文摘

背景。二甲双胍作为一线治疗糖尿病,与许多蛋白激酶和转录因子交互影响下游靶基因的表达管理药物的代谢。Sulfotransferase, SULT2A1,一二期代谢酶,磺酸盐异型生物质和endobiotic化合物加速药物排泄。在此,我们设计了实验研究二甲双胍的效果和机制上SULT2A1体外表达。方法。HepaRG肝癌细胞系,用不同浓度的二甲双胍培养。细胞的生存能力是衡量使用CCK8工具包。HepaRG被用来评估孕烷X受体的蛋白表达(PXR)本构雄烷受体(汽车),SULT2A1,活化蛋白激酶(AMPK)和磷酸化AMPK (p-AMPK),分别在不同的浓度二甲双胍有或没有利福平(人类PXR活化剂)和提交(人类汽车催化剂)。与汽车SULT2A1子反应coregulators元素也被特征。结果。我们表明,二甲双胍并不影响SULT2A1但会抑制的基本表达式的表达SULT2A1激活诱导的人类的汽车。调查显示,二甲双胍可以阻止汽车核易位进一步抑制SULT2A1。此外,我们发现二甲双胍的阻止汽车转移到细胞核部分AMPK-dependent事件。结论。目前的研究表明,AMPK-CAR通路的激活介导的抑制SULT2A1二甲双胍。二甲双胍可能影响药物的代谢和间隙SULT2A1基质。脱离这个工作成果提供实质性的洞察一个适当的药物治疗糖尿病患者。

1。介绍

二甲双胍是一种双胍衍生物,属于一类口服降糖药物。现在认为二甲双胍可以产生不同的生物效应。在全球范围内使用二甲双胍不仅作为一个经典的糖尿病药物,也用于治疗多囊卵巢综合症,代谢综合征,非酒精性脂肪肝疾病,和其他条件1,2]。此外,二甲双胍已成为密集的重点研究作为一个潜在的抗癌剂3,4]。与其他药物二甲双胍往往是结合使用。考虑二甲双胍的广泛临床应用,药物之间的相互作用(ddi)或药物引起的不良反应与metformin-based复方用药治疗的病人应完整地评估(5]。

在人体中,药物是由各种各样的酶之间的相互作用。关于二甲双胍作为引发剂的影响在其他coadministered药物的代谢和间隙,二甲双胍与各种酶的影响是很重要的,应该明智地调查。代谢酶等细胞色素p450 (cyp)和sulfotransferases(结果)是协调诱导消除药物及其代谢物从身体对抗毒性。一些报告表明,二甲双胍可以影响coadministered药物代谢的药物动力学cyp托吡酯等dofetilide, phenprocoumon和伊曲康唑(6,7]。然而,很少有研究关注二甲双胍与结果之间的交互。结果是一个主要的二期摘要(dm),催化磺化的内生和外生hydroxyl-containing化合物。结果起着关键的作用在许多重要的生物学途径。硫酸结合是重要的代谢,增加异型生物质和endobiotic水溶性加速排泄(8]。总而言之,结果可能会改变一些药物的代谢改善其水溶性。

SULT2A1,结果亚科的一员,显示了丰富的表情在肝脏和肾上腺9]。以前的工作表明人类和啮齿动物的表达SULT2A1被核转录调节受体(NRs),主要是由孕烷X受体(PXR) [10)和本构雄烷受体(汽车)11]。关系,是转录因子激活内源性和外源性配体,根据控制目标基因的转录导致生物反应的起始(12]。PXR和汽车是NRs亚科的成员。都确认为xenosensors和药物代谢中有重要的作用,ddi通过调节基因的表达编码摘要酶和转运蛋白(13,14]。一般来说,PXR和汽车最初是保留在细胞质中;一旦激活特定的配体,如外源性物质、药物、草药补充剂,维生素,和一些endobiotics,他们与9-cis-retinoic酸受体α(RXR交互α),另一个关系成员,形成异质二聚体(15]。随后,异质二聚体把到细胞核,然后绑定到相应的异型生物质的反应元素(XREM)在目标基因的启动子区域16]。总之,PXR和汽车可能导致生物转化和处理相关的转录控制外源性物质。

活化蛋白激酶(AMPK)作为主要的细胞能量传感器和被激活的AMP / ATP比例升高的细胞和环境变化(17,18]。激活AMPK被报道参与许多二甲双胍的活动(19,20.]。许多途径包括AMPK也参与调节PXR /汽车和他们的目标基因(20.,21]。

