隔离的胰腺祖细胞与造血干细胞的表面标记

文摘

分离胰腺祖细胞与造血干细胞的表面标记,干细胞抗原的表达(本来)和c - kit coexpression的胰腺十二指肠homeobox-1 (PDX-1) neurogenin 3 (Ngn3)和胰岛素在小鼠胚胎胰腺检查。然后不同的胰腺癌细胞的亚种群被magnet-activated孤立细胞排序。孤立的细胞在悬滴培养过夜。当细胞形成球体,他们放在漂浮在空气过滤器/介质界面。这种新的文化系统,胰腺祖细胞诱导分化内分泌和外分泌细胞。结果表明,c - kit和本来就以不同的方式表达在胚胎胰腺为12.5,15.5和17.5天的妊娠。c - kit的表达,本来是最高的15.5天的妊娠。c - kit而不是本来就与PDX-1 coexpressed Ngn3和胰岛素。细胞分化从c-Kit-positive细胞包含更多的胰岛素生产细胞,分泌更多的胰岛素对葡萄糖刺激比c-Kit-negative细胞。这些结果表明,c - kit可以用来分离胰腺祖细胞和新的文化系统允许胰腺祖细胞分化成熟的内分泌细胞。

1。介绍

识别和隔离胰腺祖细胞生成感兴趣不仅对发展的重要性,也由于他们的糖尿病治疗的潜力1]。然而,胰腺祖细胞的潜在隔离是困难的,因为缺乏特定的标记和细胞培养系统,以确定他们的能力区分(2]。胰腺十二指肠homeobox-1 (PDX-1)在胰腺癌发展起着重要的作用,是一个标志的祖细胞可以分化内分泌和外分泌细胞(3]。Neurogenin 3 (Ngn3)是一种内分泌细胞祖细胞可分化的标志(4]。然而,PDX-1 Ngn3由细胞排序不适合隔离祖细胞,因为它们的核转录因子,而不是表面标记。造血干细胞(HSC)成功地从骨髓中分离使用表面标记,如CD133干细胞antigen-1(本来)和c - kit (5,6]。最近,它已被证明,CD133用于分离胰腺祖细胞(7]。

本来就在胰腺和c - kit也表示。c - kit表达的早期大鼠胰腺首次报道了Scharfmann集团(8]。之后,他们发现c - kit是胰岛祖细胞的潜在标记(9]。王集团报道,c - kit表达在产后胰腺内分泌地区(10]。他们还表明,孤立c-Kit-positive细胞在体外可以扩展并产生新的β肽分泌胰岛素glucose-responsive的方式(11]。最近,他们发现c - kit可能是标志人类胰岛祖细胞和早期参与调解β细胞分化和生存12]。在造血系统之外,本来是由干细胞/祖也表示等多种组织和器官的心脏,肝脏和前列腺癌(13]。最近,这是表明胰岛和成人胰腺导管细胞表达本来就14]。本研究将探讨如果c - kit和本来就适合作为隔离小鼠胰腺祖细胞的表面标记。

2。材料和方法

2.1。试剂

胰腺癌标记的抗体免疫组织化学是来自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)。抗体的胰腺癌标记流式细胞术获得从研发系统(明尼阿波利斯,美国)。非结合的和藻红蛋白(PE)或FITC共轭本来就和c - kit抗体购自BD(富兰克林湖,NJ)。胰岛素酶联免疫试剂盒购自Mercodia(乌普萨拉,瑞典)。

2.2。动物

瑞士怀孕小鼠年龄在6 - 8周从河至关重要的实验动物购买公司(中国,北京)。早上postcoitum被指定为胚胎0.5天(E)。E12.5, E15.5, E17.5怀孕,怀孕的老鼠被颈椎脱位,据中国动物保健的指导委员会的指导方针。小鼠胚胎从子宫中删除。消化道是孤立和背胰腺解剖基础。

2.3。分离胰腺的雏形

背侧胰初步被胶原酶消化(σ)37°C,持续15分钟。消化后,细胞被洗两次通过注射器针头与RPMI 1640和机械分散。分离细胞被无菌过滤尼龙过滤器和单个细胞悬架。

2.4。流仪和Immunofluorescent分析

为细胞内PDX-1、Ngn3和胰岛素检验,与0.1% Triton x - 100细胞prepenetrated 15分钟在37°C标记抗体。本来就和C - kit检验,细胞被孵化为30分钟与PE共轭本来4°C或C - kit抗体,抗体isotype-matched担任控制。细胞被固定在1%聚甲醛和流式细胞术定量分析。流式细胞术分析后,细胞被放在幻灯片cytospin和荧光显微镜下观察。

