的参与Ser1898唤起人类的l型钙通道的分泌

文摘

PKA共识S1928在磷酸化网站α₁1.2亚基兔心脏l型通道,Ca_V1.2,参与Ca的规定_V1.2动力学和儿茶酚胺分泌的影响。这种突变并不改变基底Ca_V1.2当前属性或监管的Ca_V1.2当前PKA该项受体,但消除Ca_V1.2由PKA磷酸化。在这里,我们测试的贡献相应的PKA磷酸化的人类α₁1.2亚基S1898,牛嗜铬细胞儿茶酚胺分泌的调节。嗜铬细胞感染Semliki-Forest病毒载体包含人类wt或突变S1898Aα₁1.2亚基。两个亚基港T1036Y突变赋予硝苯地平不敏感。由去极化所引起的分泌的硝苯地平被电流滴定法监测。Depolarization-triggered分泌细胞中感染了wtα₁1.2或α₁1.2 / S1898A突变亚基被forskolin类似程度升高。Forskolin,直接激活adenylyl-cyclase,增加分泌率的方式在很大程度上是独立于S1898的存在。我们的结果是一致的的参与额外的PKA监管网站C-tail的(s)α₁1.2,Ca的孔隙形成亚基_V1.2。

1。介绍

电压门控钙通道(VGCCs)是由激酶激活第二信使途径(1- - - - - -4]。的dihydropyridine-sensitive VGCC,称为l型或频道,调节蛋白激酶A (PKA)和蛋白激酶C (PKC) [4]。的β肾上腺素能受体激活cAMP-dependent PKA磷酸化,从而增加压敏电阻器Ca的振幅^{2 +}电流。现在建立的β肾上腺素的信号增强的Ca^{2 +}电流通过心肌细胞动作电位磷酸化(2,4- - - - - -6),肾上腺嗜铬细胞(7,8),大鼠海马神经元(9)和骨骼肌(10]。

l型通道的PKA磷酸化导致增加开放概率()的通道(5),平均开放时间的增加,向长期空缺的(11]。在激活的β肾上腺素的信号通路增加钙电流~ 4倍,是由于磷酸化(12]。

l型通道与Gs组装,腺苷酸环化酶,PKA,磷酸酶PP2A信号复杂,使得快速调制通道的肾上腺素能受体(13]。生化研究中心显示远端c端尾的α₁1928年1.2亚基被PKA磷酸化丝氨酸(S1928) [14- - - - - -17]。磷酸化的S1928心脏和神经细胞β肾上腺素能调节(4,17- - - - - -21]。

S1928的磷酸化,磷酸化的PKA共识的α₁1.2孔隙形成亚基的兔子这是磷酸化两在体外和在活的有机体内,建议增加负责Ca^{2 +}电流(19]。

额外的磷酸化的网站也可以参与β肾上腺素能调节心脏l型钙^{2 +}渠道(16)包括细胞内β亚基的通道22,23]。因为S1928磷酸化也PKC,建议PKA和PKC信号通路在S1928收敛α₁1.2亚基增加频道活动(24]。

最近的规定由β肾上腺素的途径在小鼠心脏进行了测试在活的有机体内使用鼠标敲入的有针对性的突变S1928丙氨酸(25]。这种突变,废除PKA S1928磷酸化,并不影响动能和特征β肾上腺素能调节的l型电流。结论导致S1928建议PKA磷酸化的心肌细胞功能不参与β肾上腺素的刺激介导钙流入(25]。

在神经内分泌细胞如牛肾上腺髓质和PC12细胞,细胞膜去极化引起儿茶酚胺(CA)分泌主要由l型通道的开放(26- - - - - -28]。在这些细胞中,通道是不可或缺的一部分信号复杂,触发分泌(29日- - - - - -32]。Voltage-driven Ca的扰动^{2 +}绑定通道提出了传输的信号通道exocytotic机械和触发快速释放囊泡聚集的通道(28,31日,33- - - - - -35]。因此,通道磷酸化将修改分泌。正如前面所示的,蛋白质磷酸化或注入磷酸酶抑制剂2进入细胞抑制便利化depolarization-evoked分泌的7]。基于这些结果表明便利化是由压敏电阻器的磷酸化l型^{2 +}通道(8]。

