抵抗素激活p65通路，通过角蛋白降低糖原含量8

摘要

抵抗与代谢综合征和炎性病症相关联。许多研究表明，抵抗抑制糖原积累;然而，抵抗引起的减少糖原含量的确切机制尚不清楚。角蛋白8是一个典型的上皮中间丝蛋白，但大量的研究表明K8的葡萄糖代谢中的重要作用。但是，它仍然不知道是否K8细胞中的糖原积累的抵抗引起的减少的调解参与。在这项研究中，我们发现NF-κB的p65亚基的：抵抗表达上调κB，从而导致促进K8转录表达的;反过来，K8的表达抑制在HepG2细胞中的糖原积聚。

1.介绍

抵抗素是脂肪细胞分泌的重要细胞因子之一。它于2001年被发现[1]，被视为肥胖和II型糖尿病（T2DM）之间的联系。抵抗素在肥胖的人类和小鼠更高水平的表达比瘦对照[2，3]。用重组小鼠抵抗治疗受损的葡萄糖耐受和胰岛素的活性和诱导的肝胰岛素抗性[4]。重组鼠抵抗素通过降低磷酸化GSK-3水平，显著降低糖原含量β导致肝胰岛素作用受损[五]。尽管许多研究都试图澄清糖原含量抵抗引起的下降的机制，抵抗和糖原之间的关系尚不清楚。

角蛋白是一种典型的上皮中间丝蛋白[6]。角蛋白作为上皮细胞骨架的组成成分，在维持上皮细胞和组织的稳定性和完整性方面发挥着重要作用[7]。一些角蛋白也在细胞信号通路中起调节作用[8，9]。角蛋白也被用作诊断癌症的生物标志物[10]。角蛋白8的研究表明，它是角蛋白家族的重要成员，在葡萄糖代谢中发挥重要作用[9，11]。虽然肝细胞摄取葡萄糖及其代谢物的问题主要归因于慢性胰岛素相关疾病，但也有证据支持糖尿病与各种恶性肿瘤之间的相关性[12-15]。糖原贮积病和肝细胞异常之间类似的相关性存在。K8 / K18从肝细胞缺失促进胰岛素引起的糖原积累。在高葡萄糖培养条件，缺失或在肝细胞和肝癌细胞（肝癌）敲低K8 / K18的显著促进糖原累积[9]。其他研究发现K8乙酰化促进核周围角蛋白丝的组织。乙酰化还调节K8位点特异性磷酸化，这一修饰与K8的溶解性密切相关[16]。值得一提的是，K8的灯丝组织由葡萄糖浓度调节[17]。总之，现有数据表明K8的葡萄糖代谢中的重要作用。但是，它仍然不知道是否K8介导抵抗诱导细胞减少糖原积累。在这项研究中，我们报道了抵抗上调P65，通过促进K8的转录抑制在HepG2细胞中的糖原积累。

2。材料和方法

2.1。物料

TRIzol试剂购自Takara(中国大连)，Lipofectamine^TM2000年从Invitrogen公司(美国卡尔斯巴德)获得。抗NF-的抗体κ乙P65亚基自Santa Cruz Biotechnology（圣克鲁斯，CA，USA）购买。重组人抵抗被自PeproTech公司（Rocky Hill的，NJ，USA）购得。葡萄糖检测试剂盒从Applygen技术有限公司（北京，中国）。小干扰RNA（siRNA）由IBS生物（中国上海）合成。的双荧光素酶测定试剂盒购自Promega（麦迪逊，WI，USA）购得。染色质免疫沉淀（ChIP）测定试剂盒是来自Millipore（伯灵顿，MA，USA）。

2.2。动物实验

Male C57BL/6J mice (8 weeks old) were purchased from Huafukang Biotech (Beijing, China) and housed in individual plastic cages at around 25°C under a 12 : 12 h light-dark cycle with free access to water and food. Mice were divided into two groups (control and resistin-treated), 6 mice for each group. All of the mice were put on a standard chow and water diet. Animals in the group treated with resistin received 400 ng resistin daily for 6 days by injection via the vena caudalis [18]。禁食一晚后，第7天处死小鼠，立即收集肝脏，液氮速冻，- 70℃保存，分析前。湖北省实验动物护理委员会批准了所有程序。

