文摘

单核苷酸多态性在主要组织相容性二类(MHC II)基因已经被与药物引起的肝损伤的风险增加有关。然而,它从来没有解决是否MHC II通路中发挥着重要作用非酒精性脂肪肝病的发展,最常见的肝脏疾病。我们使用小鼠模型,一个完整的可拆卸的MHC II基因的途径(MHCII^Δ/Δ)。首先我们研究了高脂肪食源性肝脏炎症的影响在这些老鼠。其次我们研究carbon-tetra-chloride——(创新领导力的发展₄-)诱导肝硬化。发达肥胖和高脂肪饮食后,两组肝脂肪变性与肝脏炎症程度相似,表明没有影响的可拆卸的MHC II在小鼠脂肪食源性炎症。在第二个研究中,我们证实了三地₄注入显著调节MHC II基因野生型老鼠。CCl的₄治疗显著诱导相关基因在野生型小鼠肝纤维化形成,而这是MHCII低^Δ/Δ老鼠。然而,肝脏组织学显示没有检测到不同组,表明MHC II通路不需要CCl引起的肝纤维化的发展₄。

1。介绍

主要组织相容性二类(MHC II)途径对免疫功能起着重要的作用。分子的表面表达MHC II抗原递呈细胞如巨噬细胞、B细胞、树突状细胞(1]。一旦装上MHC II处理抗原分子表面的细胞,它促进了CD4 +辅助T细胞识别。这导致免疫反应包括炎症细胞因子的生产(2]。尽管通路的重要性已被广泛研究免疫处理,对肝脏炎症和纤维化的特定角色尚未清楚。

全基因组关联研究发现单核苷酸多态性(snp)在MHC II通路lumiracoxib-treated病人了肝损伤(3]。基因的等位基因(HLA-DRB1 5 -DQB1和-DQA1)有一个强大的协会开发患者血浆肝酶升高的患者治疗后肝损伤。的患者,选择性cyclooxygenase-2 (cox - 2)抑制剂,已被用于骨关节炎和急性疼痛治疗4,5]。这cox - 2抑制剂的使用是与心血管事件的风险增加和急性肝毒性6,7]。然而MHC II通路是否参与了这些疾病的机制尚未阐明。

一个类似的观察与治疗有报道,一个抗菌剂(8,9]。再次HLA-DRB1周边地区的单核苷酸多态性和HLA-DQB1显示与药物引起的肝损伤的一个强大的协会。有趣的是,HLA-DQB1位点的等位基因也与原发性胆汁性肝硬化(10),这是最常见的自身免疫性肝病。胆汁性肝硬化的开发过程中,T淋巴细胞发挥重要作用[11,12),T淋巴细胞过度活跃和药物引起的肝损伤之间的联系最近建议(13]。此外,一些研究已经证明,MHC II通路中的基因在porcine-serum-induced显著调节肝纤维化大鼠(14,15]。这些事实意味着一个强大的影响力MHC II通路的开发肝脏疾病易感性。

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种主要的工业化国家的肝脏疾病。数据表明强烈的非酒精性脂肪肝患病率增加在未来几十年(16,17]。该病由不同光谱的肝脏疾病,肝病肝脂肪变性,然后开始,肝脏炎症状态(18]。然后对肝纤维化进展,肝硬化和肝癌。尽管一些分子途径,导致非酒精性脂肪肝肝炎也可以激活药物引起的肝损伤,MHC II通路尚未得到明确的含义理解非酒精性脂肪肝模型。考虑到重复报告MHC II基因等位基因之间的联系和对肝脏炎症3,8- - - - - -10),这个途径可能在非酒精性脂肪肝的发展起着重要的作用。

在目前的研究中,我们解决了MHC II通路是否需要肝炎发展和纤维化的形成。为此,我们选择使用所有常规基因在小鼠模型缺乏MHC II通路(19]。整个MHC II地区(80 kb)被删除,导致基因编码MHC II的去除途径(H2-Aβ,-α,- eβ,- eβ2,- eα)。老鼠基因H2-Aβ和- eβ最接近人类HLA-DQB1基因同源性。这些老鼠是可行的和肥沃的主要解剖或生理异常(19]。我们学习了这些老鼠是否保护与高脂肪的食源性肝炎和chemical-induced肝纤维化。

