文摘

最近的证据支持的存在局部肾素-血管紧张素系统(RAS)在胰腺中,涉及许多生理和病理生理过程。我们利用小核RNA)调查的影响血管紧张素ⅱ1型受体(AT1R)击倒在分子生物学胰岛素分泌(GSIS)孤立小岛的db / db老鼠和探索潜在的机制。我们发现Ad-siAT1R治疗导致明显降低在AT1R mRNA水平和AT1R蛋白质表达水平。AT1R基因数,显著增加胰岛素分泌,降低胰高血糖素分泌水平被perifusion发现。IRS-1的同时,显著提高蛋白质含量(85%),IRS-2 (95%), PI3K(85)(112.5%),和p-Akt2通过免疫印迹(164%)被发现。和upregulation GLUT-2(190%)和GCK(121%)被Ad-siAT1R AT1R后抑制。Intraislet AT1R表达水平是一个重要的生理调节胰岛素的敏感性β细胞本身,从而影响glucose-induced胰岛素和胰高血糖素释放。因此,AT1R抑制剂的特点可以使它成为一个潜在的新疗法对2型糖尿病的预防和治疗。

1。介绍

近几十年来看到的发病率和患病率显著增加2型糖尿病(T2DM)病人体内。损伤的胰岛功能中扮演着关键角色在二型糖尿病的发病和进展。然而,目前的治疗2型糖尿病胰岛失败不能提供有效的保护。有趣的是,最近的临床研究表明,RAS封锁了血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)或血管紧张素受体阻滞剂(ARB)可以降低糖尿病的发病高危人群的14% - -34% (1- - - - - -4]。似乎这种保护作用机制复杂,可能涉及改善胰岛素敏感性和胰岛素分泌。然而,详细的机制仍然未知。

RAS组件,如血管紧张肽原(AGT),血管紧张素转换酶(ACE),血管紧张素ⅱ(AngII)和1型和2型血管紧张素ⅱ受体(AT1R和AT2R),被发现在小岛5,6]。证据表明,当地的胰岛RAS执行多因子的活动在胰岛的结构和功能,包括细胞增殖、凋亡、氧化应激、炎症反应、分子生物学胰岛素分泌,可能这些监管职能是通过AT1R [7]。这样一个地方胰岛RAS受到糖尿病,从而促使胰岛overactivation纤维化,减少胰岛血流,氧张力和胰岛素的生物合成。奋斗》等人表明,内生Angⅱ水平产生不利影响胰岛移植小鼠的血液灌注小岛(8]。此外,overactivation胰岛的RAS可能加速活性氧的合成,加剧氧化应激β细胞功能紊乱,细胞凋亡,从而导致2型糖尿病胰岛失败出现在[9]。我们先前的研究发现,坎地沙坦治疗可以改善葡萄糖耐量的保护β细胞质量和形态在db / db老鼠10,11]。然而,目前尚不清楚这些好处是否依赖于循环RAS组件的变化。所以选择性抑制AT1R表达胰岛可以揭示intraislet RAS的确切作用葡萄糖体内平衡。

胰岛素受体和底物(IRS-1和IRS-2)已被证明是表示的β细胞(12- - - - - -14]。胰岛素信号通路,这些分子GSIS的可能影响β细胞(15,16]。积累的数据表明,局部RAS周组织中表达应对在胰岛素抵抗,和RAS封锁对胰岛素抵抗的影响已经证明(17,18]。作为胰岛素信号分子表达的有证据表明在小岛本身,因为RAS与胰岛素抵抗的发病机制,可能是局部RAS小岛表达可能影响GSIS通过胰岛素信号通路β细胞。

在目前的研究中,我们的目标是探讨是否参与分子生物学内在RAS胰岛胰岛素分泌胰岛素敏感性的影响β通过RNA干扰技术可以抑制细胞本身的表达intraislet AT1R有效和明确。