2.5。RNA提取和聚合酶链反应

总RNA提取试剂盒(表达载体)。互补脱氧核糖核酸的合成是由使用MLV RT (Promenga) 2 h在37°C oligo-dT引物的存在。特定的引物被用来识别和放大本来就和c - kit。1%琼脂糖凝胶上的扩增样本菌进行可视化使用溴化乙锭。

实时PCR进行使用SYBR绿色主人混合实时PCR系统(应用生物系统公司)7500。相对量化的比较方法被用来计算每个目标基因的表达水平,GAPDH规范化。数据表现为褶皱基因表达的变化。

2.6。免疫组织化学和量化

组织在福尔马林固定,preembedded在4%琼脂糖胶凝温度低,在石蜡和嵌入。部分(4μ米厚)免疫组织化学的收集和处理。第一个抗体稀释到1/1000。二次荧光标记抗体稀释到1/200。核使用DAPI染色在蓝色。

量化染色的表面积,球体的每个部分,是数字化的。两个连续的部分之一是通过免疫组织化学方法分析了为了避免计算两次相同的细胞。染色的表面使用ImageJ量化。

2.7。隔离c-Kit-Positive和消极的细胞

隔离c-Kit-positive和消极的细胞,与PE共轭C - kit孵化的胰岛细胞抗体在4°C 30分钟。洗后,细胞被孵化anti-PE微(Miltenyl研究)。经过两次磁柱,c-Kit-positive和消极的细胞分别收集。

2.8。胰腺细胞培养后隔离(新的文化系统)

孤立c-Kit-positive和消极的细胞被停职RPMI 1640在5000个细胞的密度/μ20 l。μl细胞悬液镀在寺崎菜,菜被推翻。由于重力,细胞悬液变成了悬滴。挂在一夜之间下降,细胞聚集并形成球体。胰腺球体培养6天在0.45μm漂浮在空气过滤器/媒介接口在培养皿中,包含RPMI 1640补充10%胎牛血清,青霉素,链霉素,消息灵通的,非必需氨基酸、谷酰胺。文化是维持在37°C在空气湿润95% / 5%股份有限公司₂。

2.9。胰岛素分泌

胰腺球体被放置在一个96孔板,每口井的一个领域,和洗了三次Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲0.5% BSA (KRB)。然后球体在150年被preincubatedμl KRB缓冲0.5% BSA为60分钟,然后在150年孵化μl KRB缓冲区包含5毫米葡萄糖或25毫米葡萄糖为120分钟37°C。反应是停了,把盘子放在冰5分钟。KRB缓冲收集和用来测量水平的胰岛素释放胰岛素酶联免疫试剂盒。

2.10。统计分析

数据表示为。组之间的差异是由学生的手段以及。被认为是统计学意义。

3所示。结果

3.1。本来就和c - kit的表达在胚胎胰腺

PCR分析表明,Sca-1and c - kit表达在胚胎胰腺E12.5, E15.5, E17.5(图1(a))。为了量化表达式,实时PCR进行。结果表明:本来的表达和c - kit E15.5高于E17.5和E12.5(图1(b))。流仪分析表明,蛋白质表达本来就和c - kit E15.5也高于E17.5和E12.5(数字1(c)和1(d))。Immunofluorescent分析还表明,本来就和c - kit本地化的胰岛细胞的膜,而不是核(数字1(e)和1(f))。

3.2。本来就和c - kit的Coexpression胰腺癌标记

在E12.5,% PDX-1胚胎胰腺细胞表达。此外,% c-Kit-positive细胞表达PDX-1(数字2和3(a))。然而,PDX-1和本来就没有coexpressed(数字2和3(b))。在E15.5胚胎胰腺,% c-Kit-positive细胞coexpressed Ngn3(数字2和3(c)),但是,没有本来阳性细胞与Ngn3 coexpressed(数字2和3(d))。在E17.5胚胎胰腺,% c-Kit-positive细胞coexpressed胰岛素(数字2和3(e));但是,没有本来就与胰岛素阳性细胞coexpressed(数字2和3(f))。与HSC不同,胚胎胰腺E12.5, E15.5, E17.5,本来,c - kit没有彼此coexpress(数据没有显示)。

3.3。验证我们的新的文化体系

100000年倒在E15.5培养的胰岛细胞无序寺崎菜肴。一夜之间,细胞形成球体,因为重力(图4(一))。球体的密度增加文化6天后在浮动的过滤器。原因是胰腺祖细胞逐渐分化成内分泌和外分泌细胞,包括大量的分泌颗粒(图4 (b))。胰岛素、胰高糖素表达领域培养7天。胰岛素⁺和胰高血糖素⁺细胞聚集在一起,形成了像胰岛细胞结构。羧肽酶(CPA)也表达了球体培养7天。(图4 (c))。胰腺的表现动态标记在养殖领域被PCR检测。Ngn3的表达逐渐减少,胰岛素的表达增加在文化(图4 (d))。