我们检查了l型通道的调制及其在调停作用诱发使用forskolin分泌。分泌细胞中引起感染人类wtα₁1.2(胡/ wt)或α₁1.2 / S1898A(胡/ S1898A)突变体亚基。S1898站点对应S1928兔心肌细胞。分泌活动的频率由胡/ S1898A和胡/ wt-infected细胞加速了forskolin相似程度,表明变异丝氨酸1898 -丙氨酸不影响forskolin-induced儿茶酚胺分泌增加。

总体而言,我们的研究结果表明,附加PKA-sensitive磷酸化网站导致儿茶酚胺释放的PKA调制。

2。实验程序

2.1。材料和方法

完整的人类的互补1.2亚基,加入AJ224873数量,兔子β加入2 b X64298数量,兔子α2 /δ加入NM_001082276数量,请捐赠的m . Sanguinetti博士(犹他大学)。修改pSFV1表达载体质粒,一个内部核糖体进入网站从脊髓灰质炎病毒被增强型绿色荧光蛋白的基因插入后,由美国博士提供堆灰场。

诱变
标准质粒DNA的方法制备用于人类做准备α₁1.2 / S1989A。的α₁亚基编码序列(AJ224873)作为一个模板。S1898A变异,变异推出了GCC使用的密码子苑Bio-X-Act长DNA聚合酶工具包(Bioline,以色列)和容易改变主意的定点诱变PCR应用(Bioline,以色列)。使用以下引物:5′-TGCCTCACTAGGTCGAAGGGCCGCCTTCCACCTGGAATGTCTGAA和3′-TTCAGACATTCCAGGTGGAAGGCGGCCCTTCGACCTAGTGAGGCA。电流分析法研究质粒α₁1.2 / T1036Y和α₁1.2 / S1898 T1036Y插入上游的内部核糖体进入网站使用BamHI和BssHII限制网站。所有结构都验证了DNA测序和限制网站映射。

2.1.1。嗜铬细胞制备和文化

牛肾上腺获得在当地屠宰场。肾上腺髓质细胞被孤立如前所述在[34镀)和密度的5×10⁴细胞/厘米²玻璃盖放置在35毫米板,在DMEM (Gibco)补充它的x(σ,以色列)。在37°C细胞孵化有限公司5%₂和被用于测量电流的录音1 - 4天之后准备在23°C。

2.1.2。测量电流的记录从嗜铬细胞儿茶酚胺的释放

使用5电流滴定法进行了录音μm薄碳纤维电极(CFE ALA Incorp。美国纽约韦斯特伯里)和VA-10放大器(NPI-electronic,塔姆,德国)举行800 mV如前所述36]。细胞被清洗4次实验和沐浴在录音前23°C等渗的生理上的解决方案(149毫米氯化钠,氯化钾2毫米,1毫米MgCl₂2毫米CaCl₂消息灵通的,10毫米葡萄糖,和10毫米,pH值7.3 ~ 23°C(氢氧化钠)调整)。单个细胞刺激释放了一个10秒的应用等渗的60毫米~ 3氯化钾缓冲区μ微量吸液管倾斜放置5 - 7μm细胞的浴。测量电流的电流采样10 kHz,使用clampex 9.2(轴突工具)和低通滤波器1 kHz。