2。材料和方法

2.1。胰岛细胞分离和文化

五八周大女db / db老鼠和五个年龄和性别匹配的非糖尿病患者同窝出生的db / m老鼠从动物实验获得的叮当声中心医院。老鼠与戊巴比妥麻醉(戊巴比妥钠,方丈实验室)。夹紧后的胆总管十二指肠出口附近,胰腺是通过胰管注射2毫升Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲(KRBB: 129 L更易与氯化钠5更易与L NaHCO3, 4.8 L更易与氯化钾,更易与1.2 L KH2PO4,更易与1.2 L MgSO4, 0.2% BSA, 10更易与L消息灵通的,2.5 L更易与氯化钙,在pH值7.4和2.8 L更易与葡萄糖)含1.5毫克/毫升的胶原酶(沃辛顿、生化有限公司,圣路易斯,密苏里州)。肿胀的胰腺切除和孵化37°C 40分钟。胰腺消化动摇,用冰冷的哈佛商学院四次,洗净和小岛被精心挑选的RPMI 1640培养基培养立体显微镜下在37°C调湿大气(空气二氧化碳5%,95%)。一批孵化和perifusion研究,30分钟的小岛是pre-incubated KRBB (1.4 L更易与葡萄糖)在37°C, 5%的二氧化碳,和饱和湿度。

2.2。隔离的总RNA和AT1R的实时逆转录聚合酶链反应

总RNA提取试剂盒小岛的试剂根据制造商的协议(表达载体)。定量实时PCR,第一个链cDNA总RNA的合成从300 ng使用益生元(dT)底漆和MMLV逆转录酶(表达载体)。样本进行定量放大使用老鼠AT1R的TaqMan探针和引物组。PCR扩增进行总量的10μL包含30 ng的cDNA,每个引物的900海里,250海里的各自的调查,和6μL库尔德人普遍PCR掌握混合。实时pcr (95°C 15年代,55°C 20年代,20年代和72°C×35周期)进行的ABI-Prism 7700序列检测器系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)。不同的互补脱氧核糖核酸样本归一化使用底漆集看家基因β肌动蛋白。引物如下:AT1R 5′-AGCTACAACAAGGCAAGG-3′, 3′-TAGAAGGCACAGTCGAGG-5′;β肌动蛋白,5′-TGTTGTCCCTGTATGCCTCTGGTC-3′, 3′-ATGTCACGCACGATTTCCCTCTCA-5′。褶皱的变化计算通过使用比较阈值周期的方法。

2.3。细胞培养

INS-1细胞生长在单层文化RPMI 1640完全培养基为11.1 L更易与葡萄糖补充10% (w / v)胎牛血清,10更易与L玫瑰,2更易/ L谷酰胺,1 L更易与丙酮酸钠,50μ摩尔/升β巯基乙醇在37°C调湿大气(空气二氧化碳5%,95%)。细胞转染实验,在75年被播种,厘米²在4×10烧瓶⁶细胞转染前2天,当时60 - 70% confluency转染。

2.4。短发卡rna介导基因抑制

shrna针对老鼠AR1R(加入基因库NM_030985)被设计根据Ambion(奥斯汀,得克萨斯州)核设计指导方针。短暂,从5′,3′端,整个长度的shRNA顺序由BamHI限制网站的19-nucleotide反义基因打靶序列,到达目标时间到达目标时间终止转录序列,和HindIII限制站点。三种不同成分的候选人(siAT1R1 siAT1R2, siAT1R3)设计和测试他们的能力来减少目标基因的表达。没有已知的双目标(GAG ACC CTA太极拳GTG ATT)被用来控制(siControl)。所有的寡核苷酸合成和纯化。退火后,双链寡核苷酸的结扎了self-formed限制性位点BamHI和HindIII pSilencer 2.0矢量(Ambion)。siRNAs被转染到INS-1细胞使用Lipofectamine +浓度的5μg为6×10的DNA⁶细胞。细胞转染三天后,INS-1收获了RNA和蛋白质。证实了AT1R表达中存在和免疫印迹分析如上所述。最有效的一个(siAT1R2)被选为后续实验。相对于起始密码子,目标的5′端对应于老鼠AT1R核苷酸540 (GCGTCTTTCTTCTCAATCT)。