3.4。c-Kit-Positive的特点和消极的胚胎胰腺细胞

在胚胎胰腺的百分比c-Kit-positive E15.5是24%%。排序后,c-Kit-positive的纯度是90%%。c-Kit-positive和消极的细胞分化成内分泌和外分泌细胞培养在我们的文化系统。球体的体积由c-Kit-positive细胞比球体由c-Kit-negative细胞(图5(一个))。胰岛素和胰高血糖素的比例从c-Kit-positive细胞球体发达不仅仅是球体由c-Kit-negative细胞(数据5(一个)和5 (b))。然而,CPA的球体由c-Kit-positive细胞的百分比低于球体由c-Kit-negative细胞(数据5(一个)和5 (c))。为了知道insulin-expressing细胞球体功能,胰岛素分泌葡萄糖反应的进一步探索。和μg / L胰岛素分别发布的球体发达形成c-Kit-positive细胞响应葡萄糖(图5毫米和25毫米5(d))。然而,和μg / L胰岛素分别发布的球体由c-Kit-negative细胞5毫米和25毫米葡萄糖。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们表明,c - kit和本来就表示动态的方式在发展中小鼠胚胎胰腺。此外,我们表明,c - kit而不是本来是胰腺祖细胞的标记与我们的新的文化体系。尽管先前的研究证明了c - kit的coexpression与胰岛素和胰高血糖素9- - - - - -11),据我们所知,这是第一次研究c - kit coexpression,本来PDX-1和Ngn3。在E12.5,几个PDX-1 c-Kit-positive细胞表达。有意思的是研究这些双阳性细胞的特点及其在胰腺癌发展中的作用。然而,这些双阳性细胞很难隔离并用于细胞疗法太少不扩张。在E15.5很高比例的Ngn3 c-Kit-positive细胞表达。然而,c-Kit-positive并不是纯粹的内分泌细胞祖细胞。隔离高度纯内分泌祖细胞,它与其他表面标记结合c - kit至关重要。c-Kit-expressing从单层上皮细胞纯化也来源于产后鼠胰岛细胞在王的集团(11]。他们还表明,c-Kit-positive细胞可能导致新的胰岛集群形成的过程。因此,本研究进一步直接证据表明,c - kit可以作为内分泌祖细胞的表面标记,这将是开发新的胰岛细胞治疗的关键。虽然我们表明,细胞分化从c-Kit-positive细胞分泌更多的胰岛素细胞分化c-Kit-negative细胞。如果血糖减少hyperglycaemic c-Kit-positive细胞移植后小鼠需要进一步调查。

在以前的研究中,结果表明,本来是nonhematopoietic祖细胞中表达,如乳腺上皮细胞祖细胞、肺epithelial-specific祖细胞和肝祖细胞(15- - - - - -17]。Seaberg等人表明,9%的胰岛细胞和15%的成人胰腺导管细胞本来是积极的。然而,这些本来就阳性细胞没有形成胰殖民地(14]。我们的结果与Seaberg的结果一致。虽然本来就不是胰腺祖细胞的标记,本来就在胚胎胰腺的作用需要进一步研究。

在目前的研究中,我们开发了一个新的细胞培养系统确定的胰岛细胞的分化能力。在悬滴培养的胰岛细胞,形成球体,促进胰腺癌细胞互相接触以及胰腺体内。我们先前表明,这种文化系统模仿体内胰腺发展和促进内分泌细胞的分化18]。更重要的是,内分泌细胞,尤其是胰岛素生产细胞,可以分化在球没有任何诱导因素。此外,胰腺癌标记表达式的动力学在文化领域与胰腺体内的重合。我们的结果表明,我们的文化系统是适合诱导胰腺祖细胞分化。除了胰腺祖细胞,我们的文化系统可用于其他类型的干细胞/祖细胞。

缩写

本来就:	干细胞抗原
Ngn3:	Neurogenin 3
PDX-1:	胰腺十二指肠homeobox-1
HSC:	造血干细胞
注册会计师:	羧肽酶一
E12.5:	胚胎12.5天
体育:	藻红蛋白。

确认

作者感谢塞西尔Haumaitre协作。这项工作是由中国国家自然科学基金(30900557,30900557),中国国家基础研究计划(2011 cb964802),和天津研究项目的应用基础和先进的技术(12 jczdjc25000)。

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