文摘

Cyclooxygenase-2 (cox - 2)表达与生理和病理条件下的许多方面,包括胰腺β细胞功能障碍。前列腺素E2 (PGE2)生产,因此cox - 2基因的诱导,据报道损害β细胞的功能。的分子机制参与cox - 2基因表达的规定并不完全理解。我们先前表明,转录因子Elk-1显著调节cox - 2基因启动子活动。在这份报告中,我们使用胰腺β细胞线(INS-1)探索Elk-1和cox - 2之间的关系。我们第一次调查的影响Elk-1 INS-1细胞cox - 2转录调控和表达。我们从而进行研究结合Elk-1 cox - 2启动子的假定的结合位点。我们也分析了分子生物学胰岛素分泌(GSIS) INS-1细胞过表达Elk-1。我们的研究结果表明,Elk-1有效移植cox - 2表达至少部分是通过直接绑定69−82 /−cox - 2启动子区域。超表达INS-1 Elk-1抑制GSIS的细胞。这些发现将有助于更好地理解cox - 2在胰腺癌的转录调控β细胞。此外,Elk-1, cox - 2表达的转录监管机构,将预防的潜在目标β细胞功能障碍由PGE2。

1。介绍

Cyclooxygenase-2 (cox - 2)是一个关键酶,催化前列腺素的生产(后卫)和其他炎症物质从花生四烯酸。cox - 2催化产品动力参与许多生理和病理过程,如炎症、疼痛、血管生成、血压调节和免疫反应(1]。cox - 2,作为诱导环氧酶,通常是发现不了的在大多数组织和器官,但可以迅速引起细胞因子,生长因子,木糖醇,致癌因素刺激,和其他刺激(2- - - - - -5]。的异常表达cox - 2与生理和病理条件下的许多方面,如细胞恶性转化、炎症、细胞生长和凋亡,肿瘤血管生成,侵袭性和转移(6- - - - - -10]。前列腺素E2 (PGE2)生产一直报损害β从研究胰腺癌细胞功能β肽和孤立的小岛11- - - - - -13]。此外,抑制cox - 2活性保护β细胞炎症因子刺激和增加基础胰岛素分泌功能(12,13]。

的重要作用,cox - 2在糖尿病的发生和发展,有必要深入研究进展的分子机制参与cox - 2基因表达的调节。目前,对cox - 2基因调控的研究主要集中在转录水平的调控。cox - 2启动子区域包含一个规范的塔塔元素和大量的cis激活共识序列,包括营(CRE)响应元素,E-box NF-IL6 (CCAAT / enhancer-binding蛋白质-β),AP-2、sp 1 NF -κB,统计网站(14- - - - - -21]。特定的转录因子参与cox - 2激活依赖于细胞类型和刺激。例如,AP2、NF-IL-6 CRE il - 1的元素是必不可少的β全身的cox - 2基因在人类微血管内皮细胞的激活,HMEC-1 [15]。此外,NF -κB转录因子介导的诱导cox - 2在风湿性synoviocytes interleukin-1 [16]。我们先前表明,转录因子Elk-1显著调节cox - 2基因启动子活动和识别几个假定的结合位点Elk-1 [22]。

Elk-1属于Ets家族的转录因子。Ets基因家族保存一个85 -氨基酸dna结合蛋白Ets域结合共识序列5′gga (A / T) 3′在目标基因的启动子区域23)和各种生物功能,包括控制细胞增殖、分化、造血作用,细胞凋亡,组织重建、血管生成和转换24- - - - - -28]。先前的研究表明,大多数的Ets家族成员包括Elk-1 MAPKs是重要的基质,PI3激酶,和Ca2 +特定的信号通路,可以激活生长因子或细胞应激(29日]。其他研究证实,诱导cox - 2的表达与MAPKs信号通路的激活(30.,31日]。因此,转录因子Elk-1可能是一个重要的外界刺激之间的桥梁和cox - 2基因表达的诱导。

