文摘
我们先前的研究发现,三核苷酸重复包含适配器6 c (TNRC6C)可能作为肿瘤抑制在乳头状甲状腺癌(PTC)。在这项研究中,我们旨在确认的影响TNRC6C PTC和调查潜在的分子机制。mRNA水平的差异TNRC6C PTC组织和良性甲状腺组织和协会之间的表达水平TNRC6C TCGA PTC(列车自动控制系统)的临床病理特征进行了分析使用数据。免疫组织化学检测的蛋白表达进行检测TNRC6C PTC及其相邻的非癌变组织。细胞增殖、迁移、入侵和细胞凋亡分析击倒或过度后的TNRC6C BCPAP细胞。RNA-sequencing找到执行TNRC6C的目标基因,和潜在的目标是验证BCPAP和TPC1细胞。我们的研究结果表明,TNRC6C在PTC表达下调,和低表达水平TNRC6C与临床病理的恶化是相关联的特性。超表达TNRC6C显著抑制细胞增殖,迁移和入侵BCPAP细胞和促进其凋亡,而击倒TNRC6C行为相反的作用。通过分析RNA-sequencing TCGA数据和数据,12个基因(SCD、CRLF1 APCDD1L, CTHRC1, PTPRU, ALDH1A3, VCAN,过渡委员会,ECE1, COL1A1, CAMK2N2,和MMP14)被认为是作为TNRC6C的潜在目标基因,和大多数人TCGA PTC(列车自动控制系统)的临床病理特点。他们除了CAMK2N2明显下调后overexpressing TNRC6C。 Our study demonstrated that TNRC6C functions as a tumor suppressor in PTC and may serve as a useful therapeutic target and prognostic marker for PTC patients.
1。介绍
甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤,发病率快速增长和温和的甲状腺癌的死亡率增加观察最近在中国和世界范围内(1,2]。在所有甲状腺癌,乳头状甲状腺癌(PTC)是最常见的类型,占∼80%的情况下(3,4]。虽然是一个相对PTC患者预后良好,5 - 10%的患者经历局部复发和远处转移3]。这些先进的患者进展抵抗放射碘治疗,表明预后不良(3]。因此,理解背后的分子机制PTC(列车自动控制系统)的开发和发展是至关重要的。
三核苷酸重复包含6 (TNRC6)蛋白质,包括TNRC6A TNRC6B,和TNRC6C重要miRNA-mediated基因沉默和提供脚手架功能miRNA-induced沉默复杂(5]。TNRC6蛋白表达降低据报道在胃6],结直肠[6),而非小细胞肺癌(7]。在我们之前的研究中,我们证明了长非编码反义RNA TNRC6C-AS1促进了PTC的恶性行为,抑制其摄入碘的表达下调的表达TNRC6C [8]。我们发现扩散、迁移和入侵TPC1细胞的能力被削弱,和凋亡细胞的比例增加了overexpressing TNRC6C,虽然击倒TNRC6C行为相反的角色8]。我们的研究表明,TNRC6C参与PTC(列车自动控制系统)的开发和发展。
它有一个重要的角色在miRNA-induced转录后的沉默途径,我们假定TNRC6C可能参与一些致癌基因的镇压,并降低TNRC6C可能会增加一些miRNA-regulated致癌基因的表达。在这项研究中,我们旨在确认的角色在PTC明确TNRC6C验证这一假设。首先,我们调查了TNRC6C对扩散的影响,细胞凋亡,迁移和入侵另一个PTC细胞系,BCPAP细胞。第二,我们分析了在PTC TNRC6C组织的表达及其附近正常甲状腺组织通过免疫组织化学方法。然后分析了协会TNRC6C PTC(列车自动控制系统)的表达与临床病理特征。揭示TNRC6C下游目标,我们进行了差异基因表达分析使用RNA-seq后过度BCPAP TNRC6C的细胞。最后,我们核实后由定量rt - pcr基因表达下调目标TNRC6C过度,调查他们对PTC(列车自动控制系统)的临床病理特征。
2。材料和方法
2.1。病人和样品
我们收集主要PTC组织及其附近非癌变组织在手术过程中病人从76年复旦大学附属中山医院2017年12月至2018年12月。所有患者病理诊断为PTC,和新鲜的样品在液氮冷冻。这项研究由中山医院的伦理委员会批准。所有登记患者提供书面知情同意。