2.5。重组腺病毒结构

重组腺病毒包含siATR12 (Ad-siATR1)或siControl (Ad-siControl)上述序列构造使用AdEasy系统。简而言之,对于每个pSilencer-based克隆,核表达盒和结扎切除为线性化向量pAdTrack adenoviral航天飞机。随后,1μg重组PmeI-linearized pAd-siATR1转染进大肠杆菌BJ5183细胞adenoviral骨干质粒,pAdEasy-1。重组选择和成功的重组是由限制酶分析。线性化重组adenoviral构造是转染293细胞和high-titer病毒性股准备。病毒滴度测定空斑实验和表达为点状单位/毫升(空斑形成单位/毫升)。病毒滴度Ad-siATR1和Ad-siControl 3.6×10⁹空斑形成单位/毫升和2.9×10⁹分别空斑形成单位/毫升。

2.6。在胰岛基因沉默

小岛的db / db老鼠和db / 50米小鼠整除小岛每six-well板的2毫升中被分为三组:(1)Ad-siAT1R组胰岛治疗与Ad-siAT1R 20 h 2000点状单位/胰岛;(2)Ad-siControl集团小岛Ad-siControl处理;(3)对照组,模拟转导小岛。模拟小岛没有暴露于病毒感染在潜伏期和没有孵化与任何向量。删除中“(分泌物)后,小岛被培养为一个额外的72 h与介质的变化每24 h。GSIS测量。随后,小岛被收集和分析的细胞溶解AT1R表达如上所述。

2.7。胰岛Perifusion

体外胰岛素释放动力学研究了perifusion系统。Size-matched 50小岛被放置在每一列。然后列轻轻关上了适配器,沉浸在垂直位置和控制温度的水浴37°C。perifusion介质维持在37°C水浴。并行和所有列都灌注在0.5毫升/分钟的流量KRB (2.8 L更易与葡萄糖)在37°C。60分钟后静态孵化与KRB (2.8 L更易与葡萄糖),小岛被刺激在连续存在高浓度的葡萄糖16.7更易/ L。样本收集每20秒到2分钟,每1分钟到5分钟,之后每隔5分钟至30分钟。样本立即储备−80°C,直到进一步分析。

2.8。免疫印迹分析AT1R的IRS-1、IRS-2 PI3-K p85, p-Akt2 GLUT-2, GCK小岛

孤立的小岛被溶解在裂解缓冲(25更易与L玫瑰,50 L更易与氯化钾,6%的甘油,5更易/ L EDTA, 5更易与L EGTA Triton-X100 0.5%, 50μmol / L氟化钠,40 L更易与甘油磷酸盐,25更易与蛋白酶抑制剂L焦磷酸钠)。血清总蛋白测定(BCA蛋白质化验,皮尔斯,罗克福德,IL),和50μg蛋白被sds - page和分馏electrophoretically转移到硝化纤维素膜(表达载体)。膜被孵化阻断缓冲区(渐变20 1 tbs, 0.1%,和5%脱脂奶粉)在室温下1 h。以下主要使用抗体:兔子anti-AT1R抗体,anti-insulin受体基质1抗体,anti-insulin受体底物2抗体,anti-PI3-kinase p85αanti-phospho-Akt2 anti-glucokinase抗体,anti-glucose转运蛋白- 2 (GLUT-2)抗体,而反β肌动蛋白抗体(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)。三洗后在TBS渐变20 / 0.1%,是杂化膜的辣根peroxidase-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白G在山羊(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)在室温下1 h。后三个洗TBS渐变20 / 0.1%,乐队被可视化增强化学发光(超级信号西方毫微微;皮尔斯,罗克福德,IL)。屁股的强度量化通过扫描微肌动蛋白和归一化值。