基于上述信息,核受体PXR和车,AMPK信号通路是假设调解的规定SULT2A1二甲双胍。我们设计实验探讨二甲双胍对SULT2A1的表达和活动的影响。这一发现可以指导临床metformin-based治疗做出了巨大的贡献结合多个为糖尿病患者药物使用。

2。材料和方法

2.1。材料

二甲双胍,典型PXR活化剂利福平(RIF),典型的汽车催化剂6 - (4-clorophenyl)咪唑并[2,1 b] 1, 3-thiazole-5-carbaldehyde O - (3 4-dichlorobenzyl)肟(提交),和AMPK抑制剂6 - [4 - (2-piperidin-1-ylethoxy)苯基]3-pyridin-4-ylpyrazolo(1、5)嘧啶(C)复合从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。抗体SULT2A1购买从Abcam(英国剑桥)。车,RXR PXR抗体α、过氧物酶体proliferator-activated受体γcoactivator-1α(PGC1 -α)、lamin-B1和β肌动蛋白是来自武汉三一重工生物技术(武汉,中国)。AMPK和磷酸化抗体AMPK (Thr172)从细胞信号技术(丹弗斯、马、美国)。抗体对肝细胞的核因子4α(HNF4α)购买的圣克鲁斯(圣克鲁斯、钙、美国)。细胞计数设备8 (CCK8)从Beyotime购买生物技术有限公司(南通,中国)。

2.2。细胞培养和治疗

HepaRG细胞获得微孔(美国Billerica的)。细胞被播种在威廉姆斯的媒介E补充10%胎牛血清,5μ50 g / ml人类胰岛素,μ氢化可的松hemisuccinate, 100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升。细胞被保持在中了两周,然后在中+ 2%二甲基亚砜(DMSO) 2周为了获得差异化hepatocyte-like属性。分化HepaRG细胞,核受体高表达和结果酶,然后处理RIF (20μ米),提交(1μ米),二甲双胍(0.1,0.5,1毫米),或它们的组合前24 h或48 h mRNA和蛋白表达的检测,分别。

2.3。评估细胞的细胞毒性

验证≥80%的细胞是可行的异型生物质曝光后,使用CCK8测定细胞生存能力评估。总之,HepaRG细胞被播种到96孔板的密度10⁴每口井。不同浓度(0.5,1毫米)二甲双胍有或没有RIF (20μ和提交(1米)μ米)为0,添加和培养24、48和72 h。然后,CCK8试剂添加到每个好。孵化后4 h在37°C,吸光度测量在450 nm multidetection标(Bio-Rad实验室、Inc .、大力神、钙、美国)。

2.4。定量逆转录-聚合酶链反应(存在)

总RNA提取试剂盒试剂(表达载体,热费希尔科学,Inc .)。然后,RNA是reversed-transcribed成cDNA PrimeScript RT大师混合试剂工具包(豆类,大连,中国)。整除的cDNA放大在应用生物系统公司7500实时PCR系统(应用生物系统公司,热费希尔科学公司,沃尔瑟姆,妈,美国)使用SYBR预混料交货Taq工具包(豆类,大连,中国)。目标基因的mRNA表达表达为褶皱正常化后肌动蛋白变化。引物合成生命技术(上海,中国)。用于PCR引物序列如下:SULT2A1-forward 5 -TCATCATCATGTCGGACGATTTC-3, SULT2A1-reverse 5“-CTTGGAGTGCATCAGGCAGAG-3”;β-actin-forward 5‘-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’,β-actin-reverse 5“-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3”。循环条件如下:最初的变性为30秒95°C, 40周期在95°C,持续5秒,60°C 34秒,15秒和95°C,紧随其后的是60°C 1分钟和95°C,持续15秒。数据分析使用2^−ΔΔCt方法。