2.3。组织学

肝脏组织样本(ñ = 6) were gathered 24 h after tail vein injection with or without resistin and fixed in 10% formalin solution. The samples were processed and embedded in paraffin. Hematoxylin and eosin (H&E) staining was used to identify and describe the different tissues and structures within them. Rehydrated slides were rinsed for 1 min in distilled water, immersed in hematoxylin (Servicebio, China) for 5 min, and rinsed in running tap water for 10 min. The slides were then rinsed in 80% ethanol for 1 min and immersed in eosin (Servicebio) for 5 min. Finally, the slides were dehydrated, cleared, and mounted with coverslips. Periodic acid-Schiff (PAS) staining was used to assess the glycogen content. Slides were rinsed in distilled water and immersed in PAS staining solution B (Servicebio) for 15 min, rinsed with distilled water, and immersed in PAS staining solution A (Servicebio) for 30 min. The slides were then rinsed in running tap water for 10 min, counterstained with PAS staining solution C for 30 s, rinsed, dehydrated, cleared, and mounted with coverslips.

2.4。细胞培养

HepG2 (ATCC)细胞在DMEM培养液(HyClone, Thermo Scientific, Logan, UT, USA)中加入10%胎牛血清(FBS，浙江天行)、100 U/mL青霉素和100 U/mL青霉素μ克/ mL链霉素，并在含有5％CO的潮湿室中在37℃培养₂。

2.5。向量和转染

对p65的表达载体（的pcDNA3.1-P65）是通过将自HepG2细胞得到的RNA到pcDNA3.1逆转录和PCR的产物构成。对于p65和K8的siRNA从IBS（上海，中国）。除非另有说明，所有的实验在三个独立的实验，每个重复进行三次。载体和siRNA转染到在无血清培养基中的细胞。The samples were prepared for transfection as follows: (A) to a 1.5 mL tube, we added 50 μL opti-MEM培养基，取适量lipofectamine 2000，轻轻混合，室温静置5分钟。(B)在另一个1.5 mL试管中，加入50个μL opti-MEM培养基与稀释的DNA质粒轻轻混合，室温静置5分钟。(C) 5min后，将A和B轻轻混合，室温孵育30min，形成DNA-lipofectamine 2000复合物。转染细胞用无血清培养基洗涤3次，洗涤20 min，洗涤100次μL含有dna -脂质体胺2000络合物和400的混合物μ加入L opti-MEM。37℃孵育6h，换生长培养基。转染24h后收集细胞以分离RNA或蛋白。

2.6。RNA隔离

用Trizol试剂(Takara，大连，中国)提取总RNA。简单地说,500年μ大号Trizol试剂加入到每个孔在24孔板中。收集细胞并200 μ加入L氯仿，12000 rpm离心15min。收集上相，加入等体积的异丙醇，12000 rpm离心10 min。沉淀用500洗涤两次μL取75%乙醇，8000 rpm离心5分钟，风干，30 - 50溶解μL的DEPC水，储存在- 80℃。使用紫外可见分光光度计(SMA4000)评估RNA质量。RNA的质量一般较高(平均260/280比值为2.02，平均260/230比值为1.79)。

2.7。互补脱氧核糖核酸逆转录

下列反应混合物(30μL) was prepared in 1.5 mL tubes: RNA sample, 5 μL;3 .低聚物T18 (20 nmol/LμL;dNTP (20 nmol/L), 3 μL;M-MLV逆转录酶，0.5μL;核糖核酸酶抑制剂,0.5μL;5×M-MLV缓冲液，6 μL;和DEPC水，12 μL.我们将混合物在42℃和90℃下孵育1 h, 10分钟以停止反应，并将样品保存在−20℃。

2.8。定量实时聚合酶链反应

对于实时PCR，我们跟着文等人的方法。[19]。用于qRT-PCR的引物序列见表1。

2.9。荧光素酶检测

Cells were seeded into 24-well plates at a concentration of 1.0∼2.5 × 10³细胞和使其生长过夜。When it comes up to 80% confluency, the cells were incubated in serum-free DMEM for 6 h before transfection. We cotransfected the recombinant vector (pGL3-K8 promoter) or empty vector (pGL3-basic) with p65-expression plasmids (pcDNA3.1-p65) into the cells using Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) following the manufacturer’s protocol. The pGL3-basic vector, containing the Firefly luciferase reporter, was used for normalization. After 24 h, Firefly and Renilla luciferase activities were measured consecutively using the dual-luciferase assay. Three independent experiments were performed each in triplicate.

