1。介绍
电压门控钙通道(VGCCs)是由激酶激活第二信使途径(
1 - - - - - -
4 ]。的dihydropyridine-sensitive VGCC,称为l型或频道
Ca
V
1。2
,调节蛋白激酶A (PKA)和蛋白激酶C (PKC) [
4 ]。的
β 肾上腺素能受体激活cAMP-dependent PKA磷酸化,从而增加压敏电阻器Ca的振幅2 + 电流。现在建立的
β 肾上腺素的信号增强的Ca2 + 电流通过
Ca
V
1。2
心肌细胞动作电位磷酸化(
2 ,
4 - - - - - -
6 ),肾上腺嗜铬细胞(
7 ,
8 ),大鼠海马神经元(
9 )和骨骼肌(
10 ]。
l型通道的PKA磷酸化导致增加开放概率(
P
o
)的通道(
5 ),平均开放时间的增加,向长期空缺的(
11 ]。在激活的
β 肾上腺素的信号通路增加钙电流~ 4倍,是由于磷酸化
Ca
V
1。2
(
12 ]。
l型通道与Gs组装,腺苷酸环化酶,PKA,磷酸酶PP2A信号复杂,使得快速调制通道的肾上腺素能受体(
13 ]。生化研究中心显示远端c端尾的
α 1 1928年1.2亚基被PKA磷酸化丝氨酸(S1928) [
14 - - - - - -
17 ]。磷酸化的S1928心脏和神经细胞
β 肾上腺素能调节
Ca
V
1。2
(
4 ,
17 - - - - - -
21 ]。
S1928的磷酸化,磷酸化的PKA共识的
α 1 1.2孔隙形成亚基的兔子
Ca
V
1。2
这是磷酸化两
在体外 和
在活的有机体内 ,建议增加负责Ca2 + 电流(
19 ]。
额外的磷酸化的网站也可以参与
β 肾上腺素能调节心脏l型钙2 + 渠道(
16 )包括细胞内
β 亚基的通道
22 ,
23 ]。因为S1928磷酸化也PKC,建议PKA和PKC信号通路在S1928收敛
α 1 1.2亚基增加频道活动(
24 ]。
最近的规定
Ca
V
1。2
由
β 肾上腺素的途径在小鼠心脏进行了测试
在活的有机体内 使用鼠标敲入的有针对性的突变S1928丙氨酸(
25 ]。这种突变,废除PKA S1928磷酸化,并不影响动能和特征
β 肾上腺素能调节的l型电流。结论导致S1928建议PKA磷酸化的心肌细胞功能不参与
β 肾上腺素的刺激
Ca
V
1。2
介导钙流入(
25 ]。
在神经内分泌细胞如牛肾上腺髓质和PC12细胞,细胞膜去极化引起儿茶酚胺(CA)分泌主要由l型通道的开放(
26 - - - - - -
28 ]。在这些细胞中,通道是不可或缺的一部分信号复杂,触发分泌(
29日 - - - - - -
32 ]。Voltage-driven Ca的扰动2 + 绑定通道提出了传输的信号通道exocytotic机械和触发快速释放囊泡聚集的通道(
28 ,
31日 ,
33 - - - - - -
35 ]。因此,通道磷酸化将修改分泌。正如前面所示的,蛋白质磷酸化或注入磷酸酶抑制剂2进入细胞抑制便利化depolarization-evoked分泌的
7 ]。基于这些结果表明便利化是由压敏电阻器的磷酸化l型2 + 通道(
8 ]。
我们检查了l型通道的调制及其在调停作用诱发使用forskolin分泌。分泌细胞中引起感染人类wt
α 1 1.2(胡/ wt)或
α 1 1.2 / S1898A(胡/ S1898A)突变体亚基。S1898站点对应S1928兔心肌细胞。分泌活动的频率由胡/ S1898A和胡/ wt-infected细胞加速了forskolin相似程度,表明变异丝氨酸1898 -丙氨酸不影响forskolin-induced儿茶酚胺分泌增加。
总体而言,我们的研究结果表明,附加PKA-sensitive磷酸化网站导致儿茶酚胺释放的PKA调制。
3所示。结果