2.2。数据采集和识别度,TCGA数据库
所有数据包括信息的信使rna表达水平和临床特征的PTC TCGA下载从甲状腺癌患者群体的基因组数据共享(环球数码创意)数据传输工具,其中包含502 PTC和58相邻的非癌变样本(https://tcgadata.nci.nih.gov/tcga)。PTC组织之间的差异表达基因(度)和良性甲状腺组织被确定使用磨边机的包(9根据以下标准:(I) | log2FC | > 1;(2)罗斯福< 0.05。协会TNRC6C表达水平与临床病理的PTC特性进行了分析。
2.3。免疫组织化学
免疫组织化学(包含IHC)分析formalin-fixed和石蜡包埋PTC的部分。短暂,一夜之间,部分被加热在56°C,由二甲苯deparaffinized,患者在一系列酒精的解决方案。TRIS-EDTA解决方案用于抗原检索。之后,包含5%的部分被封锁在PBS山羊血清20分钟,紧随其后的是隔夜孵化与稀释主要抗体特定针对TNRC6C(美国罗福斯)在4°C调湿室。第二天,二次抗体(细胞信号,美国)添加到幻灯片和孵化37°C 30分钟。PBS洗涤后,轻拍(Dako、丹麦)是用于染色反应。最后,部分被苏木精复染色为10%。
TNRC6C水平是由两个独立评估病理学家蒙蔽的方式使用半定量的方法,染色强度乘以阳性染色细胞的百分比(h)。肿瘤领域被分为季度,5点和场景随机微观领域选择从每个季度和中央区域。染色强度得分如下:缺席(0点),弱(1分)、中级(2分),和强大的(3分)。阳性染色细胞的百分比是得分如下:0∼5%(0点),6∼25%(1分),26∼50%(2分),51%∼75%(3分),和100%∼76(4分)。TNRC6C表达水平被分为四组:-(0点),弱阳性(1 - 4分),在中间积极的(5 - 8分),强烈积极的(9 - 12点)。患者最终得分为0 - 4点被定义为低TNRC6C表达式,和那些所为5 - 12岁的最后得分点被定义为高TNRC6C表达式。
2.4。细胞培养和转染
我们购买了人类PTC-derived细胞系(TPC1和BCPAP)和正常甲状腺上皮细胞系(Nthy-ori3-1)细胞库的中国科学院(中国上海)。所有细胞系在DMEM培养(美国HyClone)含10%胎牛血清,链霉素(100毫克/毫升)和青霉素(100 U /毫升)和孵化37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司2。
我们使用Lipofectamine 2000试剂(美国表达载体)核或质粒转染后,制造商的指示。TNRC6C-specific小干扰rna (siRNAs)设计并合成了Biosune公司(上海,中国)。过度TNRC6C, pcDNA3.1-TNRC6C质粒构建的全长cDNA片段的克隆人类TNRC6C pcDNA3.1质粒(美国表达载体)。转染效率是评价实时qPCR在转染后48小时。我们使用细胞转染control-siRNA或pcDNA3.1-empty质粒作为消极的控制。小干扰rna序列都可以补充表中找到1。
2.5。实时qPCR分析和RNA-Sequencing
总RNA分离使用试剂盒方法(豆类、日本)。RNA质量控制进行使用NanoDrop2000分光光度计(美国热科学)。逆转录工具包(豆类、日本)是用来执行反转录。定量PCR进行使用SYBR绿色化验(豆类、日本)ABI7500机(美国应用生物系统公司)。β肌动蛋白基因被选为内部参考。结果分析2−△△Ct方法。补充表中可以找到所有的引物序列1。
从三个BCPAP细胞总RNA分离样品与pcDNA3.1-TNRC6C转染质粒和三个BCPAP RNA-sequencing与pcDNA3.1-empty质粒转染细胞样本。RNA-sequencing是由北京基因组研究所(中国深圳)。
简单地说,益生元(dT)附加磁珠被用来净化mRNA。纯化信使rna是分散,相对地转录,通过PCR和放大。双链PCR产品从上一步被加热,变性,环状的夹板益生元序列得到最终的图书馆。最后的图书馆是放大与phi29 DNA nanoball (DNB),超过300册的一个分子,和DNB被加载到图案的纳米阵列,pair-end 100碱基读取BGIseq500平台上生成。
2.6。细胞增殖实验
