microrna的退出试验的方法验证miR-28-5p目标识别在其他肿瘤上下文在前列腺癌

文摘

miR-28-5p是一个基因内microrna在几种肿瘤类型underexpressed显示肿瘤抑制(TS)的活动。通常,已知miR-28-5p目标是验证肿瘤在特定环境中,但是目前尚不清楚这些目标在其他肿瘤类型也被监管。为此,我们采用了microrna退出试验捕捉miR-28-5p目标du - 145前列腺癌(PCa)细胞。首先,我们证明了miR-28-5p充当TS-miRNA PCa,影响细胞增殖、存活和凋亡。其次,我们评估的浓缩10 miR-28-5p目标退出样本进行验证。特克斯- 261,我们表明,E2F6 MAPK1, MPL, N4BP1,和RAP1B但不是BAG1 OTUB1, MAD2L1, p21和明显丰富,表明不是所有的miR-28-5p目标受这microrna在PCa。然后我们验证miR-28-5p-interacting目标是否受到这microrna。我们选择E2F6,最丰富的目标在取出样本,并证明miR-28-5p下调E2F6在蛋白质水平表明我们的方法是有效的。概括地说,这些发现支持了microrna退出试验作为一个有用的方法来识别特定于上下文的microrna的目标。

1。介绍

众所周知,microrna的表达的放松管制的癌症发展的原因或贡献的原因。microrna可以作为肿瘤抑制(TS)、致癌基因,或者两者都取决于肿瘤上下文(1]。miR-28-5p是几种肿瘤类型的基因内microrna的表达下调,如肝细胞癌(2),肾细胞癌(3)、自然杀伤t细胞淋巴瘤(4),b细胞淋巴瘤(5],结直肠癌(CRC) [6],CRC肝转移(7,8),虽然在某些情况下,miR-28-5p已经观察到的表达水平增加(卵巢、食管和宫颈癌)9- - - - - -11]。大多数的报纸关于miR-28-5p在肿瘤中的作用提出了一个普遍的microrna的肿瘤抑制活动在体外(2,3,5,6,12]。最近,它已被证明了miR-28-5p reexpression Burkitt的异种移植模型(提单)和弥漫型大b细胞淋巴瘤(DLBCL)以及阻止肿瘤生长在提单小鼠模型,打开方式miR-28-5p-based替代疗法作为这些疾病的新的治疗策略(13]。

的分子靶点miR-28-5p施加其反或proproliferative角色只是部分。例如,miR-28-5p减少细胞生长和迁移在肝细胞癌(2),在CRC (6细胞抑制igf - 1的表达,CCND1, HOXB3基因。此外,miR-28-5p充当了TS-miRNA肾细胞癌的直接压抑的表达RAP1B [3)和b细胞淋巴瘤通过直接抑制BAG1表达式,一个map激酶通路中的基因调控5]。

到目前为止,没有数据的角色miR-28-5p在前列腺癌(PCa)或目标受这microrna在PCa细胞。在这项工作中,我们评估miR-28-5p目标验证是否在其他类型的肿瘤在PCa监管细胞使用microrna的拔出试验,一种技术,允许所有给定的目标的隔离microrna在特定的生物环境。我们证明miR-28-5p施加TS在PCa细胞活动,并非所有验证miR-28-5p目标受这microrna的PCa上下文。

2。材料和方法

2.1。细胞培养条件

du - 145和- 549细胞生长在介质RPMI 1640 (EuroClone)而曲泽细胞生长在火腿的介质(EuroClone)和MCF-7细胞在DMEM低葡萄糖(EuroClone)。10%的边后卫(胎牛血清,EuroClone), 1%青霉素和链霉素(2毫米,EuroClone),和1%的谷酰胺(2毫米,Sigma-Aldrich)添加到培养基中。细胞被孵化的37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂。

2.2。转染

瞬时转染的双链microrna的模仿(miR-28a-5p)或负控制(miR-NC) (GenePharma) du - 145细胞中进行了使用Lipofectamine 2000(热费希尔):1.5×10⁵细胞被播种在e菜肴和48小时后,细胞转染microrna的模仿使用10μl Lipofectamine根据协议由制造商提供。转染细胞的悬架是用于细胞和分子分析。

2.3。细胞增殖

1×10⁵细胞被播种在一系列的30毫米直径菜肴和增长了96小时。每隔24小时,细胞被收集和统计。

2.4。细胞周期分析

细胞周期分析如下:5×10⁵细胞被固定为95%与300年冷乙醇和标签μl 50μl /毫升propidium碘(Sigma-Aldrich)解决方案。在4°C隔夜孵化后,细胞周期分析与Accuri™C6流式细胞分析仪(BD生物科学)。使用特定的软件提供的工具,细胞的百分比在细胞周期的每个阶段考虑到参数SSC-H / FL2-A决定。

2.5。生存分析

生存测量如下:收集细胞,种子细胞密度200细胞/ 60毫米直径允许集落形成的培养皿。10 - 12天后,菜沾0.1%的简历和比率(殖民地的数量/种子细胞的数量)被用来计算活细胞的比例。

