文摘
甲状腺癌患者需要使用优化管理的敏感和特定的生物标志物。对于早期诊断和有效的跟踪,目前可用的细胞学和血清生物标志物,甲状腺球蛋白和降钙素,存在严重的局限性。研究微rna表达在甲状腺肿瘤提供新的见解小说发展的生物标记,可用于诊断甲状腺癌和优化其管理。在本文中,我们将研究一些常用的方法来检测和量化microRNA在biospecimens患者甲状腺肿瘤,以及这些技术的潜在应用开发microRNA-based生物标志物对甲状腺癌的诊断和预后评估。
1。介绍
甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤,诊断及其患病率显著增加了在过去的十年里(1]。肿瘤转换可以发生在滤泡腺的或parafollicular细胞。在前一种情况下,结果从分化tumors-papillary甲状腺癌(ptc),滤泡性甲状腺癌(ftc),和许特耳氏细胞carcinomas-to少见的低分化和未分化甲状腺癌(PDTCs atc, resp)。转变parafollicular细胞产生甲状腺髓样癌(mtc)。约,矿渣mtc的百分比是家族,这包括那些被诊断为多发性内分泌瘤2型综合症的一部分(2]。大约80%的分化型甲状腺癌(投票权ptc(列车自动控制系统)。这些肿瘤预后很好,由于可用的工具(细胞学检查的细针穿刺活检(FNAB)),允许早期诊断和当前治疗的疗效。它包括手术和放射性碘来消除残余和/或局部区域复发性疾病和,在某些情况下,远处转移。这种方法不是一个选项为矿渣mtc患者或那些肿瘤(PDTCs和大部分atc)不再能够集中碘。这个缺陷是受损的结果表达式/ /钠碘同向转运功能(NIS)或thyroperoxidase (TPO)造成oncogene-activated信号导致thyrocyte去分化(3- - - - - -5]。这些肿瘤,新颖的治疗策略(正积极调查6,7]。
多年来,化验血清甲状腺球蛋白和降钙素水平发挥了重要作用在甲状腺癌的诊断和随访8,9]。甲状腺球蛋白的产生完全是由甲状腺滤泡细胞。在DTC患者经历总甲状腺切除术和放射碘遗迹消融,其在血清因此被认为是持续或复发性疾病的标志(局部区域或在遥远的网站转移)10]。降钙素,一个产品parafollicular C-cells,后续的类似作用例手术的矿渣MTC [11]。这两个标记,然而,有一些证据确凿的局限性包括特异性和敏感性11,12),甲状腺恶性肿瘤的患病率增加,需要侵入性甲状腺癌生物标志物具有高精度、敏感性和特异性变得更加紧迫。这个领域的兴趣已经引发了我们越来越理解的microrna的表达(microrna)患者的甲状腺肿瘤(13]。在本文中,我们将检查越来越多的证据支持使用这些小,非编码RNA物种甲状腺癌的诊断和预测行为,以及目前所使用的检测和量化技术在组织和其他生物样本。
2。microrna在甲状腺癌
microrna是内生的,非编码rna的长度从19到25核苷酸。他们扮演主要角色在转录后的调控基因表达的14- - - - - -16]。一般来说,microrna downmodulate目标基因的表达通过减少稳定性的成绩单和/或抑制其翻译(14- - - - - -16]。以这种方式减少特定蛋白质的丰度,microrna起到基本的调节作用在许多生理过程,包括那些参与预处理和产后发展。因此,毫不奇怪,他们的一些病理条件的表达式是一个特异表达特性,包括肿瘤疾病(17- - - - - -20.]。第一个描述异常的microrna的表达和癌症之间的联系是在2002年出版的(21]。此后,microrna的数量已知人类基因组编码的快速增长。最近看miRBase数据库显示超过2000个人类microrna[注释22),和他们的人数预计将增加23]。
第一个发表信息microrna在甲状腺肿瘤发生中的作用出现在2005年(24),其次是其他几个研究关注这个问题。甲状腺肿瘤(和其他癌症)显示改变涉及各种组件的机械负责microrna的生物起源的复杂的过程。转录表达下调的帽子最近观察到恶性甲状腺组织和细胞系,与正常甲状腺组织和良性甲状腺肿瘤,和这个变更的相关特性表明肿瘤侵犯(extrathyroidal扩展,淋巴结和远处转移,复发)的存在BRAFV600E突变(25]。矿渣mtc的大型队列研究发现肿瘤窝藏受潮湿腐烂突变展出调节某些基因的表达参与microrna的生源论,与RET-wildtype同行相比,无显著差异观察这些基因的表达水平之间的关系拉突变体,拉野生型矿渣mtc [26]。