本研究的目的是调查Elk-1和cox - 2之间的关系。检查我们的假设的相关性,我们第一次调查的影响Elk-1在cox - 2在胰腺癌转录调控和表达βINS-1细胞线。我们从而进行研究结合Elk-1 cox - 2启动子的假定的结合位点。我们也分析了分子生物学胰岛素分泌(GSIS) INS-1细胞过表达Elk-1。

2。材料和方法

2.1。细胞系,细胞培养

INS-1细胞生长在RPMI 1640中包含11.1 mM葡萄糖补充10%胎牛血清,消息灵通的10毫米,2毫米谷酰胺、丙酮酸钠1毫米,50μ米β巯基乙醇、青霉素100单位/毫升和100μ在湿润的气氛中g / mL链霉素(5%股份有限公司₂95%的空气),37°C。

2.2。质粒构建

Elk-1表达质粒(pCMV3.0b-Elk-1)和荧光素酶记者构造包含老鼠cox - 2启动子(−2026 / + 44)建造在我们之前的研究22]。两个突变体构造含核苷酸的序列−2026 / + 44 82−−69被删除或突变CGAGGCGGAAAGAC CGAGGCAAGAAGAC是由使用QuikChange II定点诱变工具包(Stratagene)根据制造商的指示。构造是叫pCOX-2(82−2026 / + 44岁的德尔−−/ 69)和pCOX-2(−2026 / + 44 69 82 /−−),分别。所有结构被DNA测序验证。

2.3。细胞瞬时转染和荧光素酶检测

转染进行使用Lipofectamine 2000(英杰公司)根据制造商的协议。荧光素酶分析,INS-1细胞被镀成12-well细胞培养板转染前1天。每个转染是使用0.8执行μ0.8 g荧光素酶记者构造μg Elk-1表达质粒或pCMV3.0b空向量控制,和4 ng Renilla荧光素酶记者向量,pRL-SV40,作为内部控制(Promega)。转染48 h后,细胞被洗PBS和细胞溶解使用1×被动裂解缓冲。萤火虫和Renilla荧光素酶活动测量GloMax-20/20光度计(Promega)使用Dual-Luciferase记者分析系统(Promega)。萤火虫荧光素酶活动规范化Renilla荧光素酶活性。每个实验进行了一式三份、独立重复三次。

探索Elk-1对内生cox - 2表达和分子生物学INS-1的胰岛素分泌细胞,细胞被瞬变与Elk-1表达质粒转染pCMV3.0b——Elk-1或空向量pCMV3.0b控制。转染48 h后,细胞收获了实时定量rt - pcr和免疫印迹分析,或进行分子生物学胰岛素分泌(GSIS)分析如下。

2.4。实时定量rt - pcr

INS-1细胞总rna由试剂盒试剂(英杰公司)根据制造商的协议。分光光度法量化后,1μ克总RNA用于逆转录(RT) 20μL最后卷iScript互补脱氧核糖核酸合成装备(Bio-Rad)根据制造商的指示。使用TaqMan定量实时PCR进行基因表达分析(应用生物系统公司)StepOnePlus实时PCR系统(应用生物系统公司)。一个卷的反应进行了10μL包含1μL稀释cDNA、20×TaqMan基因表达测定混合,和2×TaqMan普遍PCR掌握混合。热循环条件下由一个初始变性步骤在95°C 10分钟,40周期为15秒95°C, 1分钟和60°C。TaqMan基因表达测定混合用于Elk-1和cox - 2的产品编号Rn01756649_g1 Rn01483828_m1。老鼠β肌动蛋白(产品编号Rn00667869_m1)被用来校准原始mRNA的浓度。每个量化PCR进行了一式三份、独立重复三次。信使rna浓度被定义为目标的比例相对于GAPDH信使rna信使rna复制副本。