分泌的儿茶酚胺荧光细胞识别在480 nm激发被电流滴定法记录在感染后24小时。

2.1.3。pSFV感染

感染病毒的准备和
重组SFV粒子生成如前所述在[37]。简单地说,在体外从pSFV-GFP转录RNA,或者通过内部核糖体进入网站pSFV表达GFP (IRES)主题,pSFV-Nifedipine-insensitiveα₁1.2 -ires-gfp或pSFV-Nifedipine-insensitiveα₁1.2 / S1898A-IRES-GFP与pSFV-Helper-2 coelectroporated成BHK-21细胞RNA。病毒股市收获24小时后,激活与之前alpha-chymotrypsin感染的研究。近似浓度被感染的已知数量的估计BHK-21细胞系列稀释SFV股票,和GFP-positive细胞数。一般来说,浓度范围内的5×10⁸感染性粒子/毫升。
SFV粒子(30μL /盘)被添加到培养细胞(2×10⁵细胞每道菜)电镀后5-48 h。感染细胞GFP荧光被确定。

2.1.4。测量电流的数据采集和分析

对单个细胞的分泌率测定和平均。峰值频率量化的山坡上的单个细胞的累积事件在10秒氯化钾刺激和一段20秒poststimulus(10-40交会),平均获得细胞的意思。10-40交会期间分泌的速度决定从山坡上相应的累计飙升的情节。数据分析中描述文本和图的传说。误差线给标准错误。峰值超过三倍背景噪音(> 10 pA)进行了分析。所有的山峰被程序IGOR PRO (Wavemetrics、湖奥斯维戈,或者美国)是手动检查视力和糟糕的信号被排除在外。

2.1.5节讨论。表达在非洲爪蟾蜍卵母细胞和cRNA注入

第5和6阶段非洲爪蟾蜍光滑的卵子从卵巢切除手术麻醉的动物和转移到Ca^{2 +}无介质(96毫米氯化钠,氯化钾2毫米,1毫米MgCl₂5毫米玫瑰,pH7.4)含有1毫克/毫升胶原酶(253 U /毫克)(Wortington Bioche。美国公司)。滤泡细胞层被摇晃的卵母细胞在这个缓冲区为1.5在室温下2小时。广泛的洗后,卵母细胞被转移到ND96缓冲区(96毫米氯化钠,氯化钾3毫米,1毫米MgCl₂,1.8毫米CaCl₂5毫米玫瑰,pH7.4)包含2.5毫米丙酮酸,100 U /毫升青霉素和10μ克/毫升链霉素。卵母细胞是在ND96孵化前12-20人力资源cRNA注入。

2.1.6。cRNA注入卵母细胞和电生理学

cRNAs准备使用T7 Fermentas转录工具包(Lituania)和产品被凝胶电泳和光学密度的测量监控。在体外转录的cRNA通道亚单位的注入defolliculated卵母细胞在最后一卷510 nL使用德拉蒙德显微注射器(美国宾夕法尼亚州Broomall)。卵母细胞是维持在18°C注射后5天(30.]。

2.1.7。共焦成像

单一光学部分通过卵母细胞获得与奥林巴斯FV1000(日本奥林巴斯)配备了40 x油目标附加说明(1.3)。两个激发激光使用顺序:488 nm GFP和窄带发射过滤器505 - 525 nm。执行顺序扫描分辨率设置为512×512像素(0.621毫米/像素),和单身~ 0.5光学部分μ米厚被抓获。曝光时间是8μ秒/像素。

3所示。结果

3.1。突变亚基是针对细胞膜

序列同源性的磷酸化共识的S1928的远端c端α₁1.2孔隙形成单元对应S1898在人类α₁1.2,如图1(一个)。这个高度保守序列在各物种代表PKA共识磷酸化图案(图1(b))。

图1

α ₁ α ₁ α ₁ α ₁ α ₁ α ₁ 非洲爪蟾蜍光滑的 β α δ 膜的目标1。2和1。2/S1898A膜。(一)的示意图1。2孔隙形成的亚基。(b)比较的蛋白激酶A (PKA)的共识序列高度保守的Ser位于远端c端1。2不同的物种。(c)人类GFP -1。2(7ng /卵母细胞)和GFP -1。2/S1898A (7 ng /卵母细胞)被注入卵母细胞的2b (2.5 ng /卵母细胞)和2(5ng /卵母细胞)。五天后的卵母细胞被共焦显微成像。膜定位和表达渠道的膜是由计算像素/区域。