microrna的表达的特定模式也被确认在大量研究进行甲状腺癌(21,27- - - - - -30.),和几个microrna被发现过表达或表达下调主要类型的甲状腺肿瘤(13,31日,32]。最近的荟萃分析试图提供一个清晰的概述microrna通常在特定甲状腺癌histotypes特异表达。几组报道microrna的- 146 b的过度表达,microrna - 221, microrna - 222和microrna在ptc - 181 b,而水平在正常甲状腺组织,这upregulation呈正相关,肿瘤侵犯(33- - - - - -37]。三个四个microrna, microrna - 146 b, microrna - 221和microrna - 222,在美国联邦贸易委员会也调节,许特耳氏细胞甲状腺癌,ATC (38- - - - - -40]。相比之下,microrna的346 - 197和microrna -调节特别是在美国联邦贸易委员会(29日,41]。集群成员的microrna - 17 - 92 ATC中高度表达,因为它们在其他侵略性癌症(39),这表明这microrna的集群影响致癌过程的失调。值得注意的是,增加miRNAs-21的表达式,microrna - 183和microrna - 375与持久和转移性疾病有关矿渣MTC患者(42]。microrna downregulations似乎更加不定地与特定类型的甲状腺癌有关。例外是microrna的表达下调表达属于microrna - 200和miRNA-30家庭,只与有关atc中起重要作用,因此怀疑收购尤其是侵略性肿瘤表型(13,39]。表1展示了主要的microrna的失调在甲状腺肿瘤,连同他们的记录对致癌突变和分子靶点进行验证。在后者中,一个功能角色在甲状腺癌的致癌性转化细胞原癌基因的受体酪氨酸激酶(装备),C-X-C主题趋化因子配体12 (CXCL12)、结缔组织生长因子(CTGF), NF-kB,程序性细胞死亡4 (PDCD4), yes-associated蛋白质(笨蛋)(见表1),所有参与调节细胞增殖、迁移、入侵和生存。
3所示。microrna在生物样品检测
microrna的表达模式可以丰富的生物信息来源。分析这些模式可以提供线索的变化不同的细胞过程是如何调制两种生理和病理条件下(54]。各种疾病与microrna的参与组织的重大变化,这些变化在不同种类的癌症已报告(55]。microrna在各种人类biospecimens显示稳定性好,包括细胞系,用来和formalin-fixed组织,FNAB,血浆和血清,尿液56]。此外,他们的水平也提供更直接和更具体的信息在当前的生理和病理条件比其他分子在这些标本57]。调制基因表达的重要性和显著稳定在人类biospecimens导致不同的方法,发展和平台开发microrna的表达、分离和研究,目的是确定档案或单一microrna与特定的病理条件相关联。
总RNA的microrna的分析始于隔离。提取协议用于这个目的往往稍微修改充实包含microrna的分数和其它小RNA的物种。广泛使用的microrna的提取方法分为两大类:化学方法和基于列的方法。的主要优点和缺点每个图进行了总结1。
然后量化孤立的microrna并进行质量评估。获得标本具体数量,而RNA的质量取决于所使用的提取方法。然后准备microrna测定RNA。四种行之有效的方法目前用于分析microrna的表达:微阵列,定量逆转录聚合酶链反应(存在),高通量测序(RNA-seq)和数字PCR (dPCR)。
微阵列分析是第一个方法用于并行分析大量的microrna。生物样品中的microrna是使用荧光标记的,化学或酶技术,然后杂化dna探针在数组中。芯片分析允许大量的快速处理,和它的成本是相对较低的成本。然而,它是最敏感和最具体的microrna测定方法,它不允许新靶点的识别58]。
存在可能是最流行的方法目前用于microrna的检测。它需要逆转录的microrna的cDNA、其次是实时监控的聚合酶反应产物的积累。商用,可定制的盘子和微流控卡可以用来检查一组小的microrna或提供更全面的报道。成百上千种microrna存在检测、平台与电镀前可用PCR引物包含nanoliter-scale井分布在微流控牌。这种方法比微阵列分析更具体的和敏感的。一个内部控制必须用于相对量化的表达;标准曲线可以用来获得绝对量化。微阵列分析,存在无法识别小说microrna [59]。
RNA-seq目前最昂贵的microrna测定技术,但它也是最丰富的。它提供了量化数据以及序列数据,因此可以用来识别小说microrna或序列变化。cDNA文库的小分子rna准备样品。这是紧随其后的是一个适配器连接的步骤和固定的互补的支持(固相固相聚合酶链反应,bead-based乳液聚合酶链反应)。这些步骤之后,大规模并行测序数以百万计的从图书馆互补脱氧核糖核酸分子。这种方法允许同时表达模式的分析大量的目标(60]。
数字PCR允许microrna的表达的定量分析,而内部控制。最敏感的技术,唯一一个可以直接量化microrna的绝对数字副本。它包括分区cDNA样本分成多个并行PCR反应。执行反应与纳米流体力学分区或乳液化学,基于样本的随机分布在特定的支持。它优于先前描述的方法在灵敏度和精度方面,它是技术最广泛的用于研究microrna的表达在血浆或血清样本,没有稳定的内生控制(61年]。
4所示。microrna在甲状腺癌诊断标志物
后的临床和超声评估恶性肿瘤的可能性,大多数甲状腺结节是受到FNAB细胞学检查(62年,63年]。这种方法已经显示出良好的精度识别大多数转轨国家良性病变。然而,不可忽视的比例的情况下,细胞学是不确定的10]。在这些情况下,评估分子标记的送气音通常可以允许更有信心那些将要动手术分化的良性和恶性病变。microrna是小说类的分子标记被用来提高甲状腺癌的诊断(13,64年]。多项研究表明,在FNABs miRNA-based签名可以用来区分良性与恶性甲状腺结节(表2)。