2.5。西方墨点法

表达的蛋白质被西方墨点法测量。核蛋白质从细胞中提取根据制造商的指示核和胞质蛋白提取工具包(Beyotime生物科技有限公司、南通、中国)。药物治疗后,细胞中被删除,与冰冷的PBS冲洗。与蛋白酶抑制剂添加冰冷的里帕缓冲区后,这些细胞被刮从培养皿表面和孵化冰了20分钟。随后,细胞溶解产物在2000×g离心10分钟在4°C和上层的收集。总蛋白浓度测定使用bicinchoninic酸(BCA)方法。蛋白质被加载同样12% sds - page和转移到PVDF膜(0.2毫米,微孔,Billerica,妈,美国)。然后,探讨了膜与初级抗体SULT2A1, PXR,汽车,RXRα,HNF4α,PGC-1α,AMPK, p-AMPK和β肌动蛋白,lamin-B1在4°C一夜之间,其次是第二抗体治疗1 h。删除二级抗体后,膜被处理一个增强化学发光(ECL)试剂(美国Billerica的微孔,MA)和信号成像自动凝胶成像分析系统。图像J (NIH,马里兰州贝塞斯达,美国)用于量化的相对信号强度。

2.6。统计分析

我们使用GraphPad Prism 6.0 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)执行统计分析。学生的t以及用于分析两组之间的差异。单向方差分析(方差分析)与图基的测试是用于分析两组以上。所有的实验数据都表示为均值±SEM至少有三个独立的实验。 被认为是表明一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。细胞的可行性HepaRG细胞暴露于二甲双胍

细胞生存能力测试是执行排除任何细胞毒性效应功能剂量二甲双胍。HepaRG细胞暴露在一系列浓度二甲双胍单独和结合PXR活化剂RIF或汽车催化剂CITCO 24、48和72 h。如数据所示1(一)和1 (b)相比,细胞治疗DMSO,二甲双胍没有造成细胞毒性有或没有RIF / CITCO cotreatment 48 h。即使接触到的最高浓度二甲双胍(1毫米)RIF / CITCO 72 h,在细胞细胞生存能力仍然是大约80%。

3.2。二甲双胍压制CITCO-Induced SULT2A1表达式

进一步评价二甲双胍SULT2A1 mRNA和蛋白表达的影响,HepaRG细胞孵化与不同浓度二甲双胍单独或结合RIF /提交和信使rna和蛋白质提取进行进一步分析。二甲双胍单独使用,无论在什么浓度,不影响SULT2A1的基底mRNA和蛋白水平与控制(数字2(一)和2(d))。20μM RIF孤独也没有影响SULT2A1信使rna和蛋白质的表达与控制(数字2(b)和2(e))。1μM CITCO SULT2A1 mRNA的表达显著升高,而控制。0.1毫米的最低浓度,二甲双胍cotreatment CITCO SULT2A1 mRNA水平略有下降相比之下,CITCO组,但无统计学意义。培养的细胞为0.5毫米,1毫米二甲双胍cotreatment 24 h导致显著降低SULT2A1相比CITCO集团( , ;图2(c))。与mRNA水平一致,SULT2A1蛋白诱导的超表达CITCO也显著抑制在二甲双胍cotreatment ( , ;图2(f))。

3.3。二甲双胍的影响有或没有CITCO汽车蛋白表达

汽车主要是在细胞质中表达基底条件下,把核引起催化剂的。核易位的车一直被视为必要的,汽车的初始步骤激活(22]。CITCO-treated细胞增加了汽车蛋白质核(N-CAR),但并没有改变汽车总蛋白的表达(还是)与对照组相比。这与先前的发现是一致的。CITCO经典配体是一个著名的汽车,可以促进汽车核移植。二甲双胍单独并没有改变的表达还是和N-CAR与控制(图3(a))。这表明,二甲双胍单独不能促进核易位的车。二甲双胍cotreatment CITCO也没有变化还是蛋白质的表达。然而,CITCO-mediated N-CAR减少是由于增加的二甲双胍治疗(图3(b))。它暗示CITCO-mediated汽车核移植是有效地恢复了二甲双胍。

3.4。二甲双胍在RXR的影响α,HNF4α,PGC-1αHepaRG细胞中表达

RXRα,HNF4α,PGC-1α据报道ligand-dependent汽车通路中的三个重要的蛋白质(23]。因此,我们评估是否二甲双胍的存在改变了这些coregulators的表达式。结果显示蛋白质的表达RXR无显著变化α,HNF4α,PGC-1α二甲双胍后有或没有的存在CITCO治疗与控制(图4)。

