肝脏葡糖激酶_A456V引发的低血糖没有血脂异常通过矛盾归纳Glucose-6-Phosphatase催化亚基的

文摘

最近的报告指出的重要性复杂GK-GKRP控制葡萄糖和脂质稳态。几个星期突变影响GKRP绑定,导致永久激活的酶。我们假设肝超表达的变异形式的星期,星期_A456V持续的血糖低血糖患者的描述阶段(PHHI),可以提供一个模型来研究GK-GKRP放松管制的后果在活的有机体内。门将_A456V糖尿病小鼠的肝脏在链脲霉素。代谢物分析血清和肝脏中提取与葡萄糖和脂质稳态的关键组件的变化,分析了GK野生型相比,转染肝脏。细胞突变而不是野生型的划分GK显然是受到影响体内,证明受损GKRP监管。门将_A456V超表达明显降低血糖血脂异常的缺失,与野生型相比GK-overexpressing老鼠。对葡萄糖的利用证据不与肝脏中糖原和乳酸水平增加。PEPCK mRNA并不受影响,而催化亚基的mRNA glucose-6-phosphatase调节肝脏中~ 4折的星期_A456V对待动物,表明葡萄糖循环受到了刺激。我们的研究结果提供了新的见解的复杂GK监管网络和验证肝脏特异性GK激活作为糖尿病治疗的策略。

1。介绍

葡糖激酶(GK) (EC 2.7.1.1)表达glucosensitive胰腺细胞,肝、下丘脑、垂体前叶腺,enteroendocrine K和L细胞(1- - - - - -3]。门将有突出的作用作为一个葡萄糖传感器由于其特定的动力学特性,包括葡萄糖的亲和力,在生理血浆浓度范围内对葡萄糖(half-saturation级别()~ 8更易/ L),积极协调,由glucose-6-phosphate缺乏抑制。在肝脏和大脑,门将是由一个内源性抑制剂,葡糖激酶调控蛋白(GKRP) [4,5]。在饥饿、酶必将GKRP,导致其失活和封存在细胞核中。重新喂料后,葡萄糖介导的离解GK-GKRP复杂和门将把细胞质。同时,描述了几种天然激活突变,从而诱导门将构象改变,从而导致更高的亲和力葡萄糖,并减少之间的交互门将和GKRP [6,7]。一个这样的突变,A456V,完全损害GK-GKRP复杂。同样,合成GK活化剂(GKAs)增强GK活性和诱导细胞溶质的易位。(8- - - - - -12]。

有证据表明GKRP门将的监管缺陷,导致肝脏GK活动增加可能由于增加胞质易位,对血糖和甘油三酯在人类体内平衡的后果,尽管这些患者有2型糖尿病风险降低13,14]。

我们旨在研究代谢GK-GKRP放松管制的后果由overexpressing GK激活突变(星期_A456V)在肝脏insulin-deficient老鼠(缺乏内源性GK)。转染GK_{456 v}肝细胞的胞质中维护吗在活的有机体内导致缺乏改善血糖血脂异常。这些数据提供了新颖的见解GK-GKRP错乱和扩大范围的后果GKA研究肝脏。

2。材料和方法

2.1。定向诱变

博士提供的互补脱氧核糖核酸编码鼠GK好心的法蒂玛博世(CBATEG de巴塞罗那自治大学)。使用执行定点诱变产生GK-A456V cDNA QuickChange定点诱变工具包(Strategene)和特定的引物包含所需的突变(3′CTGGTCTCTGCGGCGGCCTGCAAGAAG5′, 5′GACCAGAGACGCCGCCGGTGCAAGAACG3′) Dharmacon。成功的公司证实了突变的DNA序列分析。

2.2。质粒结构和动力学分析,表达了门将

门将和GK-A456V的cdna克隆生态RI -Bgl二世pCAGGs向量包含CAG(巨细胞病毒即早期enhancer-chickenβ肌动蛋白混合)启动子15]。由此产生的质粒pGK pGK_A456V被放大大肠杆菌JM109细胞和提取使用NucleoBond PC 2000 EF兆准备工具包(Macherey-Nagel)。动物DNA注入消化了萨利·和HindIII削减双方的表达盒(16,17为了扩展表达式在活的有机体内。后来,DNA是由苯酚/氯仿抽提纯化。表达质粒转染在HuH7细胞动力学分析(补充图1可以在doi: 10.1155 / 2011/707928)。