3.1。变异< inline-formula > < mml:数学xmlns: mml = " http://www.w3.org/1998/Math/MathML " id = " M11公路" > < mml: mrow > < mml: msub > < mml: mrow > < mml: mi >α< / mml: mi > < / mml: mrow > < mml: mrow > < mml: mn > 1 < / mml: mn > < / mml: mrow > < / mml: msub > < / mml: mrow > < / mml:数学> < / inline-formula >亚基是针对细胞膜
序列同源性的磷酸化共识的S1928的远端c端
α 1 1.2孔隙形成单元对应S1898在人类
α 1 1.2,如图
1 (一个)。这个高度保守序列在各物种代表PKA共识磷酸化图案(图
1 (b))。
图1
膜的目标
α 1 1.2和
α 1 1.2 / S1898A膜。(一)的示意图
α 1 1.2孔隙形成的亚基
Ca
V
1。2
。(b)比较的蛋白激酶A (PKA)的共识序列高度保守的Ser位于远端c端
α 1 1.2不同的物种。(c)人类GFP -
α 1 1.2 (7 ng /卵母细胞)和GFP -
α 1 1.2 / S1898A (7 ng /卵母细胞)被注入
非洲爪蟾蜍光滑的 卵母细胞的
β 2 b (2.5 ng /卵母细胞)和
α 2
δ (5 ng /卵母细胞)。五天后的卵母细胞被共焦显微成像。膜定位和表达渠道的膜是由计算像素/区域。
![]()
人类的共识S1898
α 1 1.2亚基变异阿拉巴马州和插入一只青蛙表达载体。cRNAs编码GFP-tagged人类
α 1 1.2亚基的
Ca
V
1。2
或GFP -
α 1 1.2 / S1898A突变coinjected到卵母细胞随着cRNAs编码辅助兔子
α 2
δ 和
β 2 b通道亚单位(见部分
2 )。卵母细胞共焦显微镜的成像显示类似的平均灰度值为渠道,表明几乎相同的蛋白表达水平,针对膜(图
1 (c))。
3.2。Depolarization-Induced牛嗜铬细胞分泌在很大程度上是由< inline-formula > < mml:数学xmlns: mml = " http://www.w3.org/1998/Math/MathML " id = " M14 " > < mml: msub > < mml: mrow > < mml:多行文字> Ca < / mml:多行文字> < / mml: mrow > < mml: mrow > < mml:多行文字> V < / mml:多行文字> < / mml: mrow > < / mml: msub > < mml: mn > 1.2 < / mml: mn > < / mml:数学> < / inline-formula >,不受病毒感染的影响
调制的儿茶酚胺分泌由人类
α 1 在牛嗜铬细胞1.2单元测试。
首先,使用选择性
Ca
V
1
通道阻断剂,我们证实depolarization-evoked释放主要是介导的l型通道(图
2(一个) )。诱发释放显著地抑制了5
μ m硝苯地平在浴(图
2(一个)
插图 )。胞外分泌的平均时间课程存在的缺失和5
μ M硝苯地平的累积直方图(图所示
2(一个) ,
右上角 )。峰值频率量化为单个细胞初始利率,这对应线性符合平均累积直方图(粗线)收集的细胞(
n
=
49
)在10秒60毫米氯化钾(K60)刺激和一个20秒poststimulus时期(范围10-40 sec)(图
2(一个) ,
右下 )。
在牛嗜铬细胞儿茶酚胺释放的电流滴定法测量。(a)电流滴定法电流引起的痕迹未感染嗜铬细胞由一个10秒的60毫米氯化钾(K60)如箭头所示(
左 ),并在5
μ 硝苯地平(
插图 )。每个细胞的累积的事件数量(
n
=
18
5),平均有或没有
μ M硝苯地平,绘制
与 时间(
右)。 展开的初始视图累积高峰计数(
低,离开 )和分泌的初始速率计算线性化的累积平均峰值计数(0.53±0.02飙升/秒;
较低的 ,