最近的一项荟萃分析(71年543例良性)( )或恶性( )甲状腺结节细针吸入物(fna)表明,microrna的分析可以更准确的个性化比传统细胞学的恶性病变。最近,Paskas et al。70年)的性能评估小组四个标记,由于BRAF V600E突变,microrna - 221, microrna - 222和galectin-3蛋白质,开发一个算法区分良性和恶性甲状腺结节。特别是在120结节的研究中,该算法分类62例为良性的(对75例观察与传统细胞学分类),9假阴性的情况下,和6假阳性情况下,敏感性为73.5%,特异性为89.8%,和75.7%的准确性,从而允许超过一半的病人群体,以避免不必要的手术。118年一群ptc的样本,Panebianco et al。69年)开发了一个统计模型,准确区分恶性肿瘤从良性不定病变甲状腺fna)使用两个microrna的面板和两个基因(microrna - 146 b, microrna的222年,装备,和TC1)。最近,Stokowy et al。64年)已经确定了两个microrna标志物可能改善与不定FNA mutation-negative甲状腺结节的分类。在这项研究中,观察到,microrna - 484和microrna的- 148 b - 3 - p识别甲状腺恶性肿瘤的敏感性为89%,特异性87%,44 FNA标本的一个子集。
至于atc,大部分的研究到目前为止并没有产生显著的数据由于肿瘤样本的数量检查总是低(67年,72年]。目前,没有数据潜在的矿渣MTC的microrna的化验诊断。
最近,提高诊断的癌症已经通过分析cancer-derived材料分离外周血样本(73年]。这些“液体活检”提供了遗传的快照反应景观,包括原发性和转移性损伤(74年]。报道相对较少循环microrna的表达和临床意义在甲状腺癌患者,尤其是那些不太常见的肿瘤,如矿渣MTC, PDTC, ATC。如表所示3,迄今为止公布的研究主要集中在PTC(列车自动控制系统)的患者,但结果仍然高可变性的特征。几个元素可以导致这些高度变量的结果,包括每个研究病人的数量和/或sample-related因素(即。、性别、样本采集时间)preanalytical因素(即。,sample type, storage conditions, and/or sample processing), and experiment-related factors (i.e., RNA extraction protocol, quantification methods). In addition, only few studies reported the isoforms of the miRNAs identified. Circulating levels of miRNA-146b-5p, miRNA-221-3p, and miRNA-222-3p in PTC patients have been found to be higher than those in healthy controls [75年,76年,84年],microrna - 222和microrna - 146 b水平也据说区分ptc和良性结节(75年,80年,83年]。等离子体水平的miRNA-21 FTC患者据报道高于良性结节患者中发现或PTC,而microrna - 181高表达在PTC患者比贸易委员会(81年]。在PTC患者中,循环水平的microrna - 146 a - 5 - p, microrna - 146 b - 5 - p, microrna - 221 - 3 - p, microrna的p - 222 - 3 -已被证明肿瘤切除后下降(75年,76年,83年,84年]。
5。microrna在甲状腺癌预后标记
microrna测定甲状腺癌症也可以提供预后信息用于定义优化管理策略。最近的研究表明,某些microrna的表达水平在甲状腺肿瘤组织与clinic-pathological特征相关联,如肿瘤大小、multifocality,荚膜入侵,extrathyroidal扩展,淋巴结和远处转移。肿瘤大小显示协会与组织水平的microrna - 221, microrna - 222, microrna - 135 b, microrna - 181 b, microrna - 146 a, microrna - 146 b (35,85年- - - - - -87年]。后两个也与multifocality[有关86年,87年]。单一的研究,分析了microrna的表达之间的联系和荚膜或血管侵犯识别三个microrna (microrna - 146 b, microrna - 221和microrna - 222),其水平显著提高肿瘤组织样本的PTC入侵血管结构和/或胶囊。