PI3K / AKT的角色/ mTOR嗜铬细胞瘤和MAPK / ERK信号通路在人类

文摘

目标。PI3K / AKT的角色/ mTOR和MAPK / ERK途径参与嗜铬细胞瘤和副神经节瘤的发病机制主要由展示(PPGL)在体外研究老鼠细胞,主要是在转录水平。本研究旨在探讨这些通路的影响在人类PPGL细胞的增殖和PPGLs这些通路的激活。方法。人类PPGL细胞接受舒尼替和PI3K的抑制剂(LY294002) MEK1/2 (U0126)和mTORC1/2 (AZD8055)。通过MTT测定细胞增殖检测。蛋白质磷酸化是被西方墨点法。结果。在大多数PPGLs, AKT、ERK1/2 mTOR被激活。LY294002 (10μ米),U0126 (10μAZD8055(1米)μ和舒尼替(1米)μ在10米)抑制PPGL细胞增殖的主要文化组织,包括患者的四个基因突变。MEK1/2 mTOR磷酸化抑制剂减少了。一种蛋白激酶的磷酸化和ERK1/2抑制mTOR减少。舒尼替抑制phospho-ERK1/2 phospho-mTOR。结论。我们的研究表明,PI3K / AKT / mTOR和MAPK / ERK信号通路在人类PPGL和扮演重要角色在大多数PPGLs被激活。抑制多个通路可能是PPGLs的新治疗方法。

1。介绍

嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PPGLs)是神经内分泌肿瘤起源于adrenomedullary嗜铬细胞和extra-adrenal嗜铬细胞的交感和副交感神经节。相关的肿瘤是危及生命的并发症由于释放catecholamines-norepinephrine,肾上腺素和多巴胺(1]。一旦建立了诊断,治疗的选择是彻底的切除。

PPGLs大部分是良性的,手术治愈,但当他们是恶性肿瘤,复发,或不能移动的一些有效的治疗方法是可用的(2]。PPGL密集研究肿瘤发生导致靶向药物的开发旨在提高肿瘤的结果。PPGLs通常分为两个主要的集群(3- - - - - -9]。集群1包括肿瘤与冯Hippel-Lindau VHL基因和琥珀酸脱氢酶的亚基(SDHx)突变导致失调缺氧克雷布斯循环和激活的信号通路(10]。集群2涉及到肿瘤的突变在转染(RET)重新排列,neurofibromin 1 (NF1),驱动蛋白家族成员1 B (KIF1Bb)、跨膜蛋白127 (TMEM127)和MYC-associated因子X (MAX),这与异常激活′磷脂酰肌醇3激酶(PI3K) /蛋白激酶B(一种蛋白激酶),增殖蛋白激酶(MAPK) /细胞外signal-regulated激酶(ERK)和哺乳动物雷帕霉素靶C1 (mTORC1) / p70S6K [11]。

最近的研究在prosurvival分子途径如PI3K / AKT / mTOR和MAPK / ERK透露,他们扮演了一个重要的角色在肿瘤发生的一系列广泛的肿瘤,包括PPGLs [12]。MAPK途径的作用的发病机理PPGL记录了许多研究[13,14]。调节mRNA表达涉及MAPK信号通路被观察到的RET / NF1 / TMEM127-related PPGL组织(15]。此外,升高的一种蛋白激酶磷酸化零星PPGLs被发现利用免疫印迹和免疫组织化学检测16]。此外,抑制PI3K / AKT途径可以有效地抑制大鼠嗜铬细胞瘤增殖PC12细胞在体外(17]。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶参与细胞生长和增殖的规定,由两个不同的蛋白激酶复合物,mTORC1和mTORC218]。mTOR的失调与人类肿瘤相关信号通路被发现,包括PPGLs [19]。最近,Giubellino等人发现mTOR的表达(mTORC1和mTORC2) mRNA在PPGLs SDHB和更高的比在正常肾上腺髓质(VHL基因突变20.]。AZD8055,一种新发现的抑制剂针对mTORC1和mTORC2被发现能够显著抑制老鼠PPGL细胞的增殖和迁移在体外,这表明目标抑制mTOR承诺为PPGLs[是一个新颖的治疗选择20.]。

