赛:GAGAGAGGAACAACAATCAAGGC, Klhl14-AS 3′竞赛:GGGGATTAGAGTTTATTTTTGTCATCTC,和Klhl14-AS 3′种族内部:ATTCATCCAGATCACAGCTAAG。
的序列鉴定亚型FASTA格式映射到鼠标基因组(mm10)使用咩咩的叫声(https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat),以PSL格式导出的结果。PSL格式的结果上传自定义跟踪的UCSC的浏览器和转换成GTF浏览器使用UCSC的表。基因组浏览器图像生成使用运用基因组浏览器(v88)对人类(GRCh38.p10)和鼠标创建一个自定义跟踪(GRCm38.p5)和上传到可视化PCR GTF格式在老鼠基因组片段映射。基因组浏览器截图导出PDF格式,和处理的矢量图形是Inkscape (v0.48.4)。
4.3。定量实时聚合酶链反应
总RNA分离从老鼠器官如前所述25)使用试剂盒®试剂(英杰公司15596026)根据制造商的规格。每个样本对应一个器官除甲状腺。由于小鼠甲状腺体积小,两个腺体池总RNA的提取。总cDNA生成的上标®三世rt - pcr(英杰公司18080051)合成第一链系统,根据制造商的规格。实时PCR在执行总cDNA iTaq™普遍SyBR®绿色Supermix (Bio-Rad 172 - 5124)使用gene-specific oligos-Klhl14-AS F: GGCTCCTCTCCACTCACTTTC, Klhl14-AS R: TCAGCTCAGCAGCGAAGTC, Abelson F: TCGGACGTGTGGGCATT,和阿贝尔森R: CGCATGAGCTCGTAGACCTTC。
4.4。原位杂交
器官固定在4% PFA(一夜之间,4°C),在生理盐水洗,脱水在解决方案增加乙醇浓度从70%到100%(一夜之间,4°C),并在二甲苯浸泡后60°C石蜡包埋。每个步骤的时间是根据加工样品的大小决定的。
石蜡包埋切片样本在7μ米部分和分析。进行原位杂交,部分deparaffinized二甲苯和水化EtOH EtOH 50% 100%。补液后,杂交进行所述Fagman et al。21),使用特定的探测与Pwo Klhl14-AS放大SuperYield DNA聚合酶从成年小鼠甲状腺cDNA使用以下oligos-Klhl14-AS sp6: GGCTGAACAGGAAGGGACCCT Klhl14-AS T7: CAGATCACAGCTAAGAAAAAAGC。
PCR产物纯化使用USB®PrepEase®凝胶萃取设备(Affymetrix 78756)。Digoxigenin-labelled riboprobes(感觉和反义)获得使用DIG-labeling RNA工具包(瑞士巴塞尔罗氏诊断)后,制造商的指示。没有检测到信号的意义riboprobes(没有显示)。获得的图像使用Axioskop显微镜配有Axiocam 105彩色数码相机(蔡司、从、德国)。使用轴子视觉图像处理软件。
信息披露
投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。
的利益冲突
作者宣称他们没有利益冲突与这篇文章的内容。
确认
作者感谢马里奥Senesi先生的技术支持。Miriane de Oliveira支持欧盟委员会(fp7 -人- 2012国税局)之下,玛丽·居里行动(项目RNA_REGULOMICS 318981),和斗篷奖学金。这项工作是支持的意大利大学和研究(MIUR格兰特PON03PE_00060_7加布里埃尔·德·维塔)。
补充材料
补充材料的信息如下:图S1。(一)NCBI表示鼠标(上半部分)和人类Klhl14-AS轨迹(下图)。鼠标Klhl14-AS显示了两个不同的记录,而一个成绩单是人类基因的报道。老鼠和人类基因组的版本是106年,2016-06-22和108年,分别为2016-06-07。(B) UCSC的数据库报告一个记录两个鼠标(上半部分)和人类Klhl14-AS(下图)。引用的数据版本GRCm38 / m10和GRCh38 / hg38分别为老鼠和人类基因组。图S2。放大的Klhl14-AS预测亚型。(1)四种不同引物。最上游正向引物设计在一个笼网站报道(红色箭头),而另一种被设计在选择报道转录起始站点(绿色箭头)。 The reverse primers were designed on the two predicted 3′ ends (blue and pink arrows) of the reported transcripts. (2) Scheme of the different combinations of oligos used to amplify Klhl14-AS isoforms. (3) PCR results: three different bands were obtained with the oligo set B, while the amplifications with sets A and C did not give any products. Primers sequence are reported in table S1. Table S1. Sequences of the primers reported in Figure S2. Most upstream 5′ (CAGE I, red arrow in figure S2), inner 5′ end (INNER 5′, green arrow in figure S2), upstream 3′ (UPSTREAM 3′, blue arrow in figure S2), most downstream 3′ reported end (DOWNSTREAM 3′, pink arrow in figure S2). Figure S3. Two different oligo sets were used to map thyroid Klhl14-AS transcripts. The two oligo sets differ mainly for the forward oligo used: for oligo set 1 (red arrows) the forward primer was designed starting from one of the CAGE sites reported in UCSC, while for oligo set 2 (blue arrows) the forward primer was designed starting from the 5′ end identified by RACE. Reverse primers instead were both designed starting from the most 3′ sequence identified by RACE, by slightly shifting the sequence to optimize melting temperature and amplification efficiency. Figure S4. Klhl14-AS sense probe were used as negative control. In situ hybridization performed on paraffin-embedded sections with a sense probe for Klhl14-AS. 200X magnification of thyroid and 25X magnification of brain sections are shown. Both images are reduced by 25% compared to the original ones. Figure S5. Human Klhl14-AS expression pattern partially overlaps with the mouse one. UCSC annotated Bioinformatic analysis from Gtex RNA-seq data shows that human Klhl14-AS is expressed in fallopian tube, kidney cortex, spleen, testis and thyroid (bit.ly /klhl14-as).