2。研究设计和方法

2.1。动物、饮食和化学物质

B6; 129 s2 -/ J(003584年应变,MHCII^Δ/Δ)小鼠的80 kb MHC II区域是删除从杰克逊实验室购买(美国我巴尔港)。这些老鼠繁殖C57B6 / J小鼠和F2代杂交获得MHCII^Δ/Δ和野生型老鼠。这些老鼠被安置在通风的笼子里的动物设施洛桑大学的12小时的光明与黑暗周期和免费的食物和水。有没有雄性老鼠受到高脂肪饮食(D12451,研究饮食公司,新布伦瑞克,新泽西州,美国4个月了。高脂肪饮食的膳食成分碳水化合物35%,脂肪45%,蛋白质20%。膳食蛋白质起源于酪蛋白,脂肪主要来自猪油。本研究中使用的所有动物程序批准的瑞士州的兽医服务。

CCl四氯化碳(₄)、氯仿、甲醇、EDTA、小天狼星红,抑肽酶从Sigma-Aldrich购买(德国慕尼黑)。包测量血浆丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和甘油三酯(TG)和光化学买来kouichi(诺伊斯,德国)。苏木精和伊红购买从默克公司(瑞士日内瓦)。

2.2。高脂肪饮食实验

有没有男性MHCII^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠分为上述高脂肪饮食。每个月体重测量。进行葡萄糖耐量试验大约15周的干预。小鼠禁食4小时,每公斤1 g的葡萄糖溶液小鼠腹腔注射。血糖监测(0)15、30、60、120分钟使用一个(拜耳、苏黎世、瑞士)。

最后四个月的实验,小鼠禁食4小时和血糖是一个衡量的。心脏内的血液收集的穿刺和放入管包含EDTA和抑肽酶(分别为2毫米和0.1 - -0.2蒂乌)在冰上。等离子体是由离心分离和储存在−80°C到分析。肝脏和附睾脂肪组织是收获和体重。器官被瞬间冷冻到液氮储存在−80°C,直到分析。

2.3。创新领导力₄治疗

研究肝纤维化的发展,8-week-old野生型和MHCII^Δ/Δ雄性老鼠被1.25处理μL / g CCl体重₄葵花籽油(25%)在4周每周两次。另一组老鼠被葵花油治疗控制车辆在同一时间。20小时最后一次治疗后,小鼠禁食4小时,心脏穿刺麻醉。牺牲后,血液和肝脏都进行进一步分析。新鲜肝片放入4%多聚甲醛溶液在4小时。与PBS几个洗后,肝脏样本脱水和parafinated进行组织学分析。

2.4。组织学

Parafinated肝脏样本(4片μ米),根据标准的技术与苏木精和伊红染色使用常规方法())。研究肝纤维化的形成,使用0.1%天狼星红染色胶原蛋白我,第三,胆汁色素使用其它地方描述的协议(20.]。组织样本的照片与一个AXIO成像仪fluo-Axiocam MRm和色彩的M1 Axiocam MRc相机(卡尔蔡司AG)、从、德国)。图像被Axiovision释放4.8.2治疗。然后我们量化纤维化区域通过评估红点的面积的比值(纤维化)面积,血管腔的面积减去如果存在,使用Photoshop(美国山景奥多比系统)每节5图像的样本(放大10倍)。

由胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学染色剂是由随后的孵化项目的片和兔子anti-GFAP主要抗体(Dako、斯特鲁普、丹麦)在一夜之间正常山羊血清稀释4°C,然后用山羊anti-rabbit加上Alexa萤石568(美国生活技术,卡尔斯巴德)在室温下在黑暗中30分钟。应用部分和4′,然后复染色6-diamidino-2-phenylindole (DAPI),内置mowiol使用蔡司显微镜和分析。

2.5。等离子体参数和肝脏脂质分析

总血浆ALT和AST被罗氏/日立912测量仪器与前面提到的商业工具。胰岛素是由一只老鼠胰岛素酶联免疫试剂盒测量(Mercodia,乌普萨拉,瑞典)。等离子体激活纤溶酶原激活物inhibitor-1 (PAI-1)也是衡量一个酶联免疫试剂盒(分子创新公司,诺)。