越来越多的证据表明,上述途径PPGLs的发病机制中扮演重要的角色,主要由在体外研究大鼠或小鼠细胞。此外,信号通路参与PPGLs主要是观察在转录水平和对人类PPGLs这些通路的激活和角色。此外,没有研究已经进行了关于这两个重要的细胞通路之间的相声,PI3K / AKT / mTOR和MAPK / ERK在PPGLs。在这项研究中,我们审查的影响PI3K / AKT / mTOR和MAPK / ERK途径在人类PPGL细胞的生长和他们的相互作用。我们也观察到这些途径中的关键蛋白的磷酸化水平PPGLs有不同的基因突变。

2。材料和方法

2.1。试剂

LY294002 (PI3K抑制剂)和U0126 (MEK1/2抑制剂)和3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)和bicinchoninic酸(BCA)装备从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。AZD8055 (mTORC1/2抑制剂)和舒尼替(多目标受体酪氨酸激酶抑制剂)采购从塞莱克(美国得克萨斯州休斯敦的)。PPGL细胞保持在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)补充15%胎牛血清的边后卫和50个单位/毫升青霉素/ 50毫克/毫升链霉素(Gibco-Life技术,大岛,纽约,美国)。抗体phospho-AKT (Ser473) phospho-p44/42MAPK (ERK1/2) (Thr202 / Tyr204),和phospho-mTOR (Ser2448)从细胞信号技术(美国贝弗利,MA)。β肌动蛋白抗体来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。二次抗体是辣根peroxidase-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白(MultiSciences,北京)用于p-AKT p-ERK1/2,β肌动蛋白和山羊anti-rabbit免疫球蛋白p-mTOR (MultiSciences,北京)。蛋白酶抑制剂的鸡尾酒是罗氏公司(美国印第安纳波利斯,)。组织蛋白提取试剂购自Applygen技术(中国,北京)。

2.2。人类肿瘤样本

在手术切除肿瘤样本收集。新鲜肿瘤组织是立即治疗细胞培养或冷冻免疫印迹的研究。PPGLs组织病理学确认。所有患者筛查的种系突变VHL, RET, SDHB SDHC, SDHD基因。此外,九nonmetastatic PPGLs(与VHL基因突变与RET突变,3,和3 SDHB突变)是西方墨点法收获。临床资料的病人展示在表1。知情同意是获得所有主题和PUMCH伦理委员会批准的这项研究是对人类研究S-K084的IRB批准文号。

2.3。细胞培养

人类PPGL细胞主要是培养如前所述[21]。总之,人类PPLG细胞是由连续的胶原酶(I型)消化PPGL组织和孵化的DMEM补充15%的边后卫和抗生素在37°C公司5%₂的气氛。细胞被允许在标准条件下坚持和成长完全。

2.4。药物治疗和蛋白质提取

人类PPGL细胞被镀成6-well 10板的密度⁵细胞/好,直到他们被允许增长80%汇合的。然后,刺激细胞治疗来确定最优的时间和最优抑制剂浓度如下:(1)血清饥饿6小时后,细胞治疗血清(在血清培养基的最终浓度为15%)为不同的潜伏期(5、15、30和60分钟)。(2)Serum-starved细胞选择性拮抗剂的使用浓度增加,包括LY294002 (0.1、1、5、10μ米),U0126 (0.1、1、5、10μ米),AZD8055 (0.01, 0.1, 1, 5μM)和舒尼替(0.01,0.1,1μ米)30分钟,并与血清刺激(相同的最终浓度如前所述)5分钟。最后,细胞收获一种蛋白激酶的磷酸化,ERK1/2, mTOR取决于西方墨点法。因为serum-stimulated细胞有明显的积极的表达p-AKT, p-ERK1/2 p-mTOR,细胞治疗血清自然可以作为一个积极的控制。在确定最优刺激对手的时间和浓度,细胞使用LY294002 (10μ米),U0126 (10μAZD8055(1米)μ舒尼替(1米)μ米),或车辆30分钟和血清孵育5分钟。细胞然后用冰冷的PBS收集和清洗两次。溶菌产物是准备与细胞裂解缓冲补充完整的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒。之后,溶解产物离心机在4°C 10000×g 10分钟和上层清液总蛋白的定量检测用BCA化验。冷冻组织在组织蛋白质提取试剂均质在冰上根据制造商的协议。在装货前的可溶性蛋白质含量测定。