细胞增殖是由细胞计数kit-8 (CCK-8) (Dojindo、日本)。BCPAP细胞与TNRC6C-siRNA或pcDNA3.1-TNRC6C质粒转染48 h。细胞悬液被播种到96孔板的初始密度5×103细胞/好,10μl CCK-8试剂添加到每个好和孵化37°C 4 h在不同时间点(0 h, 24小时、48小时和72小时)。后来,标(中国RT6000)是用来测量的吸光度在450海里。
2.7。愈合试验
BCPAP细胞被播种在2×105/到6-well盘子和转染48 h。当细胞融合达到80 - 90%,20个细胞层被刮花了μl吸管提示和无血清培养系统中。图像在不同的时间点(0 h, 24小时和48小时),和相对迁移区是由图像J软件(美国国立卫生研究院)。
2.8。流式细胞术分析
转染细胞收获与EDTA-free胰蛋白酶和洗了三次磷酸盐(PBS)。之后,细胞凋亡测定细胞周期和细胞凋亡分析工具包(Beyotime、上海、中国)FACSCalibur流式细胞仪(美国BD生物科学)。早期凋亡细胞的比例和晚期凋亡细胞被添加到凋亡细胞的比例。
2.9。Transwell入侵和迁移试验
使用8.0 Transwell入侵和迁移进行了分析μm康宁钱伯斯(美国康宁公司),钱伯斯matrix-coated在入侵检测(美国BD生物科学)。200年转染细胞悬液制备μl无血清培养基,添加到室顶部,而600μl中含有10%的边后卫被添加进室底部。孵化后37°C不同时间(24小时和36 h),细胞被固定在多聚甲醛(4%)为30分钟,结晶紫染色(0.1%)为20分钟。用棉签清除细胞顶部表面。图片5点随机微观领域,和手机号被ImageJ量化软件(美国国立卫生研究院)。
2.10。统计分析
独立所有的实验都重复三次,和数据提出了均值±标准差(SD)。我们使用SPSS 20.0(美国IBM)执行统计分析。Mann-Whitney和Wilcoxon测试被用来比较在PTC TNRC6C组织的表达水平与非癌变组织。卡方检验是用于分析基因的表达水平协会与PTC(列车自动控制系统)的临床病理特征。独立的t以及被用来比较两组细胞的区别。建立了统计学意义 。
3所示。结果
3.1。TNRC6C PTC表达下调
TCGA通过分析数据,我们发现TNRC6C下调502年PTC样本,而非癌变样本(图58岁1(一))。TNRC6C也在PTC样本中表达下调与相邻的非癌变样本共有58 TCGA配对样本(数据1 (b)和1 (c))。此外,我们在76年进行了包含IHC检测的TNRC6C PTC配对样本及其附近的非癌变样本病人复旦大学附属中山医院。我们发现染色比例更高,强度TNRC6C通常发生在相邻的非癌变组织,但罕见的在PTC组织(图2(一个);表1)。定量的IHC染色TNRC6C表达式在相邻的非癌变组织中还显示高于在PTC组织(数字2 (b)和2 (c))。这些结果表明,TNRC6C在PTC经常表达下调。
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3.2。的表达水平降低TNRC6C与糟糕的PTC(列车自动控制系统)的临床病理特征
我们分析之间的联系TNRC6C TCGA PTC使用数据的表达和临床病理特征。502 ptc分为TNRC6C低表达组和TNRC6C高表达组基于中位数TNRC6C表达式的值,我们比较了两组之间的临床病理特征(表2)。TNRC6C表达式和年龄之间的观察(有着紧密的联系 ),T分类( ),N分类( ),临床阶段( ),和组织学类型( )。这些结果表明,较低的表达水平的TNRC6C较大的肿瘤大小,淋巴结转移,先进的临床阶段,和更激进的组织学类型。
3.3。TNRC6C调节细胞增殖、迁移、入侵和PTC细胞的凋亡
在先前的研究中,我们发现,过度的TNRC6C TPC1细胞显著地抑制细胞增殖,细胞迁移和入侵的能力,促进细胞凋亡,而相反的是观察到的差别,对这些TNRC6C [8]。在这项研究中,我们进一步证实了TNRC6C对PTC的恶化的影响通过操纵TNRC6C BCPAP细胞中表达。