3.5。监管车,SULT2A1二甲双胍是依赖于激活AMPK途径

二甲双胍已报道的AMPK激活,AMPK信号通路研究的角色来洞察metformin-CAR-SULT2A1通路的底层机制。我们用20μM C化合物,AMPK的一个已知的抑制剂,预培养细胞块的AMPK激活。复合蛋白质C本身并不影响基底SULT2A1和N-CAR水平与控制。二甲双胍CITCO-induced SULT2A1蛋白质明显压抑。然而,metformin-mediated镇压SULT2A1引起CITCO被复合C(图部分恢复5(a))。同样,二甲双胍抑制N-CAR CITCO引起的。复合C戏剧性地逆转这种阻塞效应(图5(b))。SULT2A1的变化趋势和N-CAR在每组对应。为了进一步验证的参与途径,phospho-lysates准备检测各自通路的激活状态。二甲双胍增加了AMPK的磷酸化(p-AMPK)和增强AMPK的磷酸化是由化合物的存在有效地抑制C(图5(c))。CITCO减少AMPK的磷酸化,磷酸化的AMPK是有效地增加了二甲双胍。但这种提高效应恢复了二甲双胍化合物C(图5(d))。SULT2A1和N-CAR逆相关AMPK的磷酸化。此外,这位的表达水平,RXRα,HNF4α,PGC-1α每组没有区别(图展出5(a))。

4所示。讨论

我们的研究发现,二甲双胍,一种广泛使用的抗糖尿病药,抑制SULT2A1表达式通过抑制易位的车不是PXR在人类肝细胞。我们的调查也表明,二甲双胍抑制汽车核易位主要通过AMPK途径。此外,二甲双胍只影响改变SULT2A1但并不影响基底SULT2A1的表情。

HepaRG细胞系是终末分化肝细胞源于一个Edmonson年级我分化肝细胞癌。因为保留主要的肝细胞的许多特征,HepaRG细胞被认为是最好的替代人类肝细胞。与HepG2和其他肝细胞,HepaRG细胞表现出成人肝细胞的性质,如表达xenobiotic-metabolizing酶、转运蛋白,控制肝细胞基因表达的转录因子(24,25]。因此,我们使用HepaRG细胞评估一系列的实验。

所有关系,共享公共子序列的特性。他们是ligand-dependent转录因子,可以调节目标基因的转录通过传感细胞内和细胞外的信号。在配体的存在,NRs已知航天飞机不断细胞质和细胞核之间保持一个平衡(12]。这些子集NRs,保护身体免受有害毒物,被称为异型生物质受体(XRs)。XRs已报告有能力协调一组药物代谢酶和转运蛋白内源性和外源性刺激。车,PXR,称为“主监管机构”或“xenosensor,”最受关注。他们不仅调节蛋白的表达重要的药物代谢和间隙还制定防御机制来保护身体免受异型生物质挑战。

SULT2A1抑制的机制引起的二甲双胍在本研究进一步研究通过关注核受体PXR和汽车。人类SULT2A1近端启动子的基因包含一个IR2(反向重复两个间距核苷酸)和DR4直接与四个间距核苷酸重复图案。先前的研究表明,PXR结合IR2和DR4图案来激活这个基因。汽车也可以通过绑定激活SULT2A1发起人IR2或DR4 [26,27]。

PXR仍然压抑的基因转录时没有配体。一旦由配体激活,PXR把原子核和绑定到响应序列,从而激活目标基因的转录。RIF是它的一个强大的配体(28]。几十年来,PXR在SULT2A1人类的监管效果是有争议的26,29日,30.]。据报道,PXR压抑SULT2A1启动子在体外HepG2-based化验。Echchgadda等人显示PXR能激活SULT2A1表达在人类结肠癌细胞腺癌(26]。但是,方舟子等人表明RIF treatment-induced SULT2A1在初选中只有12 23肝细胞(30.]。其他原发性肝细胞压抑SULT2A1或者没有改变水平。在我们的研究中,RIF本身并没有改变SULT2A1的表达,与二甲双胍cotreatment RIF HepaRG细胞对SULT2A1没有影响(数据2(b)和2(e))。我们的数据得出结论,RIF激活PXR metformin-SULT2A1通路中不涉及人类肝细胞。