2.5。免疫印迹分析

西方墨点法进行了描述与少量修改之前22]。蛋白质在8% - -12% sds - page分离,转移到聚乙二烯二氟化物膜,用牛奶和阻塞。膜是孵化主要抗体p-AKT, p-ERK1/2 p-mTOR,β肌动蛋白在一夜之间在4°C,然后与辣根peroxidase-conjugated二级抗体室温1小时。的乐队是可视化增强化学发光(ECL)检测系统(通用电气医疗集团,小都,英国)。

2.6。细胞增殖实验

细胞被镀成96 -孔板的密度4×10⁴200细胞/在最后一卷μL和培养4天。之后,细胞被孵化新的15%的边后卫DMEM有或没有LY294002 (10μ米),U0126 (10μAZD8055(1米)μ和舒尼替(1米)μM) 48小时。培养基被和MTT的解决方案是添加到盘子。细胞培养在37°C 1小时。然后中被删除,添加DMSO溶液是溶解的紫色甲瓒晶体三个小时。最后,盘子上阅读标(Bio-TEK仪器,佛蒙特州,美国)在490纳米过滤器在630 nm的引用。对于每个PPGL样本(),5套(或组)井的设置,每组有4口井。

2.7。统计分析

数据统计分析采用SPSS 14.0软件包。免疫印迹的数据表示为±标准错误,和差异是由成对样品评估的重要性以及。同时,细胞增殖测定的数据作为意味着±标准差,和意义的差异是评估通过独立样本t以及。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。一种蛋白激酶的磷酸化,ERK1/2, mTOR PPGL组织

是否PI3K / AKT / mTOR和MAPK / ERK途径被激活在PPGLs仍未知。因此,我们研究了一种蛋白激酶的磷酸化,ERK1/2, mTOR PPGL肿瘤样本。首先,磷酸化6样本中,检测出的用途在体外实验,结果显示,p-AKT p-ERK1/2, p-mTOR很大差异与不同的人类PPGL组织(图1(一))。澄清这些变化是否由遗传背景的肿瘤,9 PPGLs不同基因突变进行了分析。图1 (b)表明ERK1/2在所有PPGLs和AKT激活,mTOR被激活在大多数肿瘤。一种蛋白激酶的磷酸化和ERK1/2似乎更加明显在SDHB-related PPGLs比VHL-related PPGLs。mTOR磷酸化被发现在所有三个SDHB-related PPGLs,虽然是只发现在一个VHL-related肿瘤。RET-related PPGLs显示明显的激活的一种蛋白激酶,ERK1/2 mTOR激活中检测出的两个三RET-related肿瘤。

3.2。通路抑制剂的一种蛋白激酶磷酸化,ERK1/2, mTOR

数据2(一个)- - - - - -2 (d)表明,LY294002 U0126、AZD8055和舒尼替剂量依赖性抑制一种蛋白激酶,ERK1/2或mTOR磷酸化在10的最佳浓度μM (LY294002和U0126)和0.1 - 1μ米(AZD8055和舒尼替)。与血清刺激的细胞不同时间的时间造成的磷酸化ERK1/2和AKT的最大效应发生在5分钟。此外,mTOR高度激活(图5分钟后刺激2 (e))。治疗LY294002 (10μ只有一种蛋白激酶磷酸化M)减少。U0126 (10μ米)抑制ERK1/2磷酸化和表达下调mTOR的激活。AZD8055 (1μ米)显著地抑制一种蛋白激酶的激活,ERK1/2, mTOR。治疗舒尼替(1μ米)在PPGL细胞显著下调ERK1/2和mTOR磷酸化。研究结果表明,之间有一个相声MAPK / ERK和PI3K / AKT / mTOR信号通路(数字2 (f)- - - - - -2(我))。

3.3。通路抑制剂对人类PPGL细胞的扩散

确定的角色PI3K / AKT / mTOR和MAPK / ERK信号通路在人类PPGL细胞的生存,人类PPGL细胞,分别用相应的抑制剂的治疗途径。如图3,LY294002 (10μ米),U0126 (10μAZD8055(1米)μ和舒尼替(1米)μ在10米)抑制PPGL细胞增殖的主要文化组织从不同的病人,包括四个基因突变的患者(2与RET突变,1与SDHD突变,与SDHB突变)和1(数字3(一个)和3 (b))。只有在两个不相关的文化做了细胞无法应对LY294002的治疗。细胞在另三个不相关的文化没有回应U0126(图3(一个))。mTORC1/2抑制剂和舒尼替施加更强的抑制PI3K相比,影响细胞生长抑制剂和MEK1/2抑制剂(图3 (b))。