2.5。免疫印迹分析

INS-1细胞细胞溶解在冰冷的裂解缓冲包含以下试剂:50 mM Tris-HCl pH值7.4;NP-40 1%;150毫米氯化钠;EDTA约1毫米;PMSF约1毫米;完整的蛋白酶抑制剂混合物(1片/ 10毫升,罗氏)。蛋白质浓度在细胞溶解产物使用直流蛋白量化分析工具(Bio-Rad)。蛋白质能整除被12% sds - page电泳,转移到PVDF膜(微孔)。非特异性蛋白质相互作用在5%的脱脂奶粉被孵化TBST缓冲区(20毫米Tris-HCl、150毫米氯化钠和0.1%渐变20 (pH值7.6))在室温下1 h,然后用TBST洗。膜在4°C在一夜之间被孵化anti-Elk-1 (Santa Cruz), anti-COX-2 (Santa Cruz),或反β肌动蛋白(Santa Cruz)抗体在新鲜阻断缓冲区。屁股都洗,然后用HRP-conjugated孵化二级抗体(Amersham)在室温下1 h。乐队是可视化与西方化学发光合止动剂基质(微孔)使用x射线胶片(柯达)。Prestained标记(热)被用作内部分子量标准。乐队的密度在免疫印迹分析数量一个软件(Bio-Rad)。

2.6。击倒的Elk-1 RNA干扰(RNAi)

Elk-1特定小核RNA)和消极的siRNA被GenePharma合成。序列如下:Elk-1 siRNA-1 5′-GGCCAGAAGUUUGUCUACAtt-3′;siRNA-2 5′-AGGCCAAGGUGGCUUAGCAtt-3′;siRNA-3 5′-GCCAUCCUAACAGAGAAUAtt-3′;-核,5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3′。暂时INS-1细胞转染用NeoFx siRNA试剂(Ambion)根据制造商的协议。转染后48小时,细胞收获实时rt - pcr和免疫印迹分析如上所述。

2.7。核内蛋白提取和电泳迁移率改变分析(EMSA)

核中提取分离得到INS-1细胞NE-PER核和胞质提取试剂(皮尔斯)根据制造商的指示。蛋白质浓度测定与直流试验设备(Bio-Rad)。EMSA执行使用挖掘凝胶转变工具包(罗氏)根据生产的协议。的探针序列EMSA如下:野生型探针1,5′-AAAGCCGAGGCGGAAAGACACAGT-3′,对应于核苷酸87−−64鼠cox - 2启动子;野生型探针2、5′-TTCGGTAGTTTCCGAAGGGCTGTT-3′,对应于核苷酸1300−−1277 cox - 2启动子;野生型探针3、5′-ACCACCCATTTCCGACCCCCCACC-3′,对应于核苷酸1824−−1801 cox - 2启动子;突变体探针1、5′-AAAGCCGAGGCAAGAAGACACAGT-3′。双链探针合成,野生型探针的3′端与digoxigenin-11-ddUTP贴上标签。核提取物(5μ与1 g蛋白)孵化μg聚(d(我)),绑定缓冲连接到设备,DIG-labelled野生型探针在室温下15分钟。结合DNA复合物分离nondenaturing 5%聚丙烯酰胺凝胶电泳和转移到尼龙膜(罗氏)。尼龙膜交联,使用CSPD执行和化学发光检测,信号被记录在x射线胶片。

在supershift分析,Elk-1抗体(3μg;Santa Cruz)添加到核提取物凝胶转变缓冲区(上图)在4°C 1 h,其次是探测器,和上面的后续协议是一样的。