首先,我们撞倒TNRC6C TNRC6C-specific siRNA通过使转染细胞。我们击倒qPCR确认执行效率,为进一步的实验选择TNRC6C-siRNA3(图3(一个))。的TNRC6C Downregulation BCPAP细胞显著促进细胞增殖和抑制细胞凋亡(数字3 (c)和3 (f))。TNRC6C也差别此外,对这些基因的增强细胞迁移和入侵能力(数据3 (e),3 (g),3 (h))。我们也通过使转染细胞过表达TNRC6C pcDNA3.1-TNRC6C质粒。的mRNA水平TNRC6C 10倍与pcDNA3.1-empty细胞转染质粒(图3 (b))。过度的TNRC6C显著抑制BCPAP细胞(人物的攻击性3 (d),3 (e),3 (g),3 (h))和促进细胞凋亡(数字3 (f))。这些结果表明,TNRC6C可能在PTC(列车自动控制系统)作为一个肿瘤抑制功能。
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3.4。TNRC6C的潜在目标基因的识别
后显示的肿瘤抑制作用TNRC6C PTC,我们进一步筛查TNRC6C的潜在目标基因。首先,我们在TNRC6C表现RNA序列超表达BCPAP细胞和控制细胞。通过使用RNA-sequencing数据,我们发现923度( ,|日志2(褶皱变化)| > 1)之间TNRC6C过度BCPAP细胞和控制细胞通过基因的差异表达分析(度)。其中,825个基因被定义为低表达(FPKM < 10),定义为高表达,98个基因(FPKM > 10)。鉴于TNRC6C发挥了肿瘤抑制作用,我们推测TNRC6C可能抑制PTC(列车自动控制系统)的开发和进展通过下调一些致癌基因。因此,我们专注于基因负受TNRC6C,尤其是那些具有高表达水平(图4(一))。接下来,我们进行了基因的差异表达分析TCGA使用数据和确定了1713度( ,|日志2(褶皱变化)| > 1)表达水平较高的PTC组织而非癌变组织。12个基因,这都是表达下调TNRC6C和调节在PTC(列车自动控制系统),被认为是潜在的目标基因TNRC6C(图4 (b))。列出了这些基因的降序|日志2(褶皱变化)|值之间TNRC6C中BCPAP细胞和控制细胞(表3)。
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3.5。过度的TNRC6C下调潜在目标基因mRNA的表达水平
我们验证的负调控TNRC6C 12日通过qPCR潜在的靶基因。我们过表达TNRC6C BCPAP和TPC1细胞通过使转染细胞与pcDNA3.1-TNRC6C质粒。与控制细胞相比,TNRC6C的mRNA水平高出100倍于TNRC6C中BCPAP细胞(图5(一个)),高出四倍TNRC6C中TPC1细胞(图5 (c))。所有测试基因显著下调BCPAP细胞后overexpressing TNRC6C ECE1和CAMK2N2除外。TPC1细胞,所有测试基因显著下调后overexpressing TNRC6C除了过渡委员会,CAMK2N2和MMP14(数字5 (b)和5 (d))。
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3.6。更高的潜在目标基因表达水平与糟糕的PTC(列车自动控制系统)的临床病理特征
我们分析了12个潜在目标基因的表达水平之间的关系和PTC(列车自动控制系统)的临床病理学特征使用TCGA数据(表4)。更高的基因表达水平与淋巴结转移和组织学类型有关。我们发现一些基因的表达水平高也与大的肿瘤大小和先进的临床阶段如胶原蛋白三螺旋重复包含1 (CTHRC1) APC表达下调1 (APCDD1L),α1型胶原链(COL1A1) versican (VCAN) tenascin-C (TNC),和矩阵metalloproteases 14 (MMP14)。这些基因更容易被TNRC6C其肿瘤抑制作用的介质。
4所示。讨论
在这项研究中,我们发现,过度的TNRC6C显著抑制BCPAP细胞增殖,促进其凋亡,并降低其迁移和入侵的能力,虽然击倒TNRC6C行为相反的作用。这些结果与我们以前的观测TPC1细胞(8]。体外结果表明TNRC6C对PTC的恶性行为有抑制效应细胞。的低表达水平在PTC TNRC6C组织还表示,TNRC6C的缺陷可能参与PTC(列车自动控制系统的发展。进一步,我们发现高TNRC6C表达水平与不那么咄咄逼人PTC(列车自动控制系统)的临床病理特征,表明患者更好的预后PTC TNRC6C的高表达与表达水平较低。基于上述发现,我们认为TNRC6C可能在PTC(列车自动控制系统)作为一个肿瘤抑制。