人类的共识S1898α₁1.2亚基变异阿拉巴马州和插入一只青蛙表达载体。cRNAs编码GFP-tagged人类α₁1.2亚基的或GFP -α₁1.2 / S1898A突变coinjected到卵母细胞随着cRNAs编码辅助兔子α2δ和β2 b通道亚单位(见部分2)。卵母细胞共焦显微镜的成像显示类似的平均灰度值为渠道,表明几乎相同的蛋白表达水平,针对膜(图1(c))。

3.2。Depolarization-Induced牛嗜铬细胞分泌在很大程度上是由,不受病毒感染的影响

调制的儿茶酚胺分泌由人类α₁在牛嗜铬细胞1.2单元测试。

首先,使用选择性通道阻断剂,我们证实depolarization-evoked释放主要是介导的l型通道(图2(一个))。诱发释放显著地抑制了5μm硝苯地平在浴(图2(一个)插图)。胞外分泌的平均时间课程存在的缺失和5μM硝苯地平的累积直方图(图所示2(一个),右上角)。峰值频率量化为单个细胞初始利率,这对应线性符合平均累积直方图(粗线)收集的细胞()在10秒60毫米氯化钾(K60)刺激和一个20秒poststimulus时期(范围10-40 sec)(图2(一个),右下)。

(一)

(b)

(c)

图2

左 μ 插图 μ 与 右)。 低,离开 较低的 正确的 左 μ 插图 μ 与 正确的 。 低,离开 低,对吧 ^{2 +} 左 正确的 在牛嗜铬细胞儿茶酚胺释放的电流滴定法测量。(a)电流滴定法电流引起的痕迹未感染嗜铬细胞由一个10秒的60毫米氯化钾(K60)如箭头所示(),并在5硝苯地平()。每个细胞的累积的事件数量(5),平均有或没有M硝苯地平,绘制时间(展开的初始视图累积高峰计数()和分泌的初始速率计算线性化的累积平均峰值计数(0.53±0.02飙升/秒;,)。(b)跟踪电流滴定法电流引起的一阵10秒60毫米氯化钾(K60)细胞感染pSFV含绿色荧光蛋白()和5的存在硝苯地平()。每单元平均(累积数量的事件5)有或没有硝苯地平和策划时间()展开的初始视图累积高峰计数()和分泌的初始速率计算线性化的累积平均峰值计数(0.52±0.01飙升/秒;)。(c)牛嗜铬细胞刺激在同一实验条件下在名义上Ca如上所述免费的解决方案()或刺激等渗的解决方案包含2毫米氯化钾假刺激()。

然后我们测试的影响Semliki森林(SFV)感染病毒在细胞分泌的速度使用SFV病毒载体窝藏GFP,如前所述[28]。可视化使用紫外检测的荧光细胞感染被K60去极化的10秒和儿茶酚胺释放被监控测量电流的峰值使用碳纤维电极,其中每个峰值表示一个囊泡的释放(36,38]。荧光细胞分泌物感染后24小时监控。释放的程度并不影响感染过程见安培计的痕迹(图2 (b))与以前的研究一致28,37]。诱发分泌明显减少硝苯地平的存在,在GFP-infected细胞,与未感染细胞(图2 (b)插图)。总时间的分泌正常化的等待时间分布的确定是0.52飙升GFP-infected细胞(图/秒2 (b),较低的)和未感染细胞(图0.53飙升/秒2(一个),较低的)。没有释放时检测到Ca的细胞被刺激^{2 +}无解决方案(图2 (c),左)或没有K60(图2 (c),正确的)。

3.3。动力学参数的测量电流的峰值和足细胞感染GFP - wt人类1.2(胡/ wt)