2.9。统计分析

数据表示为±SD方法。习与SPSS进行统计分析。数据分组根据一个独立处理和分析样本以及或单向方差分析。的值被认为是对所有比较具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。AT1R表达胰岛的db / db和db / m老鼠

AT1R的表达水平,在信使rna和蛋白质,在孤立的小岛db / db老鼠几乎两倍的db / m老鼠(),这表明AT1R在糖尿病胰岛细胞(图中1)。

3.2。减少Ad-shRNA-AT1R AT1R的治疗

的小岛对待Ad-siAT1R展出AT1R mRNA相比减少了75%的治疗Ad-siControl ()。此外,免疫印迹分析证明了降低65% AT1R总提取物的免疫反应性()(图2)。总之,这些数据验证,RNA干扰(RNAi)策略是有效抑制的表达intraislet AT1R。

3.3。改善胰岛素敏感性β肽Ad-siAT1R治疗胰岛的db / db老鼠

免疫印迹显示胰岛治疗Ad-siAT1R体现重要IRS-1蛋白质含量的增加(85%),IRS-2 (95%), PI3-K(85)(112.5%),和p-Akt2(164%)相比,那些接受Ad-siControl ()(数据3和4),这表明,抑制AT1R的RNAi改善胰岛素的敏感性β肽。

3.4。改善GSIS Ad-siAT1R治疗胰岛的db / db老鼠

刺激胰岛素分泌的低(2.8毫米)或更高版本(16.7毫米)葡萄糖浓度测定在未受感染的细胞和细胞感染Ad-siAT1R Ad-siControl。Ad-siAT1R之间没有显著差异观察组和Ad-siControl组血糖为2.8毫米。相反,有显著改善胰岛素分泌反应16.7毫米葡萄糖(SR 6.1±1.0) Ad-siAT1R组相比,模拟组老(2.3±0.6)或Ad-siControl组(SR 2.0±0.4) ()(图5)。

Perifusion是一个金色的方法来评估第一阶段胰岛素分泌胰岛体外。小岛db / db老鼠的表现只是一个轻微的胰岛素分泌,而小岛对待Ad-siAT1R显示明显增加胰岛素峰值16.7毫米葡萄糖加载后1分钟()(图6)。

3.5。减少Ad-siAT1R治疗胰岛胰高血糖素分泌的db / db的老鼠

胰高糖素的分泌由胰岛perifusion化验体外。持续的Ad-siControl组观察胰高血糖素水平升高,而Ad-siAT1R组显示显著降低胰高血糖素分泌,因为被16.7毫米刺激葡萄糖溶液与Ad-siControl集团()(图7)。

3.6。Glucose-Sensing设备改善β的肽

葡萄糖transporter-2 (GLUT-2)和葡糖激酶(GCK)被认为是主要组成部分β细胞glucose-sensing装置。因此,我们进一步研究了GLUT-2和GCK小岛的表达水平。通过免疫印迹,两GLUT-2显著下降(65.8%)和GCK(62.7%)被发现在db / db的老鼠相比,db / m老鼠()(图8)。在减少AT1R表达的同时,GLUT-2的表达和GCK增加了190%和121%,分别在小岛Ad-siAT1R对待,而那些对待Ad-siControl ()(图9)。