2.6。细胞凋亡检测

细胞凋亡测定如下:1×10⁶细胞在300年被停职μl绑定缓冲1 x,在室温下15分钟。此后,电池标签是根据装备膜联蛋白V-FITC。细胞然后通过流式细胞分析仪BD Accuri C6 (BD生物科学)和分析使用FL3-H / FL1-H参数。

2.7。microrna退出试验

中描述的microrna的拔出试验进行Rizzo et al。14]。短暂,du - 145细胞转染使用Lipofectamine 2000(热费希尔)miR-28a-5p双工(ds-miR-28a 60 nM_CT)或混合3biotin-tagged miR-28a-5p 8涂(核苷酸8是一个thiouridine)和miR-28a-5p 18涂工器(ds-miR-28a_生物)。在转染后的第二天,细胞与紫外线辐射(365 nm, 2 J /厘米²)使用Bio-Link交联(BLX) (Ambrose Lourmat)和总RNA提取试剂盒添加试剂(热费希尔)直接贴壁细胞和制造商提供的说明。15μg的RNA是孵化与100年在4°C为4个小时μl streptavidin-conjugated珠子(链霉亲和素琼脂糖高性能、通用电气医疗集团),和RNA包裹着珠子恢复使用试剂盒协议。我们进行了三个生物复制获得三个miR-28_CT(miR-28控制)和三个miR-28_生物(miR-28)取出样品。

2.8。量化的microrna与mrna(存在)

总RNA提取1×10⁶细胞使用miRNeasy迷你工具后,制造商的建议。1μ克总RNA retrotranscribed使用miScript II RT工具包(试剂盒)或QuantiTect逆转录工具包(试剂盒)microrna的mRNA量化,分别。反向转录后执行制造商的指示。microrna和mrna量化Rotor-Gene Q 2丛(试剂盒),使用miScript SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒)和SsoAdvanced™SYBR®绿色Supermix (Bio-Rad),分别根据制造商的协议。相对量化使用Rotor-Gene Q软件,执行规范的内部控制(U6, SNORD55 SNORD110 microrna和GAPDH ACTB,和产生HPRT mRNA)。相对miR-28a-5p肿瘤细胞系中表达水平评估对正常细胞RNA(首选人类总RNA, Ambion)。所有的反应进行了一式三份,结果三个生物复制的意思。

2.9。免疫印迹分析

蛋白质从细胞中提取丸使用裂解缓冲(1米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值8,特里同x - 100 1%,和Na脱氧胆酸盐0.25%)的PMSF 1毫米。蛋白质被量化colorimetrically使用BioRad蛋白质测定试剂(Bio-Rad)。吸光度测定铬酸在595 nm标(感知技术)。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶sds - page分离(10%,凝胶预制Mini-PROTEAN®TGX没有污点™,Bio-Rad)和转移到0.2μm硝基电印迹膜的使用Trans-Blot涡轮吸墨水系统(Bio-Rad)。由此产生的屁股被封锁在TBST脱脂奶粉5%解决方案。Anti-GAPDH(细胞信号)(1:20000),anti-E2F6(圣克鲁斯生物技术)(1:500),和PARP-1(圣克鲁斯生物技术)(1:500)主要抗体。在4°C孵化了一夜,乐队在孵化后显示推荐的二次抗体与过氧化物酶使用ECL(通用电气医疗集团)。扫描图像量化使用ImageJ GAPDH软件和规范化。

2.10。统计分析

结果表示为意味着SD至少有三个独立的实验,并使用学生的数据进行了分析t以及( , , , )。

3所示。结果

3.1。miR-28-5p产生了TS在PCa细胞活动

调查miR-28-5p在PCa的角色,我们首先计算表达式的两个PCa细胞系(du - 145和曲泽),而正常细胞(图1(一))。我们也评估miR-28-5p表达的肺癌(a - 549)和乳腺癌癌细胞(MCF-7),证明miR-28-5p明显是在所有分析癌症细胞系表达下调。

为了测试是否miR-28-5p TS在PCa细胞行为,我们首先测量细胞增殖du - 145和曲泽细胞后miR-28-5p reexpression。数据显示显著抑制细胞增殖的PCa细胞系(数字1 (b)和1 (c))。miR-28-5p转染时也获得了类似的调查结果在乳腺癌和结肠癌细胞系(数字1 (d)和1 (e))。

进一步调查的miR-28-5p PCa的生物效应,我们检查了克隆形成能力(CFA)和细胞周期后microrna reexpression du - 145细胞。数据显示,miR-28-5p reexpression导致CFA的显著减少(图2(一个))和一个轻微的但在G1期细胞显著增加(图2 (b)),这表明扩散是负面影响。最后,我们证明了miR-28-5p reexpression du - 145细胞凋亡增加(数据2 (c)和2 (d))。总体数据显示miR-28-5p作为TS-miRNA PCa,可能通过调节关键通路不仅在肿瘤细胞增殖,还参与肿瘤细胞的生存。