研究分泌由人类的通道,我们创建了一个pSFV向量表达wtα₁1.2人类通道亚基(胡/ wt)。作为一个控制我们监控的分泌细胞中诱导动力学感染pSFV向量表达GFP(见上图)。wt分泌调节α₁1.2(胡/ wt) pSFV向量是监控的5μ硝苯地平。硝苯地平麻木是用来区分内源性细胞克隆渠道和渠道,是对硝苯地平(Nif)由一个单独的氨基酸突变,T1036Y [39]。T1036Y突变通道呈现完全不透水钙离子如前所HEK 293细胞和所示非洲爪蟾蜍卵母细胞(28,39]。飙升和pre-spikes之间的差异(脚)动力学引起GFP-infected和胡/ wt-infected细胞表明牛和人类之间的差异。测量电流的峰值代表了10秒脉冲的K60从单一的GFP -和在胡/ wt-infected细胞图所示3(一个)。测量电流的电流的动力学参数,包括峰值振幅、半角,50 - 90%上升时间,集成飙升(问,灰色区域)以及脚宽,脚振幅,集成脚(问,白色区域),给出了示意图如图3 (b)。测量电流的电流是量化分析的分布数据描述为累积概率GFP和胡/ wt通道亚基(数字3 (c)- - - - - -3 (f))。对于每一个参数,每个单元格的值是平均和作为细胞的均值平均值±标准平均误差(SEM)为每个组(40]。峰值的动力学参数,包括峰值振幅,50 - 90%上升时间,和mean-charge相似而飙升半宽度略高于胡/ wt(数字3 (e)和3 (f))。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

图3

Q, grayarea Q, whitearea 插图 , 插图插图 , 插图 , 插图 , 插图), 飙升的动力学和脚参数引起GFP -和human-wt(1。2)- - - - - -胡/ wt -感染细胞是相似的。(a)测量电流的电流代表single-vesicle事件引发的10秒脉冲K60的细胞感染pSFV含有GFP或胡锦涛/ wt在5硝苯地平。(b)的动力学特性一个安培计的事件:峰值振幅,半角,50 - 90%上升时间,集成飙升()。脚信号:foot-width、foot-amplitude和集成的脚()。(c)累积分布的峰值数目和峰值振幅分析诱导GFP -或胡/ wt-infected细胞;()为峰值振幅平均值,事件的每个数据点,分别。(d)累积分布的峰值的数量和分析50 - 90%上升时间检测到GFP -和胡/ wt-infected细胞。数据绘制在类似的方式(c);平均值为50 - 90%上升时间()。(e)累积分布的峰值的数量和分析半角GFP -或胡/ wt-infected细胞()意味着值峰值半角(f)累积分布的峰值数目和分析意味着在GFP -或胡/ wt感染细胞;()平均高峰值平均电荷。(g)累积分布的脚脚的数量和分析振幅GFP -或胡/ wt-infected细胞()脚振幅平均值。(h)累积分布的脚脚宽度的数量和分析GFP -或胡/ wt-infected细胞(脚宽*意味着值。

脚宽的脚振幅和动力学没有显著不同,通过分析计算的分布数据和描述为累积概率GFP -和胡/ wt-infected细胞(数字3 (g)和3 (h))。

3.4。动力学参数测量电流的峰值和脚引起的人类wt、变异S1898A频道

的α₁1.2(胡/ wt)或α₁1.2 / S1898A(胡/ S18989A)子单元,存在二次突变T1036Y渲染通道硝苯地平不敏感是subcloned pSFV,通过一个内部核糖体进入网站表达GFP (IRES)主题28]。胡/ wt和变异的胡/ S1898A子单元,其中包括GFP, dihydropyridine不敏感,使歧视的分泌由体内表达了人类从本地牛钙通道的渠道28,39]。我们测试了细胞的动力学参数感染胡/ wt或胡/ S1898A子单元的5μM硝苯地平,24小时后感染如代表测量电流的电流(图所示4(一)和4 (b))。测量电流的峰值引起胡/ wt,和胡/ S1898A-infected细胞被量化分析的分布数据,描绘成累积概率(数字4 (c)- - - - - -4 (f);参见图3)。对于每一个参数,每个单元格的值是平均和作为细胞的均值平均值±标准平均误差(SEM)为每个组(40]。阿拉巴马州1898年Ser的突变,这阻止了磷酸化在这个网站,使考试这个网站的净效应高峰和脚的动力学参数。突变没有影响峰值和脚动力学意味着峰值振幅分布,如图所示的半宽度,电荷,或50−90%上升时间(数据4 (c)- - - - - -4 (f))。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