2.8。GSIS化验

在转染前的一天,INS-1细胞()被播种到500年μL RPMI 1640中使用标准葡萄糖浓度在24-well细胞培养板(11.1毫米)。Elk-1表达质粒的细胞转染pCMV3.0b——Elk-1或空向量pCMV3.0b控制48 h如上所述。孵化后的1 h glucose-free Krebs-Ringer碳酸氢盐(KRB)缓冲区(4.7毫米115毫米氯化钠,氯化钾,1.2毫米MgSO₄h·7₂啊,1.2毫米KH₂阿宝₄,20毫米NaHCO₃,消息灵通的16毫米,2.56毫米CaCl₂,0.2% BSA),细胞治疗1 h KRB缓冲较低(3.3毫米)和高(16.7毫米)葡萄糖。胰岛素均获得上层清液浓度测定用一只老鼠/鼠标胰岛素酶联免疫试剂盒(Linco研究)。每个实验进行了一式三份、独立重复三次。

2.9。统计分析

数据意味着±SEM。两个样本的均值差异被学生的分析以及与差异被认为是重要的。用SPSS 17.0软件进行统计分析。

3所示。结果

3.1。Elk-1调节cox - 2基因表达

在前面的研究中,我们表明,转录因子Elk-1显著调节cox - 2基因启动子活性(22]。探索对内源性Elk-1 cox - 2基因表达的影响,暂时INS-1细胞转染与Elk-1超表达向量或控制向量。过度的Elk-1 cox - 2 mRNA和蛋白表达明显增加(图1)。

3.2。Elk-1 RNAi下调cox - 2基因表达

INS-1细胞转染与Elk-1 siRNAs(包括3 siRNAs)或控制核。我们测量Elk-1蛋白质含量选择siRNAs可以有效地沉默Elk-1表达式。如图2(一)Elk-1 Elk-1 siRNA-1沉默基因表达;因此,我们使用Elk-1 siRNA-1在后续实验。我们沉默Elk-1 INS-1细胞中表达,然后测量cox - 2 mRNA和蛋白表达。cox - 2 mRNA和蛋白表达水平明显下降Elk-1 RNAi(数字2(b),2(c)2(d))。

3.3。cox - 2启动子识别Elk-1结合位点

基于序列分析,老鼠cox - 2启动子区域包含三个预测共识Elk-1结合位点,这对应于启动子区域69年82 /−−−1295 / 1282−1806−1819 /−分别。确认Elk-1能否结合这三个网站,我们合成和标记的寡核苷酸生成三个区域和额外的五核苷酸两侧(即。64年87 /−−−1300 / 1277−1801−1824 /−),利用其作为探针EMSA实验。如图3(一个)(巷2)slower-migrating复杂INS-1核提取物孵化时出现digoxigenin-11-ddUTP-labelled野生型探针1 (64−87 /−cox - 2启动子),但不是探针2和探针3(1300 / 1277年和1824−−−−1801),表明69−82 /−地区Elk-1的结合位点。slower-migrating复杂显著抑制摩尔过剩的无标号的野生型探针1(图3 (b),车道3和4)。相比之下,未标记的突变体探针1减少了抑制作用(图3 (b)道5和6)。以确定Elk-1负责转变EMSA,添加到EMSA-binding Elk-1抗体反应,复杂的可以通过添加supershifted Elk-1抗体(图3 (b),巷7)。

3.4。通过Elk-1结合位点Elk-1调节cox - 2启动子活动

通过瞬态cotransfections,我们表明,过度的Elk-1导致相对荧光素酶活性显著增加,cox - 2启动子(图4)。的贡献Elk-1结合位点被定点诱变INS-1细胞研究。当82 /−−−69 Elk-1结合位点2026 / + 44地区被删除或突变,Elk-1的增强效果深受减少(图4)。这表明69−82 /−Elk-1绑定网站涉及Elk-1 cox - 2启动子的增强。