正确的 )。(b)跟踪电流滴定法电流引起的一阵10秒60毫米氯化钾(K60)细胞感染pSFV含绿色荧光蛋白(
左 )和5的存在
μ 硝苯地平(
插图 )。每单元平均(累积数量的事件
n
=
49
5)有或没有
μ 硝苯地平和策划
与 时间(
正确的 )
。 展开的初始视图累积高峰计数(
低,离开 )和分泌的初始速率计算线性化的累积平均峰值计数(0.52±0.01飙升/秒;
低,对吧 )。(c)牛嗜铬细胞刺激在同一实验条件下在名义上Ca如上所述2 + 免费的解决方案(
左 )或刺激等渗的解决方案包含2毫米氯化钾假刺激(
正确的 )。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
然后我们测试的影响Semliki森林(SFV)感染病毒在细胞分泌的速度使用SFV病毒载体窝藏GFP,如前所述[
28 ]。可视化使用紫外检测的荧光细胞感染被K60去极化的10秒和儿茶酚胺释放被监控测量电流的峰值使用碳纤维电极,其中每个峰值表示一个囊泡的释放(
36 ,
38 ]。荧光细胞分泌物感染后24小时监控。释放的程度并不影响感染过程见安培计的痕迹(图
2 (b) )与以前的研究一致
28 ,
37 ]。诱发分泌明显减少硝苯地平的存在,在GFP-infected细胞,与未感染细胞(图
2 (b)
插图 )。总时间的分泌正常化的等待时间分布的确定是0.52飙升GFP-infected细胞(图/秒
2 (b) ,
较低的 )和未感染细胞(图0.53飙升/秒
2(一个) ,
较低的 )。没有释放时检测到Ca的细胞被刺激2 + 无解决方案(图
2 (c) ,
左 )或没有K60(图
2 (c) ,
正确的 )。
3.3。动力学参数的测量电流的峰值和足细胞感染GFP - wt人类< inline-formula > < mml:数学xmlns: mml = " http://www.w3.org/1998/Math/MathML " id = " M19 " > < mml: mrow > < mml: msub > < mml: mrow > < mml: mi >α< / mml: mi > < / mml: mrow > < mml: mrow > < mml: mn > 1 < / mml: mn > < / mml: mrow > < / mml: msub > < / mml: mrow > < / mml:数学> < / inline-formula > 1.2(胡/ wt)
研究分泌由人类的通道,我们创建了一个pSFV向量表达wt
α 1 1.2人类通道亚基(胡/ wt)。作为一个控制我们监控的分泌细胞中诱导动力学感染pSFV向量表达GFP(见上图)。wt分泌调节
α 1 1.2(胡/ wt) pSFV向量是监控的5
μ 硝苯地平。硝苯地平麻木是用来区分内源性细胞克隆渠道和渠道,是对硝苯地平(Nif)由一个单独的氨基酸突变,T1036Y [
39 ]。T1036Y突变通道呈现完全不透水钙离子如前所HEK 293细胞和所示
非洲爪蟾蜍 卵母细胞(
28 ,
39 ]。飙升和pre-spikes之间的差异(脚)动力学引起GFP-infected和胡/ wt-infected细胞表明牛和人类之间的差异
Ca
V
1。2
。测量电流的峰值代表了10秒脉冲的K60从单一的GFP -和在胡/ wt-infected细胞图所示
3(一个) 。测量电流的电流的动力学参数,包括峰值振幅、半角,50 - 90%上升时间,集成飙升(
问 ,
灰色区域 )以及脚宽,脚振幅,集成脚(
问 ,
白色区域 ),给出了示意图如图
3 (b) 。测量电流的电流是量化分析的分布数据描述为累积概率GFP和胡/ wt通道亚基(数字
3 (c) - - - - - -
3 (f) )。对于每一个参数,每个单元格的值是平均和作为细胞的均值平均值±标准平均误差(SEM)为每个组(
40 ]。峰值的动力学参数,包括峰值振幅,50 - 90%上升时间,和mean-charge相似而飙升半宽度略高于胡/ wt(数字