图4

插图) 插图插图插图插图插图胡的飙升和脚参数/ wt S1898A突变不受影响。测量电流的电流引发的510秒脉冲M硝苯地平的K60如箭头所示。(a)代表单一测量电流的事件触发细胞内感染胡/ wt亚基()或(b)胡锦涛/ S1898A ()。(c)累积分布的峰值数目和峰值振幅分析诱导在胡/ wt -和胡/ S1898A-infected细胞(为峰值振幅平均值,事件的每个数据点,分别。(d)累积分布的峰值的数量和分析50 - 90%上升时间中发现胡/ wt -和胡/ S1898A-infected细胞。数据绘制类似的方式在面板(c),平均值为50 - 90%上升时间()。(e)累积分布的峰值数目和半角分析胡锦涛/ wt -和胡/ S1898A-infected细胞;意味着值峰值半角()。(f)累积分布的峰值的数量和分析指的是在胡锦涛/ wt -和胡/ S1898A-infected细胞;平均高峰值平均费用()。(g)累积分布的脚脚的数量和分析振幅在胡锦涛/ wt -和胡锦涛/ S1898A-infected细胞;脚振幅平均值()。(h)累积分布的脚脚宽度的数量和分析胡锦涛/ wt -和胡/ S1898A-infected细胞;脚宽度平均值()。

此外,脚的值对应于pre-spike信号和描述的属性融合孔隙(41)没有任何明显的变化意味着累积事件(数据的分布4 (g)和4 (h))。

3.5。Forskolin分泌的速度增加

以往的经验显示,S1928被PKA磷酸化,两者兼而有之在体外和体内,直接由β肾上腺素能受体激动剂或间接通过forskolin [14,15]。

了解相应的共识的具体贡献PKA网站S1898儿茶酚胺释放的规定通过介导的胡,我们应用forskolin细胞感染/ wt和胡/ S1898A。

forskolin在分泌的影响进行了测试,在GFP-infected细胞。通过测量电流的电流(图所示5(一个)),1μM forskolin当应用于GFP-infected细胞增加的频率测量电流的事件。分析累积来自21显示增加峰值±3 - 33±3.1峰值/细胞(表1初始速率)和1.5倍增加从0.52±0.01,0.79±0.03 /秒(图5 (c)左)。安培计的事件的频率的增加引起forskolin也导致总儿茶酚胺分泌增加1.6倍,这是计算总平均脉冲的面积范围内10-40交会期间和之后刺激(图5 (c)正确的;表1)。


集团	#细胞	#峰值	AVG #峰值	频率		分泌
集团	#细胞	#峰值	AVG #峰值	10-40交会 (上升/秒)	褶皱	10-40交会 (pC)	褶皱

未感染	18	502年	27±4.8	0.53±0.02		15.4±1.8

绿色荧光蛋白	49	1048年	21.4±3.0	0.52±0.01		16±2.5
GFP +移频键控^一个	21	693年	33±3.2	0.79±0.03	1.5	26±4.4 *	1.6

胡/ wt	43	943年	22±2.5	0.57±0.02		17±1.9
胡锦涛/ wt +移频键控	34	1052年	30±4.9	0.86±0.03	1.5	28±4.5 *	1.6

胡/ S1898A	42	547年	13±1.4	0.35±0.01		10±0.9
胡锦涛/ S1898A +移频键控	40	953年	23.8±3.5	0.46±0.01	1.3	16±2.1 *	1.6

细胞被刺激10秒60毫米氯化钾。测量电流的电流测量在10-40秒的时间范围,其中包括10秒K60刺激和一个20秒poststimulus时期。
^一个1μM forskolin(移频键控);*。

(一)

(b)

(c)