从收获肝脏样本,总脂质提取使用修改后的Folch方法(21,22]。的测量肝脏TG含量、总脂质提取受到SPE列(Interchim、Montlucon、法国)分离TG (23,24]。TG然后与chloroform-triton X(1%)混合溶液和干下N₂气体。TG因此溶解到水中,TG含量是衡量和光化学的使用kouichi工具包。

2.6。PCR和实时聚合酶链反应(PCR)

耳朵DNA提取了炙手可热的协议(25]。进行基因分型根据杰克逊实验室的协议(http://jaxmice.jax.org/strain/003584.html)。简单,2套引物被用于变异的基因(oIMR1020: 5′cgg亚美大陆煤层气有限公司TgC TTg ACA TTg三大′,oIMR1021:5′gta TTg ACC手枪太极拳TTg Cg-3′)和野生型基因(oIMR1273;5′aac CTT CAg手枪CTg TgA TCC-3′, oIMR1274;5′-gTg gCT gTT gCC TTA AgA CC-3′)。PCR循环后,样品被加载到2%琼脂糖凝胶和变异的乐队(209个基点)以及野生型乐队(178个基点)监控。

总RNA提取组织根据phenol-chloroform提取协议三试剂(美国辛辛那提分子研究中心,Inc .) (26]。互补脱氧核糖核酸是由2的逆转录μ使用上标2 g的总RNA转录酶从英杰公司(美国生活技术,卡尔斯巴德)根据制造商的协议。实时rt - pcr进行应用生物系统公司7000年序列检测系统(生活技术,卡尔斯巴德)。Twenty-time稀释cDNA样本和0.3μ正向和反向引物(Balgach Microsynth AG),瑞士)在最后10μL体积在以下PCR反应循环条件:10分钟95°C紧随其后40周期在95°C和1分钟15秒60°C。每个样本重复使用DeltaDeltaCt方法分析了(27]。β2微球蛋白(β2米)被用作看家基因规范化每个基因的表达。

2.7。统计数据

所有数据显示在平均值±标准平均误差(SEM)。两组比较,学生t以及。四组比较,单向方差分析(方差分析),一旦达到意义(),事后测试(图基克雷默HSD测试)。统计分析用JMP软件(SAS研究所Inc .,卡里)。

3所示。结果

3.1。小鼠模型的验证

的MHCII^Δ/Δ老鼠最初是由克利斯朵夫博士的实验室Benoist (de Genetique研究所等生物Moleculaire Cellulaire, Illkirch,法国)。这些老鼠缺乏MHC II的主要基因通路和现在非常低的CD4 + T淋巴细胞计数胸腺和脾脏(19]。详细的基因改造及其表型已发表(19]。这些老鼠被backcrossed C57B6 / J应变在杰克逊实验室。购买杰克逊实验室的老鼠后,我们与C57B6 / J小鼠获得控制野生动物。在这个模型中,PCR检测淘汰赛等位基因表现出明显的乐队在209个基点。定量PCR分析表明没有或很低的表达MHC II的基因通路(图1)。

3.2。高脂肪饮食的影响在MHCII炎症状态^Δ/Δ老鼠

野生型和MHCII^Δ/Δ老鼠同样获得了四个月后体重高脂肪饮食(图2)。在两组肝脏重量也是相似的。组间可比性血浆葡萄糖和胰岛素浓度。正如所料,两组有类似的长期高脂肪饮食后葡萄糖耐量。肝脏TG内容组间可比性也(图3)。油红O染色证实这个结果(图4)。血浆ALT和AST水平在两组同样高脂肪饮食后(图3),这表明类似的高脂肪饮食后肝脏功能。

研究肝脏的炎症状态长期高脂肪饮食喂养后,我们已执行)染色和F4/80巨噬细胞染色。我们观察到阳性标记F4/80和类似的脂质滴形态在两组(图4)。基因的表达与炎症如il - 6、TNF -α、PAI-1 F4/80不是不同的群体之间(图3)。的mRNA水平纤维化胶原蛋白1型等标记α1 (Col-1α1)和矩阵metalloproteinase-14 (MMP-14)也类似。我们还测量了积极PAI-1浓度在等离子体(图3)。再次是观察野生型和MHCII之间没有区别^Δ/Δ老鼠。一起,挡住了MHC II途径并不影响肝脏炎症诱导高脂肪食物的老鼠。