3 (e) 和
3 (f) )。
飙升的动力学和脚参数引起GFP -和human-wt
α
1
(1.2)-胡/ wt -感染细胞是相似的。(a)测量电流的电流代表single-vesicle事件引发的10秒脉冲K60的细胞感染pSFV含有GFP或胡锦涛/ wt在5
μ
硝苯地平。(b)的动力学特性一个安培计的事件:峰值振幅,半角,50 - 90%上升时间,集成飙升(
Q, grayarea )。脚信号:foot-width、foot-amplitude和集成的脚(
Q, whitearea )。(c)累积分布的峰值数目和峰值振幅分析诱导GFP -或胡/ wt-infected细胞;(
插图 )
, 为峰值振幅平均值
n
=
1048年
,
n
=
943年
事件的每个数据点,分别。(d)累积分布的峰值的数量和分析50 - 90%上升时间检测到GFP -和胡/ wt-infected细胞。数据绘制在类似的方式(c);平均值为50 - 90%上升时间(
插图 )。(e)累积分布的峰值的数量和分析半角GFP -或胡/ wt-infected细胞(
插图 )
, 意味着值峰值半角(f)累积分布的峰值数目和分析意味着在GFP -或胡/ wt感染细胞;(
插图 )
, 平均高峰值平均电荷。(g)累积分布的脚脚的数量和分析振幅GFP -或胡/ wt-infected细胞(
插图 )
, 脚振幅平均值。(h)累积分布的脚脚宽度的数量和分析GFP -或胡/ wt-infected细胞(
插图), 脚宽*意味着值
P
<
0.05
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
(g)
![]()
(h)
![]()
脚宽的脚振幅和动力学没有显著不同,通过分析计算的分布数据和描述为累积概率GFP -和胡/ wt-infected细胞(数字
3 (g) 和
3 (h) )。
3.4。动力学参数测量电流的峰值和脚引起的人类wt、变异S1898A频道
的
α 1 1.2(胡/ wt)或
α 1 1.2 / S1898A(胡/ S18989A)子单元,存在二次突变T1036Y渲染通道硝苯地平不敏感是subcloned pSFV,通过一个内部核糖体进入网站表达GFP (IRES)主题
28 ]。胡/ wt和变异的胡/ S1898A子单元,其中包括GFP, dihydropyridine不敏感,使歧视的分泌由体内表达了人类从本地牛钙通道的渠道
28 ,
39 ]。我们测试了细胞的动力学参数感染胡/ wt或胡/ S1898A子单元的5
μ M硝苯地平,24小时后感染如代表测量电流的电流(图所示
4(一) 和
4 (b) )。测量电流的峰值引起胡/ wt,和胡/ S1898A-infected细胞被量化分析的分布数据,描绘成累积概率(数字
4 (c) - - - - - -
4 (f) ;参见图
3 )。对于每一个参数,每个单元格的值是平均和作为细胞的均值平均值±标准平均误差(SEM)为每个组(
40 ]。阿拉巴马州1898年Ser的突变,这阻止了磷酸化在这个网站,使考试这个网站的净效应高峰和脚的动力学参数。突变没有影响峰值和脚动力学意味着峰值振幅分布,如图所示的半宽度,电荷,或50−90%上升时间(数据
4 (c) - - - - - -
4 (f) )。
胡的飙升和脚参数/ wt S1898A突变不受影响。测量电流的电流引发的5
μ
10秒脉冲M硝苯地平的K60如箭头所示。(a)代表单一测量电流的事件触发细胞内感染胡/ wt亚基(
n
=
43
)或(b)胡锦涛/ S1898A (
n
=
42
)。(c)累积分布的峰值数目和峰值振幅分析诱导在胡/ wt -和胡/ S1898A-infected细胞(
插图) 为峰值振幅平均值
n
=
1048年
,
n
=
547年
事件的每个数据点,分别。(d)累积分布的峰值的数量和分析50 - 90%上升时间中发现胡/ wt -和胡/ S1898A-infected细胞。数据绘制类似的方式在面板(c),平均值为50 - 90%上升时间(