4所示。讨论

RAS组件一直被表达在啮齿动物和人类的小岛。局部RAS胰岛功能的作用已经成为最近研究的焦点,自从Chappell MC和他的同事们发现内在狗大约20年前外分泌胰腺血管紧张素系统(19]。当地的胰腺RAS已被证明是调节糖尿病动物,而治疗RAS封锁可以改善β各种研究细胞功能和葡萄糖耐量(20.- - - - - -22]。但共同的RAS封锁通常抑制RAS系统而不是本地的。所以我们不能排除这种可能性,这些好处是依赖于循环RAS系统组件的变化由于先前的实验设计的缺陷。在目前的研究中,我们确实抑制的表达intraislet AT1R的RNAi,特定的基因沉默的和有效的方式。我们成功地表达下调AT1R的表达胰岛,发现不仅显著改善第一阶段胰岛素分泌也显著减少Ad-siAT1R组的胰高糖素分泌的功能。更重要的是,我们的研究结果表明,改善胰岛功能通过阻断intraislet AT1R与检测增加IRS-1, IRS-2, pi3激酶p85, phospho-Akt2表达水平,以及活动的增加glucose-sensing装置如GLUT-2和GCK胰岛。

RAS封锁的机制的保护作用对胰岛功能复杂多样。一项研究发现,RAS封锁可以改善胰岛微血管密度及其功能,建议改善血液供应的小岛可能是一个关键机制RAS封锁保护胰岛功能(23]。Tikellis et al。20.]表明,慢性(10周)RAS抑制10周时开始减毒无序Zucker糖尿病脂肪大鼠胰岛结构;这些有利影响部分归因于intraislet减少纤维化,细胞凋亡和氧化应激。与此同时,关颖珊和梁(21)表示,年轻的糖尿病小鼠胰岛AT1R激活可以通过UCP-driven调解失败进步胰岛细胞氧化损伤。此外,最近的发现表明高葡萄糖水平对胰岛功能的影响可能是由当地的胰岛RAS,部分at₂受体,通过改变β细胞钾离子通道(24]。然而,RAS产生这些影响是如何记录较少,仍有待澄清。

最近的一些研究已经表明β肽表达胰岛素信号系统的组件包括胰岛素受体、胰岛素受体底物(IRS-1和IRS-2)、磷脂酰肌醇3-kinase (PI3-K)和蛋白激酶B (25- - - - - -27]。IRS-1和IRS-2分子是关键调解人在胰岛素和igf - 1信号及其重要性β细胞生理已经被一些研究证明。首先,胰岛素与受体结合的表面β肽,使胰岛素受体的酪氨酸磷酸化,IRS-1, PI3-K。这种激活PI3-K导致PIP3的生产。其次,PIP3 PH值结合域的一种蛋白激酶,促进其激活,刺激GLUT-2易位和葡萄糖吸收β肽。最后,增加细胞内的葡萄糖会导致增加生产ATP GCK催化的。增加ATP / ADP比导致关闭的钾通道和去极化β肽导致钙通道的开放和胰岛素分泌28]。因此,作为胰岛素信号分子、IRS-1 PI3-K,和Akt在GSIS扮演重要的角色。国税局的表达下降或错乱的信号转导通路导致胰岛素分泌受损类似在2型糖尿病。在这项研究中,我们发现intraislet抑制AT1R表达导致显著提高第一阶段胰岛素分泌水平显著增加蛋白质的IRS-1, IRS-2, PI3-K p85,和磷酸化Akt。这样的结果表明,红外/国税局/ PI3-K / Akt可能充当intraislet RAS活性和GSIS之间潜在的联系。

如前所述,GLUT-2和GCK glucose-sensing装置β细胞在GSIS扮演重要角色。GSIS是由葡萄糖的摄取葡萄糖转运体GLUT-2易位的胰腺β细胞。建议GLUT-2-null小鼠高血糖的和hypoinsulinemic失去第一阶段分子胰岛素分泌和在生命的前3周死亡29日]。此外,GCK葡萄糖代谢的病原反应步骤β肽,因此对整个过程有控制强度高的葡萄糖利用率,葡萄糖氧化和胰岛素分泌。发现GCK基因突变的许多成年糖尿病病例占青年(们)已经指出所发挥的关键作用这种酶在葡萄糖稳态30.,31日]。Im Walde等人发现,GCK mRNA下降了50%在胰腺的糖尿病小鼠与正常小鼠相比32]。在这里,我们表明,GLUT-2在db / db老鼠和GCK表达明显低于在db / m的老鼠,虽然被Ad-siAT1R AT1R抑制后恢复。综上所述,我们可以得出结论,AT1R抑制提高GSIS通过恢复β细胞的胰岛素敏感性和下游glucose-sensing装置,详细机制有待将来进一步研究的工作。