3.3。CCl的影响₄注射在MHCII肝纤维化的形成^Δ/Δ老鼠

我们的下一个研究肝纤维化的发展。为此,我们对野生型和MHCII^Δ/ΔCCl老鼠₄在4周。的治疗导致明显降低血糖和ALT和AST显著增加两组(图5)。没有观察到肝脏重量的差异。CCl的₄注射还高度诱导的表达MHC II基因在野生型小鼠,而MHCII^Δ/Δ这些基因的老鼠没有感应,预计(图6)。Col-1等纤维化形成相关的基因α1,Col-3α1,转化生长因子-β(TGF -β)在CCl后两组显著增加₄注射相比oil-injected组。的基因如metalloproteinase-2 MMP-14和组织抑制剂(TIMP-2)也高度CCL诱导后₄在野生型小鼠治疗:然而,在MHCII感应有点迟钝^Δ/Δ老鼠。

肝脏组织学分析使用小天狼星红染色纤维化形成。没有检测到阳性染色油组。CCl的阳性染色₄治疗肝脏是量化使用Photoshop。我们发现一个类似CCl纤维化治疗组之间的水平₄(数据6和7)。)染色还显示炎症在肝脏被创新领导力的迹象₄(图7)。再一次,没有观察野生型和MHCII之间的显著差异^Δ/Δ老鼠。由F4/80染色显示显著浸润的巨噬细胞在CCl小鼠的肝脏₄观察,但再一次,没有区别野生型和MHCII之间^Δ/Δ老鼠(图8)。我们进一步通过GFAP染色星状细胞。有趣的是我们发现只有一个阳性染色13在野生型小鼠,我们发现7 MHCII的9个样本阳性染色^Δ/Δ老鼠(图9)。

4所示。讨论

目前的研究表明,MHC II通路不涉及肝炎的发展引起的长期高脂肪饮食。我们采取了高脂肪饮食的方法来模拟我们的致胖的生活方式,是导致非酒精性脂肪肝(NASH)。也强烈支持喂食实验动物与高脂肪饮食可以等这个饮食诱导纳什(28- - - - - -30.]。在纳什的病理生理学提出,“两面夹攻理论”也可以向纳什解释肝脂肪变性的发展在我们的实验模型。第一个打击是一个渗透脂肪在肝细胞(肝脂肪变性)和第二个特点是免疫细胞如单核细胞和淋巴细胞的浸润,因为异常氧化应激(31日,32]。我们的老鼠在经历了4个月的高脂肪饮食提出大量的脂肪含量在肝脏在两组(第一)。广泛的高脂肪饮食喂养然后导致可比增加两组肝脏炎症/损坏的,根据巨噬细胞浸润(第二)。这些数据表明,长期高脂饮食诱发肝脂肪变性和纳什;然而,挡住了MHC II通路没有影响肝脂肪变性的发展和纳什在这些老鼠。

我们的长期高脂肪饮食也增加了的ALT和AST水平两组相比,ALT和AST的正常范围通常观察到chow-fed老鼠(15 - 80 U / L和40 - 120 U / L,分别在我们的实验室测量)。这个结果强烈表明,修改在MHC II基因表达影响ALT和AST水平,一致组肝脏组织学之间的可比性。然而,它已经表明一些等位基因在MHC II通路与非酒精性脂肪肝的严重程度和ALT、AST水平,但不是在土耳其人口33]。在这项研究中,研究人员无法评估存在纳什的人口。据我们所知,这研究是唯一的报告表明HLA等位基因之间的关联并在一般人群非酒精性脂肪肝。许多其他的研究表明,HLA等位基因之间的联系和血浆ALT纳什丙型肝炎患者的严重程度或在患者药物引起的肝损伤3,6,8,9,34,35]。因此,MHC II途径可能有一个更大的重要性纳什由病毒感染引起的发展或药物比食源性非酒精性脂肪肝。

其次,我们专注于化学诱导纤维化小鼠缺乏所有传统MHC II基因。如前所述,一些HLA等位基因与易感性增加有关开发药物引起的肝损伤。CCl的₄治疗明显增加血浆ALT, AST,基因型和肝纤维化的程度。MHC II的基因通路也CCl高度引起的₄治疗在野生型小鼠,指示的upregulation通路的治疗。尽管缺乏的upregulation通路,MHCII^Δ/Δ老鼠同样出现了肝纤维化。这些数据有力地表明,MHC II途径不需要肝纤维化的发展,至少在三地的小鼠模型₄全身的肝纤维化。