插图 )。(e)累积分布的峰值数目和半角分析胡锦涛/ wt -和胡/ S1898A-infected细胞;意味着值峰值半角(
插图 )。(f)累积分布的峰值的数量和分析指的是在胡锦涛/ wt -和胡/ S1898A-infected细胞;平均高峰值平均费用(
插图 )。(g)累积分布的脚脚的数量和分析振幅在胡锦涛/ wt -和胡锦涛/ S1898A-infected细胞;脚振幅平均值(
插图 )。(h)累积分布的脚脚宽度的数量和分析胡锦涛/ wt -和胡/ S1898A-infected细胞;脚宽度平均值(
插图 )。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
(g)
![]()
(h)
![]()
此外,脚的值对应于pre-spike信号和描述的属性融合孔隙(
41 )没有任何明显的变化意味着累积事件(数据的分布
4 (g) 和
4 (h) )。
3.5。Forskolin分泌的速度增加
以往的经验显示,S1928被PKA磷酸化,两者兼而有之
在体外 和
体内, 直接由
β 肾上腺素能受体激动剂或间接通过forskolin [
14 ,
15 ]。
了解相应的共识的具体贡献PKA网站S1898儿茶酚胺释放的规定通过介导的
Ca
V
1。2
胡,我们应用forskolin细胞感染/ wt和胡/ S1898A。
forskolin在分泌的影响进行了测试,在GFP-infected细胞。通过测量电流的电流(图所示
5(一个) ),1
μ M forskolin当应用于GFP-infected细胞增加的频率测量电流的事件。分析累积来自21显示增加峰值±3 - 33±3.1峰值/细胞(表
1 初始速率)和1.5倍增加从0.52±0.01,0.79±0.03 /秒(图
5 (c)
左 )。安培计的事件的频率的增加引起forskolin也导致总儿茶酚胺分泌增加1.6倍,这是计算总平均脉冲的面积范围内10-40交会期间和之后刺激(图
5 (c)
正确的 ;表
1 )。
表1
forskolin的影响率和总儿茶酚胺分泌。细胞中分泌的速度确定感染了GFP,胡锦涛/ wt、wt人类
α 1 1.2亚基,胡/ S1898A和突变
α 1 1.2 / S1898A亚基。
集团
#细胞
#峰值
AVG
频率
分泌
10-40交会
褶皱
10-40交会
褶皱
未感染
18
502年
27±4.8
0.53±0.02
R
2
=
0.995
15.4±1.8
绿色荧光蛋白
49
1048年
21.4±3.0
0.52±0.01
R
2
=
0.989
16±2.5
GFP +移频键控一个
21
693年
33±3.2
0.79±0.03
R
2
=
0.994
1。5
26±4.4 *
1。6
胡/ wt
43
943年
22±2.5
0.57±0.02
R
2
=
0.989
17±1.9
胡锦涛/ wt +移频键控
34
1052年
30±4.9
0.86±0.03
R
2
=
0.982
1。5
28±4.5 *
1。6
胡/ S1898A
42
547年
13±1.4
0.35±0.01
R
2
=
0.995
10±0.9
胡锦涛/ S1898A +移频键控
40
953年
23.8±3.5
0.46±0.01
R
2
=
0.985
1。3
16±2.1 *
1。6
细胞被刺激10秒60毫米氯化钾。测量电流的电流测量在10-40秒的时间范围,其中包括10秒K60刺激和一个20秒poststimulus时期。
一个 1
μ M forskolin(移频键控);*
P
<
0.05
。
forskolin的影响在GFP-infected嗜铬细胞。电流滴定法电流引起了一阵10秒60毫米氯化钾(K60) GFP-infected在存在1
μ M forskolin,如箭头所示。(一)代表单安培计的事件GFP-infected细胞(