图5

μ 与左。与 正确的 左 1 正确的 forskolin的影响在GFP-infected嗜铬细胞。电流滴定法电流引起了一阵10秒60毫米氯化钾(K60) GFP-infected在存在1M forskolin,如箭头所示。(一)代表单安培计的事件GFP-infected细胞()或没有forskolin ()。(b)的累积平均每个细胞的事件数量GFP-infected细胞有或没有forskolin绘制时间()一个扩展的初始累计飙升数绘制视图时间()。(c)分泌的初始速率计算线性化的累积平均峰值计数()。意味着计算单个细胞的平均500多峰值;见表。儿茶酚胺分泌的总量是量化的平均总意味着收费。求和的细胞感染高峰地区GFP在10-40秒的时间范围,其中包括10秒K60刺激和一个20秒poststimulus时期();*。

接下来,我们比较了forskolin对分泌的影响由胡/ wt或胡/ S1898A。代表所示测量电流的痕迹,forskolin加速分泌细胞内感染的速度胡/ wt或胡/ S1898A(图6(一))。测量电流的峰值的频率的增加引起forskolin量化如上所述(见图2)。GFP -和胡/ wt-infected细胞,分泌的速度提高了1.5倍,在胡/ S1898A-infected细胞(图1.3倍6(一)和6 (b)和表1)。Forskolin增加的总释放儿茶酚胺相似程度(1.6倍),GFP -,胡/ wt -,或胡/ S1898A-infected细胞,总结在条形图(图6 (c))和表1。

(一)

(b)

(c)

图6

左 正确的 μ 与。与 较低的 左 正确的 Forskolin加速分泌到相同的程度上胡/ wt -和胡/ S1898A-infected细胞。电流滴定法电流引起了一阵10秒60毫米氯化钾(K60)所指示的箭头,在嗜铬细胞感染pSFV包含胡/ wt ()或胡/ S1898A ()在1M forskolin和5硝苯地平。(一)代表单一的测量电流的事件在胡/ wt或胡/ S1898A感染细胞,有或没有forskolin。(b)事件的累积数量对胡锦涛胡锦涛/ wt -,每个细胞平均/ S1898A-infected细胞(和),有或没有forskolin (和),是策划时间一个扩展的初始累计飙升数绘制视图时间()。(c)分泌的初始利率计算的线性化累积平均峰值计数()。意味着计算平均为单个细胞来自500多个峰值;见表四。的儿茶酚胺分泌总量是量化的平均总意味着收费。胡总和高峰地区细胞感染/ wt(空的列)或胡/ S1898A(灰色列)在10-40秒的时间范围();*。

Forskolin诱导类似upregulation释放事件由人类胡/ wt和内生牛频道(以细胞GFP)感染。较小的增加(1.3倍与1.5倍)是观察在胡/ S1898A-infected细胞。

3.6。的影响Forskolin动力学的测量电流的峰值和脚

尽管forskolin分泌的频率的增加,不影响个人的动力学测量电流的峰值和prespikes观察(脚),如表如果在网上的补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2011/746482。

4所示。讨论

4.1。的贡献S1898嗜铬细胞分泌的速度

牛嗜铬细胞中膜去极化引起儿茶酚胺释放主要是通过激活dihydropyridine-sensitive VGCC,称为l型通道。这是以前使用选择性显示设计马力l型通道阻滞剂(26,28]。的活动像其他VGCC被磷酸化进一步调制(2,4]。

磷酸化的l型或频道通过蛋白激酶A (PKA)和蛋白激酶C (PKC)进一步调节通道的动力学(4]。心脏和神经细胞的生化研究表明,远端c端尾的α₁1928年1.2亚基被PKA磷酸化丝氨酸(S1928) [14- - - - - -17]。这一共识磷酸化网站对应S1898在人类,这里我们有测试这个网站是否在人类的孔隙形成α₁1.2亚基有助于在牛嗜铬细胞儿茶酚胺释放的规定。