2.10。葡萄糖和糖原含量的测定

用葡萄糖检测试剂盒(Applygen)检测培养基中的葡萄糖浓度。用贝克曼Coulter DU 800紫外可见分光光度计在500 nm处测量吸光度。所有的样品都归一化到蛋白质总量。用糖原测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)对各组糖原水平进行评估，结果按照厂家说明归一化成标准曲线，以每毫升蛋白的糖原毫克数表示。

2.11。染色质免疫沉淀

染色质免疫沉淀（ChIP）测定法使用根据制造商的说明染色质免疫沉淀试剂盒（Millipore）上进行的。Briefly, HepG2 cells were seeded 24 h before and fixed with 1% formaldehyde for 15−20 min to crosslink the chromatin; the reaction was then stopped by adding glycine to a final concentration of 0.125 M. The cells were disaggregated by homogenizing, passed through a 200 μm孔滤器，4℃1000rpm离心5min。细胞颗粒在500年复悬μL细胞裂解液和2.5μL蛋白酶抑制剂，冰孵育15分钟，离心在4℃下放置5分钟。丢弃上清液，细胞重悬于500μ大号核裂解液和2.5 μL蛋白酶抑制剂。然后细胞被超声分解成200 - 1000bp的片段，然后4℃离心10分钟，去除不溶性物质。对于每个IP反应，我们在1.5 mL的试管中准备如下的混合物:稀释缓冲液，450μL;蛋白酶抑制剂，2.25 μL;的DNA片段，50 μL;主要抗体,2μG;和蛋白G磁珠，20 μL.我们将样品在4℃恒温旋转过夜，磁收集蛋白g抗体复合物，第二天去除上清。我们用500洗蛋白质GμL时低盐免疫复合物的洗涤缓冲液，高盐的免疫复合物的洗涤缓冲液，氯化锂的免疫复合物的洗涤缓冲液，和TE缓冲液，的。我们增加了100 μL芯片洗脱缓冲液，1μL of protease K and incubated at 62°C for 2 h and then at 95°C for 10 min. We transferred the protein G complex to a new tube, added 500 μL结合试剂A，将样品用收集管放在柱上，离心30年代。然后我们用500洗涤柱μL洗涤缓冲液B，用50洗脱μL的洗脱缓冲液c，我们纯化DNA作为PCR模板。PCR在以下条件下进行:95℃5 min，然后进行30个循环:94℃20 s, 60℃30 s, 72℃30 s, 72℃最后延长5 min。ChIP实验所用的引物列于表中2。

2.12。统计分析

Data are presented as means ± standard deviation (SD). Statistical analyses were performed by GraphPad Prism 5.0 using the unpaired two-tailedŤ-检验(两组)及方差分析(ANOVA);多个组)。<0.05为差异有统计学意义。

3.结果

3.1。抵抗素下调肝和HepG2细胞中的糖原水平

在我们以前的研究，血糖，胰岛素和甘油三酯水平被发现与治疗抵抗六天[C57BL / 6J小鼠显著增加19]。在本研究中，我们旨在研究抵抗素对糖原储存的影响。

八周龄雄性C57BL / 6J小鼠用或不用抵抗治疗，在肝脏中糖原使用试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国）测量。肝脏组织切片用H＆E，这表明有在抵抗处理组的肝细胞质比对照组更大量和更大的液泡（图染色图1（a）)。PAS染色直接测定糖原含量。PAS染色和糖原含量测定均显示，与对照组相比，抗药小鼠肝脏中的糖原含量显著下降(图)图1（a）和图1（b）)。

为了验证结果的体外，我们处理的HepG2细胞与人重组抵抗素蛋白。The results showed that treatment of HepG2 cells with different concentrations of resistin for 24 h resulted in substantial inhibition of cellular glycogen accumulation. Although the accumulation amount of glycogen was inversely correlated with resistin dosage (Figure图1（c）), even a low concentration (25 ng/mL) of resistin resulted in a significant reduction of glycogen levels.