n
=
21
)或没有forskolin (
n
=
49
)。(b)的累积平均每个细胞的事件数量GFP-infected细胞有或没有forskolin绘制
与 时间(
左 )
。 一个扩展的初始累计飙升数绘制视图
与 时间(
正确的 )。(c)分泌的初始速率计算线性化的累积平均峰值计数(
左 )。意味着计算单个细胞的平均500多峰值;见表
1 。儿茶酚胺分泌的总量是量化的平均总意味着收费。求和的细胞感染高峰地区GFP在10-40秒的时间范围,其中包括10秒K60刺激和一个20秒poststimulus时期(
正确的 );*
P
<
0.05
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
接下来,我们比较了forskolin对分泌的影响由胡/ wt或胡/ S1898A。代表所示测量电流的痕迹,forskolin加速分泌细胞内感染的速度胡/ wt或胡/ S1898A(图
6(一) )。测量电流的峰值的频率的增加引起forskolin量化如上所述(见图
2 )。GFP -和胡/ wt-infected细胞,分泌的速度提高了1.5倍,在胡/ S1898A-infected细胞(图1.3倍
6(一) 和
6 (b) 和表
1 )。Forskolin增加的总释放儿茶酚胺相似程度(1.6倍),GFP -,胡/ wt -,或胡/ S1898A-infected细胞,总结在条形图(图
6 (c) )和表
1 。
Forskolin加速分泌到相同的程度上胡/ wt -和胡/ S1898A-infected细胞。电流滴定法电流引起了一阵10秒60毫米氯化钾(K60)所指示的箭头,在嗜铬细胞感染pSFV包含胡/ wt (
左 )或胡/ S1898A (
正确的 )在1
μ M forskolin和5
μ
硝苯地平。(一)代表单一的测量电流的事件在胡/ wt或胡/ S1898A感染细胞,有或没有forskolin。(b)事件的累积数量对胡锦涛胡锦涛/ wt -,每个细胞平均/ S1898A-infected细胞(
n
=
49
和
n
=
42
),有或没有forskolin (
n
=
43
和
n
=
40
),是策划
与 时间
。 一个扩展的初始累计飙升数绘制视图
与 时间(
较低的 )。(c)分泌的初始利率计算的线性化累积平均峰值计数(
左 )。意味着计算平均为单个细胞来自500多个峰值;见表四。的儿茶酚胺分泌总量是量化的平均总意味着收费。胡总和高峰地区细胞感染/ wt(空的列)或胡/ S1898A(灰色列)在10-40秒的时间范围(
正确的 );*
P
<
0.05
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
Forskolin诱导类似upregulation释放事件由人类胡/ wt和内生牛频道(以细胞GFP)感染。较小的增加(1.3倍与1.5倍)是观察在胡/ S1898A-infected细胞。
3.6。的影响Forskolin动力学的测量电流的峰值和脚
尽管forskolin分泌的频率的增加,不影响个人的动力学测量电流的峰值和prespikes观察(脚),如表如果在网上补充材料的doi: 10.1155 / 2011/746482。
4所示。讨论
4.1。的贡献S1898嗜铬细胞分泌的速度
牛嗜铬细胞中膜去极化引起儿茶酚胺释放主要是通过激活dihydropyridine-sensitive VGCC,称为l型通道。这是以前使用选择性显示设计马力l型通道阻滞剂(
26 ,
28 ]。的活动
Ca
V
1。2
像其他VGCC被磷酸化进一步调制(
2 ,
4 ]。
磷酸化的l型或频道
Ca
V
1。2
通过蛋白激酶A (PKA)和蛋白激酶C (PKC)进一步调节通道的动力学(
4 ]。心脏和神经细胞的生化研究表明,远端c端尾的
α 1 1928年1.2亚基被PKA磷酸化丝氨酸(S1928) [
14 - - - - - -