一些研究显示AngII-mediated胰岛素抵抗的机制。AngII可以发挥其对胰岛素敏感性的影响通过AT1受体在至少三个方面。首先,AngII直接抑制tyrosine-phosphorylation IRS-1 IRS-1并增加丝氨酸磷酸化和PI3-K p85调节亚基(33]。其次,AngII间接地脱去磷酸IR和IRS-1通过激活TNF -α和蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP) 1 b (34]。此外,AngII-induced氧化应激损害PI3-K活动及其下游信号,包括大规模AKT2-mediated易位和表达水平的其他glucose-sensing装置(35]。因此,在我们的研究中,AT1R抑制诱导增加酪氨酸磷酸化IRS-1和PI3-K p85调节亚基可能有助于改善β细胞的胰岛素敏感性。因为我们之前的研究表明氧化应激标记的表达水平在db / db小鼠胰岛与坎地沙坦治疗,减少氧化应激的减轻可能的影响因子β细胞的胰岛素敏感性和下游glucose-sensing器表达式。

第一次,我们评估胰高糖素动态分泌perifusion和发现Ad-siAT1R组显著减少胰高糖素分泌的功能。胰高血糖素是校长counterregulatory激素,胰岛素反对行动的主要协调bihormonal控制葡萄糖体内平衡。越来越多的证据表明,胰高血糖素分泌增加是与二型糖尿病的发展36]。7月份发表的一项研究显示,卡托普利似乎减少高脂肪hyperglucagonemia食源性小鼠胰岛素抵抗[37]。但胰高血糖素分泌的机制是被拉块还远不清楚。胰岛素的一致的一个重要的角色β细胞胰岛素受体和胰腺的胰岛素信号分子表达的高度α肽和调节中发挥重要作用α细胞功能(38- - - - - -42]。胰岛素受体缺陷在胰腺的胰岛素信号通路α细胞可能导致糖尿病hyperglucagonemia的发展,表现为减弱刺激一种蛋白激酶磷酸化和insulin-suppressed胰高糖素分泌的功能障碍43]。因此,可想而知,AT1R块可以减弱hyperglucagonemia通过恢复胰岛素抑制胰高血糖素分泌的胰岛素,主要通过提高第一阶段胰岛素分泌(间接)和胰岛素的敏感性α细胞(直接)。然而,详细机制仍有待进一步探讨使用胰岛在未来的研究α细胞的压力。

总之,我们的研究表明,intraislet AT1R的至关重要的生理调节胰岛素的敏感性β细胞,从而影响glucose-induced胰岛素释放。我们还发现intraislet抑制AT1R表达胰高血糖素分泌的差别导致了对这些孤立的小岛db / db的老鼠。AT1R抑制剂的特点在胰岛素和胰高糖素分泌的功能障碍可以使它成为一个潜在的新疗法2型糖尿病的预防和治疗。

缩写

AT1R:	血管紧张素ⅱ1型受体
GSIS:	分子生物学胰岛素分泌
国税局:	胰岛素受体底物
GCK:	葡糖激酶
GLUT-2:	葡萄糖transporter-2
ACEI:	血管紧张素转化酶抑制剂
ARB:	血管紧张素受体阻滞剂
AGT:	Angiotenogen
PI3-K:	磷脂酰肌醇3-kinase
一种蛋白激酶:	蛋白激酶B
PDK-1:	Phosphoinositide-dependent激酶1。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

刘甄张和春燕这项研究同样起到了推波助澜的作用。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(没有。81000568,没有。81173622,没有。30900697)、江苏省自然科学基金(没有。BK2012781),南京军区(没有和科学基础。11 ma100)。