我们下了车是否介导SULT2A1二甲双胍的效果。类似于PXR,车是保留在细胞质中。汽车从细胞质到细胞核的易位是最初的和关键的一步激活(22]。一旦汽车把原子核,它将与其他代数余子式二聚化,调节其靶基因的表达(31日]。CITCO是汽车的一个经典配体。CITCO不能影响汽车总蛋白质的表达水平细胞。CITCO只是促进汽车核移植导致的动态变化的分布在细胞质和细胞核。CITCO并未改变还是表达,但增加N-CAR表达在我们的研究(图3(b))。进一步证实了先前的结论。二甲双胍单独并没有改变的表达还是N-CAR表达式,表明二甲双胍单独不仅不影响汽车的总蛋白表达也并没有改变在细胞的分布。二甲双胍与CITCO cotreatment没有改变还是表达的表达。然而,二甲双胍cotreatment减少CITCO-elevated N-CAR(图3(b))。集体,二甲双胍可以成功地阻止核易位的车由配体引起的。

相应地,二甲双胍单独并没有改变SULT2A1表达式(数字2(一)和2(d))。相比之下,二甲双胍结合CITCO显著压抑CITCO-induced SULT2A1表达式(数字2(c)和2(f))。减少N-CAR相关的标记SULT2A1减少。通过减少N-CAR二甲双胍强劲压抑ligand-induced SULT2A1表达式。数据表明,二甲双胍监管SULT2A1据抑制ligand-induced易位的车。这一发现给了我们一个解释,二甲双胍抑制CAR-mediated SULT2A1表达式,这是类似于之前的工作,二甲双胍显著抑制CAR-mediated CYP2B6的表达在人类原发性肝细胞(20.]。鉴于CITCO和RIF原型车,PXR活化剂,分别,这些结果表明,最有可能的程度上的差别机制参与了对这些SULT2A1二甲双胍。然而,它仍然值得metformin-CAR-SULT2A1通路上的彻底的调查,在未来的研究应该阐明。

易位的车进入细胞核是必要的但不能满足受体的激活。汽车和RXRα形成一个异质二聚体在细胞质中,然后转移到细胞核(32]。CAR-RXRα新兵辅活化因子刺激目标基因转录。的HNF4α是中介的肝细胞分化和脂质在肝脏内稳态。PGC-1α是另一个关键的转录共激活剂。新兴的证据指出,HNF4α,PGC-1α,和CAR-RXRα一起和增强各种汽车目标基因的表达包括SULT2A1 [23]。结果显示蛋白质的表达RXR无显著变化α,HNF4α,和PGC-1α二甲双胍有或没有CITCO治疗后(图4)。我们的研究还表明,二甲双胍降低CITCO-mediated SULT2A1蛋白表达无改变(图的基础上控制的表达元素5(a))。研究结果表明,二甲双胍抑制汽车激活不影响coregulatory蛋白质。

AMPK活化已经知道发挥核心作用在二甲双胍的行动以及压抑CAR-targeted基因的转录表达(20.,33]。杨等人表明,二甲双胍强劲压抑CITCO-induced CYP2B6表达式部分是通过AMPK-dependent信号通路。我们在目前的研究显示,AMPK活化也参与了metformin-CAR-SULT2A1 HepaRG细胞通路。CITCO明显减少AMPK磷酸化导致汽车进入细胞核的易位。这与先前的报道是相一致的。核移植的汽车符合N-CAR的增加,促进了SULT2A1的表达式。二甲双胍增加了AMPK的磷酸化减少提交。增强的磷酸化AMPK抑制易位的车,导致N-CAR的减少,进而压抑CITCO-induced SULT2A1表达式。此外,这种抑制部分恢复了AMPK抑制剂化合物C(图5)。综上所述,这些数据表明,二甲双胍抑制CITCO-induced SULT2A1在人类肝细胞部分通过AMPK-dependent信号通路。与此同时,我们认识到,AMPK信号本身并不足以应对SULT2A1感应的metformin-mediated明显抑制,表明额外的信号分子可能导致这个特定的二甲双胍响应,这需要进一步调查。

总之,我们的研究结果验证,二甲双胍可以压制的表达SULT2A1通过抑制车易位。SULT2A1表达的抑制二甲双胍至少在一定程度上激活AMPK途径。研究结果有助于提供一个更广泛的观点metformin-based药物之间的相互作用的药物组合,应考虑糖尿病药物治疗。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究是由山东省关键研发计划(批准号2016 gsf201019),济南科技创新项目的临床医学(批准号山东大学201705072),纬向项目(批准号6020320001),山东第一医科大学的学术推广计划(批准号2019 ql025)。