4所示。讨论

理解PPGLs所涉及的信号通路的变化可以帮助我们寻找新的肿瘤治疗的目标。在这项研究中,我们调查了角色相关的发病机制通过阻断信号通路的通路与各自的抑制剂,在试图了解这些途径的影响肿瘤细胞的生存。

来自大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞,被广泛地用作PPGLs发病机理的研究模型。另一方面,一些研究人员也使用一个新建立的小鼠嗜铬细胞瘤细胞系的杂合的基因敲除小鼠(NF123]。虽然他们都是嗜铬细胞瘤的起源,他们未必会接受真正的人类catecholamine-producing肿瘤的分子和功能变化在活的有机体内。在我们的研究中,我们使用的主要文化人类PPGL细胞和可能的条件可以更好地模仿人类PPGLs的环境。

这项研究显示,分别阻断PI3K / AKT / mTOR和MAPK / ERK信号通路能够抑制人类PPGL细胞来自患者不同的增殖基因背景。此外,免疫印迹的研究表明,PI3K / AKT / mTOR和MAPK / ERK信号通路被激活PPGL细胞治疗血清时,表明这些信号通路在肿瘤发生在功能上是相关的。据我们所知,这是第一个实验证据显示很强的相关性之间的嗜铬细胞瘤细胞的致瘤性,这些信号分子的活动在人类主要细胞培养模型。

之间的广泛的相声PI3K / AKT / mTOR和MAPK / ERK途径已经先前记录。这两个信号通路已被证明是与胰岛素之间的相声和Angⅱ系统。ERK磷酸化刺激Angⅱ抑制insulin-induced IRS-1 / PI3K / AKT通路的激活(24]。我们的研究表明,抑制mTOR的MEK导致减少磷酸化。同时,特定的抑制mTOR激活AZD8055 AKT和ERK的磷酸化。这些结果支持这样的观点:PI3K / AKT / mTOR和MAPK / ERK信号通路都不是独立的,而是互动的。补偿PI3K / AKT激活和MAPK信号通路已经证明之前(25]。在人类神经内分泌肿瘤细胞系,堵塞Raf抑制ERK1/2磷酸化但强烈诱导一种蛋白激酶磷酸化,表明这两个通路之间存在一个补偿反馈回路(26]。相反,PI3K信号通路诱导的upregulation造成MEK抑制表皮生长因子(27]。然而,这种补偿反馈回路在我们的研究中没有被观察到。此外,能够很好的证明,MEK / ERK和抑制mTOR对前列腺癌都大大提高了抗肿瘤的影响在体外和在活的有机体内(28]。最近的一项研究表明,治疗NVP-BEZ23 (PI3K / mTORC1/2抑制剂)结合洛伐他汀(ERK1/2抑制剂)施加显著加抗肿瘤可行性鼠标PPGL细胞系(29日]。鉴于这些发现,一个问题是否并发MAPK和抑制mTOR可能导致大幅增强的抗肿瘤对人类PPLG细胞的影响。

mTOR作为连接器PI3K / AKT信号和重要的下游通路之间是细胞增殖和生存的主监管机构(30.]。AKT激活促进mTORC1信号通路通过减少TSC1/2抑制(19),而独自mTOR-C1抑制导致补偿的一种蛋白激酶信号通路介导激活mTOR-C2 [31日]。在目前的研究中,人类PPGL mTORC1/2-mediated抑制细胞增殖是最强的相比PI3K MAPK-mediated抑制,表明mTOR可能是一个细胞增殖的主要监管机构。我们还发现抑制mTOR-C1和mTOR-C2强烈表达下调AKT激活,并发现符合结果中观察到大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞瘤模型,表明PP242,双重mTOR复杂的1和2抑制剂,但不是雷帕霉素,显著抑制肿瘤的生长,表明mTORC-2抑制起着重要的作用,可能会扰乱mTORC1-dependent负面反馈循环(32]。因此,抑制mTOR-C1和mTOR-C2 PPGLs可能是一个新颖的治疗方法,可能克服单独使用mTOR-C1抑制剂相关的问题。最近的一项研究中,通过与mTOR-C1分别使转染,mTOR-C2,和mTOR1/2小干扰RNA,发现有针对性的抑制mTORC-2或mTORC1/2,但不是mTOR-C1,可以有效防止扩散,迁移和入侵和促进PC12细胞系的细胞凋亡33]。这些数据表明,针对mTOR-C2可能是小说PPGLs的替代治疗。尽管如此,mTORC2-specific抑制剂并不可用,更多的研究是必要的证实的猜测。