虽然主要的基因与肝纤维化的形成,即Col-1α1,Col-3α1,TGF -β在组老鼠同样调节CCl治疗吗₄一些基因的诱导,如TIMP-2和MMP-14 MHCII往往更低^Δ/Δ小鼠与野生型小鼠相比。TIMP-2表达式已经观察到在纤维发生的早期阶段猪血清诱导的(36]。我们认为MHC II基因的删除可能会影响肝纤维化的发展在一个更早的时间点。在我们的研究中,我们测试了不同时期的CCl注入₄(2 - 4 - 6和8周治疗)在这些老鼠。在任何条件测试,我们没有观察到显著差异基因表达相关纤维化形成(数据没有显示)。我们也由肝组织学证实这些结果。这再次支持MHC II途径不是CCl干扰引起的肝纤维化的发展₄。

虽然组织学数据显示没有差别在CCl纤维化治疗组之间的严重程度₄,我们发现了一个深刻的增加肝星状细胞(HSC)染色MHCII集团^Δ/Δ老鼠被同₄。HSC nonparenchymal细胞在肝脏和已知发挥重要作用在纤维化和组织修复(37]。静HSC激活,它们转化成myofibroblasts,负责生产的细胞外基质(38]。的重要性HSC激活纤维发生Puche最近报告了et al。39]。他们已经创建了一个优雅的转基因小鼠模型的增殖HSC选择性地杀死。通过使用模型,Puche等人证明了这些老鼠CCl纤维化面积在减少₄治疗基因控制的同行相比。这意味着HSC的重要作用肝纤维化的发展。

在我们的研究中,尽管hyperactivation MHCII HSC^Δ/Δ老鼠,组间可比性严格纤维化形成。我们不知道确切的因果关系在MHCII HSC的感应^Δ/Δ老鼠被同₄。我们已经观察到的基因的表达MHC II通路在HSC分数非常高,当我们分开不同的细胞类型在肝脏(肝细胞、肝星状细胞、枯否细胞和内皮细胞)(未公开的数据)。这表明HSC可能MHC II反应起着重要的作用。然而,我们不知道是否缺乏MHCII的途径^Δ/Δ老鼠可能CCl的HSC增殖的影响₄刺激。另一方面,HSC的活化在纤维化的发展建议是瞬态(40]。我们不确定在MHCII当HSC开始被激活^Δ/Δ老鼠在同₄治疗。这是否hyperactivation HSC的补偿缺乏MHC II通路,导致纤维化的形成需要进一步解决。

目前的研究清楚地表明,MHC II途径的缺乏影响高脂肪饮食引起的纳什和CCl纤维化引起的₄在老鼠身上。尽管大量的出版物暗示MHC II的等位基因之间的联系途径和药物引起的肝损伤和丙型肝炎在人类中,这项研究清楚地表明,MHC II途径不需要纳什和纤维化的发展至少在老鼠。

利益冲突

g . Willemin c·罗杰,a Bauduret, k . Minehira没有利益冲突。

作者的贡献

k . Minehira导致的概念和设计实验。所有在活的有机体内实验和组织抽样进行了动物设施的Bugnon 7/9,洛桑大学g . Willemin和k . Minehira。组织学分析是由c。罗杰。剩下的实验,包括任何分子和生化分析,是由g . Willemin的生理学、洛桑大学。a . Bauduret导致了基因分型策略。Willemin和k Minehira参与数据分析和解释。k . Minehira写论文的初稿,和所有作者导致其修订和批准了最终版本。

确认

作者感谢蒂埃里Bouduban先生和弗朗索瓦•兽疥癣的技术支持和尼古拉斯Broskey先生的建议。作者感谢教授伯纳德·索伦集团捐赠的肝细胞分数。作者还要感谢Bugnon 7/9的动物设施,洛桑大学,玛丽安太太Carrard(鼠标代谢功能,洛桑大学)日立的测量。本研究由瑞士国家科学Foundation-Ambizione支持。