3.5。Elk-1抑制分子生物学在INS-1胰岛素分泌细胞

确定Elk-1 GSIS函数在胰腺的效果β肽,我们进行了实验与Elk-1 overexpressing INS-1细胞。如图5、控制细胞分泌ng insuli·nh⁻¹·毫克蛋白⁻¹证明了胰岛素分泌增加了6.9倍和16.7毫米葡萄糖,而Elk-1 overexpressing细胞分泌ng胰岛素·h⁻¹·毫克蛋白⁻¹并演示了在胰岛素分泌增加(3.6倍与控制)。因此,Elk-1 overexpressing集团表现出减少GSIS控制价值的52%。

4所示。讨论

cox - 2是立即早期基因。根据细胞类型,它可以通过各种各样的刺激被激活。Upregulation cox - 2表达的参与各种生理和病理条件下,包括胰腺β细胞功能障碍。先前的研究表明,cox - 2激活可能在糖尿病致病的作用[32- - - - - -34],cox - 2抑制可以防止大鼠胰岛细胞因子诱导的分子抑制胰岛素分泌(13),暗示在cytokine-mediated cox - 2的重要作用β细胞功能障碍和糖尿病的发展。因此,理解的分子机制参与cox - 2基因表达的调节β肽将有助于更好地理解和抑制胰腺的功能障碍β细胞。

cox - 2的表达是受特定转录因子的结合对cox - 2启动子cis-acting元素(35]。一些研究表明,一些刺激可能上调cox - 2表达,在这些研究中,表达式和Elk-1活动也增加(36- - - - - -38),表明Elk-1的潜在作用,cox - 2的监管。在我们之前的研究中,我们表明,Elk-1显著调节cox - 2启动子活动(22]。但是Elk-1参与cox - 2表达的规定还没有研究到目前为止。

在这项研究中,我们调查了Elk-1对cox - 2基因表达的影响和GSIS函数INS-1鼠胰岛瘤细胞和探索是否Elk-1调节cox - 2表达cox - 2启动子中潜在的结合位点。超表达研究表明,Elk-1超表达显著增加cox - 2 mRNA和蛋白表达。相反,Elk-1 RNAi显著降低cox - 2的表达。EMSA和定点诱变实验表明Elk-1对cox - 2转录的影响涉及到一个Elk-1 cis-element核苷酸之间的cox - 2启动子位于82和69−−,但不是另外两个预测共识cis-elements(1295−1806年/ 1282年和1819−−−)。这些结果表明Elk-1可能上调cox - 2基因表达至少部分是通过Elk-1直接绑定69−82 /−cox - 2启动子区域。这是第一个报告,特征Elk-1 cis-element cox - 2启动子。

进一步调查Elk-1在胰腺癌的作用β肽功能障碍,我们评估GSIS INS-1细胞过表达Elk-1函数。正如所料,Elk-1 overexpressing集团表现出减少GSIS控制价值的52%。这一结果表明,Elk-1可以抑制GSIS INS-1细胞。因为cox - 2中发挥着重要作用β细胞功能障碍和Elk-1可以上调cox - 2基因表达,我们推测Elk-1抑制GSIS INS-1细胞至少部分是通过上调cox - 2基因表达。Elk-1其他未知的机制的抑制作用GSIS等进一步的实验仍有待决定染色质免疫沉淀反应(芯片)测序转录组测序和基因阵列。

5。结论

总之,我们的研究表明,转录因子Elk-1有效地移植在INS-1细胞cox - 2的表达,这可能是一个新的解释机制β细胞胰岛素分泌障碍,一些刺激。超表达Elk-1可能抑制胰岛素分泌β肽引起upregulation cox - 2。这些发现将有助于更好地理解cox - 2在胰腺癌的转录调控β细胞。此外,Elk-1, cox - 2表达的转录监管机构,将预防的潜在目标β细胞功能障碍由PGE2。

作者的贡献

x。张和y朱贡献同样这项工作。

确认

这部分工作是支持从浙江省自然科学基金资助(Y2110310),温州城市的科技项目(Y20100243),中国国家自然科学基金(81001079,81001079),和优先级的学术程序开发江苏高等教育机构(PAPD JX10231801)。