以前的研究报告说，抵抗禁止显示胰岛素介导的细胞对葡萄糖的摄取[20，21]。To clarify whether the reduction in cellular glycogen content was due to resistin-mediated inhibition of cellular glucose uptake, we measured the glucose content in HepG2 cell medium 12 h after resistin treatment. The results showed that resistin did not significantly affect glucose uptake in the absence of insulin (Figure1（d）)，但大大降低了糖原含量。这些发现表明抵抗素对糖原积累的作用是通过一种机制而不是通过降低葡萄糖摄取来介导的。

此外，使用qRT-PCR检测了抵抗素处理和不处理小鼠和HepG2细胞中糖原代谢相关基因的表达。结果表明，糖原合酶(GS)和糖原激酶3 beta (GSK-3)的表达明显增强β)在处理后的小鼠肝脏和HepG2细胞中显著降低，但糖原磷酸化酶(GP)不受抵抗素的影响(图)1（e）中和图1（f）)。

3.2。在抵抗稳压糖原生物合成的K8中的作用

由于之前的数据已经表明葡萄糖代谢的K8至关重要的作用，我们研究了在调节糖原生物合成抵抗和K8之间的相互作用。HepG2细胞的siRNA K8转染（图图2（a）)，导致24小时后糖原积累显著增加(图)图2（b）)。We then treated HepG2 cells with resistin for 24 h after K8 knockdown and measured the glycogen accumulation in the cells. Resistin significantly counteracted the increased glycogen accumulation caused by K8 ablation (Figure图2（c）)。总之，这些发现表明抵抗素抑制糖原积累的部分原因是K8的作用。

3.3。p65直接与K8启动子结合

为了确定抵抗素调控K8的机制，我们构建了含有K8启动子的双荧光素酶报告载体(图)图3（a）)。利用Genomatix (http://www.genomatix.de/），并确定潜在的转录因子结合位点。一共5个NF的κK8启动子上发现了B结合位点，其中两个部分重叠，作为一个位点进行分析(图)图3（b）)。p65蛋白，NF-的亚基κ是一种核转录因子，在许多细胞过程中发挥调节作用。然而，它是否直接调控K8转录尚不清楚。将含有K8启动子(pGL3-K8启动子)或空载体(pGL3-basic)的双荧光素酶报告载体与p65表达质粒(pcDNA3.1-p65)一起转染到细胞中。荧光素酶检测显示，p65显著增强了K8启动子的活性(图)图3（c）)。

为了进一步验证p65与K8启动子的直接结合，我们进行了ChIP实验。结果显示，p65直接结合K8启动子区域的−949/−935和−382/−363位点，调控其转录(图)3 (d))。

3.4。抵抗调控对K8转录通过P65

为了确定p65蛋白是否参与K8的抵抗介导的转录调控，我们测量在与抵抗处理，并用对p65的表达质粒转染的HepG2细胞K8表达。两者的p65过表达和治疗抵抗发现诱导K8 mRNA的上调显著（图4(一)和4 (b))。为了验证抵抗素调控K8到p65的转录，我们用p65 siRNA转染HepG2细胞(图)4 (c)) and then treated the cells with resistin for 24 h. Knockdown of p65 suppressed resistin-induced upregulation of K8 mRNA (Figure4 (d)，表明抵抗素通过p65调控K8的转录活性。

3.5。P65是参与糖原累积至K8以抵抗调控

为了明确抵抗素对糖原含量的下调是否是通过p65与K8启动子的结合来介导的，我们首先分别用qRT-PCR和Western blot检测了抵抗素对p65 mRNA和蛋白表达水平的影响。结果与之前的发现一致，抵抗素在mRNA水平和蛋白水平上刺激了p65的表达(图)5(一个)和图5（b）)。然后，我们转染的HepG2细胞的pcDNA3.1-P65 / siRNA的-p65和单独或组合的siRNA-K8，用或不用抵抗处理，并测量糖原含量。结果表明，抵抗调节在K8依赖性方式糖原含量（图图5（c）和图5（d）)。