首先我们确认牛嗜铬细胞感染pSFV向量含有GFP保留他们对硝苯地平的敏感性。分泌的CA监控使用碳纤维电流滴定法降低了85%以上。

这两个人类wtα₁1.2(胡/ wt)和α₁1.2 / S1898A(胡/ S1898A)子单元,这也同样表达了和有针对性的细胞膜,通过Semliki森林引入嗜铬细胞病毒感染。两个通道亚单位拥有一个额外的突变,呈现他们硝苯地平麻木不仁。分泌在感染细胞进行了硝苯地平的存在,使的功能歧视L-type-mediated由体内分泌表达了人类从本地牛Ca的渠道^{2 +}频道。的频率和总分泌儿茶酚胺释放是由内生牛通道是类似于人类α₁1.2(胡/ wt)通道。同样的参数和prespike(脚)参数是没有区别的。

4.2。独立于S1898 Forskolin高架Depolarization-Evoked分泌

蛋白质microsequencing phospho-peptide映射的PKA网站证实发生磷酸化,丝氨酸1928糖基附近的心脏α₁1.2 [14]。基于这些结果建议单一网站S1928参与PKA共识β肾上腺素能受体通道活动的调制。

Forskolin激活腺苷酸环化酶,通过生产营地和激活PKA,导致的磷酸化α1亚基的l型通道从而上调其活动。之前显示forskolin海拔营地可以完全占的激活β肾上腺素能受体(25,42,43]。使用forskolin,我们测试的贡献人类α₁1.2亚基变异Ser1898分泌的阿拉巴马州,对应的站点S1928兔心脏α₁1.2亚基。

分泌的调制PKA激活通路被forskolin测试应用于嗜铬细胞感染了胡/ wt或胡/ S1898A子单元。

直接激活的adenylyl-cyclase forskolin GFP-infected和胡/ wt-infected细胞导致相似褶皱depolarization-evoked分泌增加率和总儿茶酚胺释放。这些结果表明人类的α₁亚基被PKA最有可能的磷酸化程度类似于内生α₁亚基。

另一方面,forskolin的积极影响分泌率略低细胞感染了胡锦涛/ S1898A亚基。这些结果表明,forskolin通过S1898仅有小幅上调诱发分泌。

这些结果与他人一致(23)已经表明,S1928磷酸化的兔子频道帐户只有部分(~ 20 - 30%)β肾上腺素能调节心肌细胞钙电流(17]。此外,在老鼠,没有可检测不同心率检测的动物相比,在注入异丙肾上腺素(25]。据预测,forskolin介导磷酸化通过额外的网站(s)的α₁1.2亚基或其他通道亚单位(22,44),只有通过S1898略。以前的研究也表明,本网站涉及的磷酸化PKC [24]。

在我们的研究中,胡/ wt和胡/ S1898A通道亚基调解速度forskolin的分泌。自从forskolin修改分泌很大程度上独立存在的Ser或者阿拉巴马州在1898位置,我们得出的结论是,cAMP-dependent PKA导致分泌的调制通过其他选择性网站(25]。其他研究提出心脏l型钙^{2 +}通道是磷酸化在基底由高水平的PKA磷酸化状态,而脱磷酸作用减少他们的活动19,45]。

总之,我们的结果表明,变异S1898几乎影响了forskolin-induced depolarization-evoked分泌增加神经内分泌细胞。鉴于类似forskolin-mediated增加分泌的速度观察细胞内感染胡/ wt和胡/ S1898A突变,我们的研究结果表明,其他磷酸化网站在l型辅助通道亚基或其他蛋白质的分泌器官参与的upregulation depolarization-evoked嗜铬细胞分泌。

确认

作者感谢迈克尔Trus评论和编辑提供的纸和哈立德Zoabe肾上腺。本文为D.A.贝蒂fef支持的基础

补充材料

辅助材料:峰值的动力学参数和脚引起的牛嗜铬细胞感染pSFV向量的α₁11.2子单元的胡/ wt和胡/ S1898A。这些细胞被刺激的10秒60毫米的氯化钾(见实验过程)。

补充材料

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