3.2。一些验证miR-28-5p目标与PCa miR-28-5p协同作用

调查的目标是由miR-28-5p PCa,我们转染microrna du - 145细胞和microrna退出执行分析(14]。这种技术允许miR-28-5p /目标的捕获和隔离复合物miR-28-5p使用生物素化的版本。我们认为miR-28-5p目标存入miRTarBase (http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw),尤其是那些与荧光素酶报告试验(表进行验证1)。

使用中存在,我们检查了这些目标的浓缩池miR-28-5p-captured目标(miR-28取出样品)和发现,RAP1B N4BP1, MPL, MAPK1,特克斯- 261和E2F6被超过2倍浓缩miR-28-5p退出示例(图3(一个))。这些结果表明,并不是所有的miR-28-5p-validated目标和交互,因此,可能受miR-28-5p PCa细胞。

来验证是否选中目标的浓缩miR-28-5p取出样本代表的microrna的监管功能,我们选择最丰富的,也就是说,E2F6,决定其表达式后miR-28-5p reexpression du - 145细胞。我们证明了E2F6被miR-28-5p reexpression只有在蛋白质水平(数字3 (b)和3 (c)),这表明E2F6受miR-28-5p PCa。

4所示。讨论

microrna是关键抑制剂发挥关键作用的基因表达在肿瘤发展和发展影响基因和通路参与所有癌症的标志(17,18]。通过调节致癌基因或TS基因,他们可以采取行动,分别作为TS或致癌基因,尽管众所周知,特定的角色microrna在癌症不是绝对而是密切相关的肿瘤上下文(1]。因此,毫不奇怪,miR-28-5p可能充当一个致癌基因(例如,[9])或TS(例如,13]),尽管在大多数肿瘤,它显示一个抗增殖效果。可能,这取决于目标的表达水平或监管机构的作用,干扰miRISC绑定或函数,并不是所有的目标特定的microrna可以绑定,microrna的规定在一个特定的上下文(19,20.]。

在这工作,执行miR-28-5p退出试验,我们探讨是否已知miR-28-5p目标,存入miRTarBase至少与荧光素酶报告实验和验证,互动,并由miR-28-5p PCa。在这种战略是,在所有miR-28-5p-validated目标,那些与miR-28-5p在PCa有更高的机会受到的microrna的肿瘤。我们首先评估了在PCa miR-28-5p作用,我们首次展示了这个microrna underexpressed在这些细胞,其reexpression抑制细胞增殖和生存。这些数据让我们得出这样的结论:miR-28-5p充当了TS-miRNA PCa。因为它已经证明miR-28-5p负调控基因参与肿瘤细胞生长在肺12)和结肠直肠(6癌细胞,我们检查的表达水平和影响在肺癌和结肠癌细胞系miR-28-5p积极控制。

使用microrna退出试验,我们发现并不是所有的验证miR-28-5p目标丰富的miR-28取出样品。在丰富与癌症相关的目标更强烈(即。,N4BP1 RAP1B MAPK1, E2F6),几乎所有protumoral。事实上,MAPK1和RAP1B Ras-related小GTP-binding蛋白质作为GTPase在几个信号级联,proproliferative蛋白质作为癌基因参与的开发和发展多种肿瘤类型(例如,21,22])。特别是,它已经表明,miR-28-5p抑制细胞增殖和迁移通过直接抑制RAP1B在肾细胞癌22]。这些观察与miR-28-5p可能规定一致,表明我们的方法来识别特定于上下文的microrna的目标的效用。同样,据报道,当PCa从良性发展更激进的阶段,它成为抗凋亡由于凋亡蛋白表达的增加23]如E2F6 [24]。事实上,我们表明E2F6,最丰富的目标miR-28-5p取出样本,当时受miR-28-5p转录后的水平。我们可以推测,目标microrna拿出样品浓缩水平可能促进目标的识别影响microrna的监管。此外,我们还显示,miR-28-5p reexpression du - 145细胞中诱导细胞凋亡。鉴于du - 145细胞(雄激素独立PCa细胞株)是一种先进的PCa在体外模型,miR-28-5p reexpression可能被考虑作为PCa在这个阶段的新治疗方法。此外,我们表明,E2F6是由miR-28-5p du - 145细胞;因此,可想而知,E2F6可能是介质的凋亡诱导miR-28-5p reexpression。

总之,在这项工作中,我们证明了捕获的目标与一个给定的microrna在一个特定的肿瘤是一个合适的方法来确定目标的子集有更高的几率被监管的microrna的背景下评价。在未来,所有miR-28-5p目标的识别(miR-28-5p targetome)可能有助于破译基因和通路受到监管的microrna的PCa的影响。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢玛塞拉博士冲沙批判阅读和迈克博士水貂的修订手稿。这项工作是支持的史Toscano肿瘤(授予2010年,朱塞佩•Rainaldi;授予2013年,空气里索)。

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