Extrathyroidal扩展与更高水平的有关microrna - 221, microrna - 222, microrna - 146 a, microrna - 146 b, microrna - 199 b - 5 - p,和microrna - 135 b (35,87年- - - - - -89年]。microrna的表达水平的microrna - 221 - 222, miRNA-21-3p, microrna - 146 a, microrna - 146 b, microrna的p - 199 b - 5 -据报道高患者淋巴结转移(85年,86年,89年,90年],microrna - 146 b和microrna - 221也与远处转移的存在(86年]。周和同事发现,患者总体生存率较高的microrna - 146 b表达水平明显降低相对于那些降低肿瘤的microrna的水平。过度的microrna - 146 b显著增加细胞增殖、迁移和侵袭性,导致抗化疗所致细胞凋亡(91年]。更高水平的microrna - 146 a, microrna - 146 b, microrna - 221和microrna - 222显示更高的TNM阶段积极联系(III / IV和I / II) (35,85年- - - - - -87年]。复发的风险,根据美国甲状腺协会(ATA)定义的指导方针,一直积极与更高的microrna的表达- 146 b - 5 - p, microrna - 146 b - 3 - p, miRNA-21-5p, microrna - 221, microrna - 222 - 3 - p, miRNA-31-5p, microrna - 199 a - 3 - p / microrna - 199 b - 3 - p, microrna - 125 b和microrna - 203和microrna的表达水平较低——1179年,miRNA-7-2-3p, microrna - 204 - 5 - p, microrna - 138, miRNA-30a, let-7c [37,92年]。
值得注意的是,上述研究和发现相关专门ptc(表4)。
只有两个研究调查的角色microrna在FTC和矿渣MTC预后标记52,93年]。Jikuzono和同事的研究涉及microrna的表达在肿瘤组织的综合定量分析微创ftc (MI-FTC) [93年]。肿瘤已经转移的子群( )表现出更高水平的microrna - 221 - 3 - p, microrna - 222 - 3 - p, microrna - 222 - 5 - p, miRNA-10b, microrna - 92比nonmetastatic子组( )。这些microrna的表达也调节广泛入侵ftc (WI-FTC; ),它的特点是远处转移,预后差。逻辑回归分析确定其中一个microrna miRNA-10b,作为一个潜在的工具为例转移性MI-FTC预测结果(93年]。第二项研究中,由亚伯拉罕和同事发现,过度的microrna - 183和microrna在矿渣mtc - 375 ( )是与侧淋巴结转移有关,残留病、远处转移,死亡率(52]。
最近的研究也看着患者循环microrna ptc,显示出不可否认的承诺为小说早期疾病复发的预测指标(表5)。
在这些患者中,循环水平的microrna - 146 b - 5 - p, microrna - 221 - 3 - p, microrna - 222 - 3 - p,和microrna - 146 - 5 - p已被证明肿瘤切除后下降(75年,76年,81年,83年,84年]。值得注意的是,血清microrna的水平- 221 - 3 - p和microrna - 146 - 5 - p似乎也预测治疗的临床反应,显著增加水平在2年随访观察患者PTC结构疾病的证据,包括一些的血清甲状腺球蛋白测定仍持续负(84年]。协会甲状腺癌水平循环的microrna - 146 b - 5 - p, microrna - 221 - 3 - p, microrna - 222 - 3 - p调节的证据表达了PTC (37,94年),美国联邦贸易委员会(27,95年],ATC (27)组织和协会与肿瘤侵犯。
6。结论
分析循环microrna的microrna的表达水平和检测可用于甲状腺癌的早期诊断和监测治疗反应。与循环信使rna相比,循环microrna正在成为更有前途的生物标志物和组织特定的候选人因为他们更稳定。microrna也可以评估在其他生物样品,如FNABs,可获得与微创程序方便地识别一个特定的配置文件,使特定的microrna最佳诊断或预后的生物标志物。改进的标准化方法测定循环microrna将允许更广泛的使用这种方法定义为甲状腺癌患者个性化治疗策略。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
人Celano和弗兰西斯卡Rosignolo同样这项工作。
确认
写作提供的支持是玛丽安埃弗雷特肯特BSN(欧洲医学作家协会)。作者感谢安东尼奥Macri和Domenico Saturnino(神经科学CNR-Institute)行政援助在这工作。