舒尼替是一种小分子multitargeting受体酪氨酸激酶的抑制剂(RTK),反血管增生和抗肿瘤活性,主要目标血管内皮生长因子受体(VEGFRs) [34,35]。它已经发现,PI3K / AKT蛋白激酶C (PKC)的家庭,和MAPK / Ras信号级联在RTK-activation-related癌症发展中发挥了重要作用[36]。我们的研究结果显示,舒尼替能够阻止人类PPGL细胞的增殖抑制p-mTOR PI3K / AKT / mTOR信号通路和p-ERK MAPK信号通路。这些发现表明,抑制多种细胞信号通路导致舒尼替的抗肿瘤效应。斋藤等人证明舒尼替直接抑制mTOR-C1信号通路,进而导致细胞凋亡的PC12细胞(37]。舒尼替Denorme等人表现出双重抑制效应在嗜铬细胞瘤血管生成和肿瘤细胞生存能力异种移植模型(38]。此外,它已被证明,mTOR-C1信号通路的抑制增强sunitinib-induced自噬在大鼠嗜铬细胞瘤(PC12细胞39]。临床病例报告证明舒尼替似乎有效治疗恶性PPGLs [40]。一项研究报道,大约一半的患者17进步转移PPGLs接受舒尼替显示良好的临床结果(41]。与我们现在的结果,这些发现表明,舒尼替承诺是一种有效的直接代理,虽然部分,抑制PI3K / AKT / mTOR和MAPK通路。

在这项研究中,我们还研究了PI3K / AKT的激活/ mTOR PPGLs MAPK信号通路。我们发现一种蛋白激酶、ERK和在大多数PPGLs mTOR被激活。此外,他们的激活似乎更明显SDHB-related PPGLs比VHL-related PPGLs但需要更大样本的研究来进一步证实结果。据报道,SDHB-mutated肿瘤具有高转移潜能[42]。因此,PI3K / AKT的差异和MAPK / ERK信号通路在这项研究中观察到可能与恶性肿瘤相关的性质SDHB-associated PPGLs。在这项研究中,我们观察到激活状态的广泛变异VHL, RET-associated PPGLs,这还有待进一步的研究中解释。

据我们所知,这是第一个研究探索主要人类PPGL细胞的分子途径。然而,这项研究有一些局限性。首先,多达19个可能易感基因与PPGLs的发病机制并不是所有易感基因被发现在我们的系列。其次,我们研究的样本量相对较小。因为基因突变的肿瘤的样本量不够大,基因型之间做个比较,我们不知道到底是否4抑制剂效果更好的基因型。第三,我们不能执行细胞凋亡和入侵/迁移的实验研究中,因为我们没有足够的细胞进行化验。最后,我们目前没有任何有关这些通路的mRNA转录水平数据。

总之,PI3K / AKT / mTOR和MAPK / ERK信号通路在人类PPGL细胞生长中起到至关重要的作用。一种蛋白激酶、ERK和在大多数PPGLs mTOR被激活。的相声PI3K / AKT / mTOR之间和MAPK / ERK信号通路,我们相信抑制多个通路可能是一个治疗PPGLs的新治疗方法。

伦理批准

PUMCH伦理委员会批准的这项研究是对人类研究S-K084的IRB批准文号。

同意

知情同意是获得所有科目。

相互竞争的利益

手稿的作者没有利益冲突声明。

确认

作者感谢曾Zhengpei博士和汉中李提供专家建议。这项研究是由中国国家重点项目的临床科学(没有。wbyz2011 - 873)和归侨的科学研究基金会学者、国家教育部。

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