17 ]。这一共识磷酸化网站对应S1898在人类
Ca
V
1。2
,这里我们有测试这个网站是否在人类的孔隙形成
α 1 1.2亚基有助于在牛嗜铬细胞儿茶酚胺释放的规定。
首先我们确认牛嗜铬细胞感染pSFV向量含有GFP保留他们对硝苯地平的敏感性。分泌的CA监控使用碳纤维电流滴定法降低了85%以上。
这两个人类wt
α 1 1.2(胡/ wt)和
α 1 1.2 / S1898A(胡/ S1898A)子单元,这也同样表达了和有针对性的细胞膜,通过Semliki森林引入嗜铬细胞病毒感染。两个通道亚单位拥有一个额外的突变,呈现他们硝苯地平麻木不仁。分泌在感染细胞进行了硝苯地平的存在,使的功能歧视L-type-mediated由体内分泌表达了人类从本地牛Ca的渠道2 + 频道。的频率和总分泌儿茶酚胺释放是由内生牛通道是类似于人类
α 1 1.2(胡/ wt)通道。同样的参数和prespike(脚)参数是没有区别的。
4.2。独立于S1898 Forskolin高架Depolarization-Evoked分泌
蛋白质microsequencing phospho-peptide映射的PKA网站证实发生磷酸化,丝氨酸1928糖基附近的心脏
α 1 1.2 [
14 ]。基于这些结果建议单一网站S1928参与PKA共识
β 肾上腺素能受体通道活动的调制。
Forskolin激活腺苷酸环化酶,通过生产营地和激活PKA,导致的磷酸化
α 1亚基的l型通道从而上调其活动。之前显示forskolin海拔营地可以完全占的激活
β 肾上腺素能受体(
25 ,
42 ,
43 ]。使用forskolin,我们测试的贡献人类
α 1 1.2亚基变异Ser1898分泌的阿拉巴马州,对应的站点S1928兔心脏
α 1 1.2亚基。
分泌的调制PKA激活通路被forskolin测试应用于嗜铬细胞感染了胡/ wt或胡/ S1898A子单元。
直接激活的adenylyl-cyclase forskolin GFP-infected和胡/ wt-infected细胞导致相似褶皱depolarization-evoked分泌增加率和总儿茶酚胺释放。这些结果表明人类的
α 1 亚基被PKA最有可能的磷酸化程度类似于内生
α 1 亚基。
另一方面,forskolin的积极影响分泌率略低细胞感染了胡锦涛/ S1898A亚基。这些结果表明,forskolin通过S1898仅有小幅上调诱发分泌。
这些结果与他人一致(
23 )已经表明,S1928磷酸化的兔子频道帐户只有部分(~ 20 - 30%)
β 肾上腺素能调节心肌细胞钙电流(
17 ]。此外,在
Ca
V
1。2
年代
1928年
- - - - - -
129年
B
6
F
2
老鼠,没有可检测不同心率检测的动物相比,在注入异丙肾上腺素(
25 ]。据预测,forskolin介导磷酸化通过额外的网站(s)的
α 1 1.2亚基或其他通道亚单位(
22 ,
44 ),只有通过S1898略。以前的研究也表明,本网站涉及的磷酸化PKC [
24 ]。
在我们的研究中,胡/ wt和胡/ S1898A通道亚基调解速度forskolin的分泌。自从forskolin修改分泌很大程度上独立存在的Ser或者阿拉巴马州在1898位置,我们得出的结论是,cAMP-dependent PKA导致分泌的调制通过其他选择性网站(
25 ]。其他研究提出心脏l型钙2 + 通道是磷酸化在基底由高水平的PKA磷酸化状态,而脱磷酸作用减少他们的活动
19 ,
45 ]。
总之,我们的结果表明,变异S1898几乎影响了forskolin-induced depolarization-evoked分泌增加神经内分泌细胞。鉴于类似forskolin-mediated增加分泌的速度观察细胞内感染胡/ wt和胡/ S1898A突变,我们的研究结果表明,其他磷酸化网站在l型辅助通道亚基或其他蛋白质的分泌器官参与的upregulation depolarization-evoked嗜铬细胞分泌。