4.讨论

角蛋白作为细胞骨架家族的重要组成部分，自20世纪70年代以来得到广泛研究[21-23]。但是早期的研究主要集中在角蛋白的结构和生物多样性上，而没有进行功能分析。虽然角蛋白被广泛用作诊断癌症的生物标志物[24]，就比他们在维护结构中的作用等职能的研究尚不多见。近年来，角蛋白被发现在细胞凋亡的关键作用[24，25]，细胞生长[26，以及伤口愈合[27]。在正常和癌小鼠肝细胞K8 / K18的缺失促进胰岛素介导的葡萄糖摄取[28，表明角蛋白在新陈代谢中发挥作用。角蛋白在抵抗介导的糖原积累中的调控作用是本研究的基础。

本研究探讨了抵抗素和角蛋白8在糖代谢调控中的关系。抵抗素的浓度范围很广(从正常个体的25ng /mL到糖尿病患者的200ng /mL)，可以抑制肝细胞内的糖原积累，而抵抗素浓度较低时，肝细胞内的糖原积累会发生显著抑制。因此，在本研究中，我们使用低水平(25 ng/mL)的抵抗素来保持在生理正常范围内。几个研究小组已经报道了K8/18在葡萄糖代谢中的调节作用;然而，具体的机制尚未得到解决。在本研究中，我们发现抵抗素通过K8调节肝细胞中糖原的积累，为角蛋白在葡萄糖代谢中的作用提供了额外的证据。

许多研究已经证明了抵抗素和炎症之间的关系。人抵抗素刺激促炎细胞因子TNF-α和IL-12的巨噬细胞通过NF-κB-依赖性途径[29]，而外源抵抗促进P50 / p65和其核易位的二聚化。抵抗也可上调p65的mRNA的表达和蛋白水平[三十，31]。我们还证实了人抵抗素以剂量依赖的方式增加了p65的表达[32]和p65的过表达基本上抑制糖原累积在HepG2细胞中。然而，K8的沉默显著逆转由p65的过量表达诱导的糖原积聚的抑制，这表明p65的可以通过直接控制K8转录表达调节细胞的糖原积聚。我们的研究结果证实，通过角蛋白抵抗和炎症之间的关系和抵抗介导的糖原积累的机制有了新的认识。有趣的是，虽然这两个抵抗和p65表达可以减少糖原，我们没有发现有抵抗和p65叠加效应抑制糖原含量（图图5（c）)。一种可能的解释是，一个补充机制的存在，它保持细胞内环境稳定;这种机制仍有待验证。

已有报道表明K8乙酰化促进核周角蛋白丝组织[17]。乙酰化也调节K8位点特异性磷酸化，调节K8溶解度[17]。体外，葡萄糖促进K8乙酰化，而K8乙酰化本身在糖尿病小鼠中被发现增加[28]。蜂窝糖原堆积抵抗诱导的抑制是不同的生理条件下会发生变化的多个调控过程的结果。但是，现在还没有，如果抵抗蛋白水平或者长丝重组起着糖原积累的调控中起主导作用的影响K8长丝重组闻名。这些问题的答案将有助于解释为什么抵抗在糖代谢多种功能和便利的新型降糖药的开发。

总之，我们发现，抵抗上调p65的表达，而P65促进K8转录表达通过直接结合到K8启动子，其抑制细胞糖原累积。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的数据是可用的，请相应的作者。

的利益冲突

未报告潜在的与本文相关的利益冲突。

作者的贡献

这颗温家宝与谯西阿同等贡献这项工作。在庆洋构思所提出的想法。谯息呵设计的研究和部分采集的数据。这颗文促成了研究数据，讨论，并起草了手稿。张辉和海鹏施促成了动物实验。阿明拉杰什提供了重要修订。鄢陵吴易阳分析和解释数据。在庆洋是这项工作的担保人和，因此，不得不完全访问所有的研究数据，并采取了数据的完整性和数据分析的准确性承担责任。

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金项目(编号:)的资助。河南省高等教育骨干教师培养计划(编号:U1804118)2018GGJS052)，河南科技大学博士学位研究启动基金(编号:4025/13480073)。作者感谢LetPub (https://www.letpub.com）对这个手稿的制备过程中的语言援助。

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