目前的证据表明,TNRC6C功能作为一种重要的组件在miRNA-induced沉默复杂(10- - - - - -14]。TNRC6C可能参加一些miRNA-regulated致癌基因的镇压,造成PTC(列车自动控制系统的发展。当然,目前尚不清楚TNRC6C函数通过其脚手架功能以外的其他机制在miRNA-induced沉默复杂。我们包含IHC结果表明TNR6C6核主要是局部的,表明它可能也在转录水平调节基因的表达。无论什么样的机制,我们的研究结果支持在PTC TNRC6C的肿瘤抑制作用,并找出致癌基因的目标是很重要的。
高通量转录组测序(RNA-seq)是一种重要的方法,发现在不同条件下的差异表达基因,因此通常被用来阐明监管分子之间的关系。后overexpressing TNRC6C BCPAP细胞,使用RNA-seq数据差异基因表达分析发现下游TNRC6C的目标。TNRC6C后我们关注表达下调的基因超表达,因为他们有目标的潜在致癌基因。12度显著下调后TNRC6C超表达和调节在PTC与非癌变组织TCGA的数据集。其中12度的兴趣,CTHRC1表达水平升高,APCDD1L, COL1A1, VCAN,过渡委员会,和MMP14明显与较大的肿瘤大小有关,颈部淋巴结转移,先进的临床阶段,积极组织学类型的PTC(列车自动控制系统)。
肿瘤恶化的CTHRC1协会是在各种癌症,包括黑色素瘤、肝细胞癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌和结直肠癌(15- - - - - -17]。不同的机制促进肿瘤进展的作用被认为对各种癌症。在最近的一项研究中,CTHRC1作为prometastatic非小细胞肺癌的基因,和入侵和转移能力由MMP7——和MMP9-dependent [16]。CTHRC1在甲状腺癌的作用还不清楚。一些研究发现,有一个CTHRC1的异常表达在甲状腺癌15在PTC, CTHRC1表达水平与淋巴结转移显著相关,钙粘蛋白和波形蛋白的表达18]。COL1A1是α1 I型胶原蛋白链,COL1A1异常表达在各种癌症,表明它可以作为一个重要的诊断和预后标记和潜在的治疗目标19- - - - - -22]。体外COL1A1 PTC的差别的研究表明,对这些基因的细胞系(TPC-1)抑制细胞增殖,入侵,和迁移23,24]。VCAN是一个大型的细胞外基质蛋白多糖。除了细胞粘附和组织形态发生,它也与肿瘤发生及肿瘤进展(25]。增加表达VCAN据报道在一些癌症和与不良结果(22,26- - - - - -28]。一些研究表明,VCAN的表达是调节在甲状腺癌组织中,这是与甲状腺癌的恶性行为(29日,30.]。过渡委员会是一种细胞外基质在成人组织中表达的糖蛋白,通常低31日]。然而,它的表达增加疾病进行组织重构,如癌症(31日]。大多数上皮的恶性肿瘤,肿瘤基质的沉积增加过渡委员会,这是与不良预后相关(32- - - - - -34]。Reexpression过渡委员会也被观察到在乳头状甲状腺髓样癌(35,36]。MMP14是膜式基质金属蛋白酶,调节过程,如细胞外基质降解和重塑,癌症细胞入侵和转移(37]。它已经表明,MMP14参加epithelial-mesenchymal过渡,促进了各种癌症的进展,如肝癌、乳腺癌,神经胶质瘤,肉瘤(38- - - - - -41]。MMP14被发现显著增加的表达在甲状腺肿瘤细胞系和PTC样本(42,43),与甲状腺癌的侵袭性44]。APCDD1L被发现与主动脉疾病(45)和与吸烟有关的DNA甲基化在伏隔核(46),但它对癌症的影响从来没有报道。
总之,我们证明了TNRC6C函数作为一个肿瘤抑制和PTC经常表达下调。我们也寻找TNRC6C的下游靶基因研究。TNRC6C潜在目标,如CTHRC1 APCDD1L, COL1A1, VCAN,过渡委员会,和MMP14,可能扮演了一个重要的角色在PTC(列车自动控制系统)的开发和发展。TNRC6C可以作为一种有用的治疗目标和对PTC病人预后标记。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在文章或可从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(批准号:81972497)。
补充材料
小干扰rna序列中可以找到所有底漆和补充表1。(补充材料)