2.3。动物护理和治疗

雄性ICR小鼠从哈伦购买Interfarma IBERICA年代。L是保持在一个恒定的12小时的光暗周期和美联储标准啮齿动物食物和水随意。所有动物协议是大学的伦理委员会批准的巴塞罗那。获取糖尿病动物,小鼠体重大约22 g是ip注射单剂量链脲霉素(STZ)(200毫克/公斤)溶解在100 mM柠檬酸/柠檬酸缓冲,pH值4.5。一个星期后,血糖在一个5小时的快速评估。只有那些老鼠血糖超过350 mg / dL。消化的质粒DNA引入小鼠肝脏使用hydrodynamic-based基因转移技术,通过快速注入大量的DNA溶液通过尾静脉18]。简单地说,60μg /鼠标DNA被稀释在2.0到2.5毫升apyrogenic Ringer-lactate解决方案(费森尤斯公司Kabi) (0.1 mL / g体重),注入尾静脉用5到10秒内27-gauge针头和注射器。通常,老鼠从2到10分钟内注射中恢复过来。在实验的最后,动物被牺牲在甲苯噻嗪/氯胺酮麻醉。血液样本被劣质静脉静脉穿刺和血清是通过离心700×g在4°C,持续15分钟。肝脏解剖,液氮快速冻结,随后储存在−80°C到分析。

2.4。免疫组织化学

门将immunodetection,肝脏从5小时禁食动物被固定在PFA 4%解决方案和冻结在10月。7μm cryosections获得在低温恒温器和应用1:50稀释GK抗体(AP7901c Abgen)后跟anti-rabbit抗体Alexa萤石488(分子探针)。

2.5。血液代谢物分析

血糖水平测量使用Glucocard内存2装置(Menarini)从血液收集的尾巴尖。兽医临床生物化学服务大学的兽医医院巴塞罗那自治大学,来自西班牙、Bellaterra测量血清代谢物。血清胰岛素决心使用超灵敏鼠标胰岛素ELISA (Mercodia AB)。

2.6。RNA提取和定量

rt - pcr总RNA提取与RNAeasy迷你包(Quiagen)。互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用准备好你让第一链珠(Amersham生物科学)与随机五个一。转基因鼠的mRNA水平GK (r-GK)量化与specie-specific引物(应用生物系统公司)和规范化使用β2-microglobulin作为内部控制在一个真正HT7700 Time-PCR系统(应用生物系统公司)。数据分析是基于方法(应用生物系统公司)。

选择感兴趣的基因的mRNA水平测量运行一个低密度阵列(应用生物系统公司)在一个真正HT7900 Time-PCR系统(应用生物系统公司)。表达规范化使用β2-microglobulin作为内生控制。数据分析ΔΔC后_t方法。

2.7。门将活动

冻结在冰冷的肝脏样本均质均匀化缓冲(消息灵通的50 mM pH值7.4,氯化钾100毫米,EDTA 1毫米,MgCl₂5毫米,德勤2.5毫米)使用polytron PT在100000×3000和离心机g 1小时在4°C。上层清液用于测定GK活动后戴维森和Arion[描述的分光光度法19]。简要的分析进行了一个解决方案包含消息灵通的50 mM pH值7.4,MgCl氯化钾100毫米₂7.5毫米,河畔⁺1毫米,ATP 5毫米,BSA 1%,表示大量的葡萄糖。反应是由添加5 U /毫升glucose-6-phosphate脱氢酶(G6PDH)明串珠菌属mesenteroides(罗氏)和增加的速率在340 nm测定吸光度。GK活性激酶活动之间的差异还计算出测量在不同葡萄糖浓度和葡萄糖0.5毫米(己糖激酶活动),并表示为mUnits / mg肝脏。

2.8。G6PDH活性

冻结在冰冷的缓冲区,肝脏样本均质含有玫瑰50 mM pH值7.4,氯化钾100毫米,EDTA 1毫米,MgCl₂5毫米,德勤2.5毫米,1%普朗尼克f - 127 (Calbiochem)和离心机在20000 g×20分钟在4°C。G6PDH活性化验通过测量NADPH的速度生产辅酶ii⁺0.5毫米和glucose-6-phosphate 2毫米,在pH值7.6 [20.]。结果表示为mUnits / mg浮在表面的蛋白质。蛋白质测定使用布拉德福德方法(Bio-Rad)。

2.9。免疫印迹

冷冻组织均质在radioimmunoprecipitation分析缓冲区(里帕)补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂和离心机在15000 g×15分钟在4°C。30μg解决组织提取的sds - page凝胶(8 - 12%)和electrotransferred到Hybond-P膜(Amersham生物科学)。抗体GK (h - 88, Sta克鲁兹)在1/500稀释使用。1/1000稀释抗体被用于以下:6-phosphofructo-2-kinase / fructose-2 6-biphosphatase (ub-PFK2)和L-pyruvate激酶(L-PK) (Ramon Bartrons的礼物,巴塞罗那大学),和碳水化合物反应元件结合蛋白(CHREBP)(罗福斯生物制品)。ACC和ACC-P ser - 79(北部)是用于1/2000。羊anti-PEPCK-C抗血清(Daryl格兰的礼物,Vandervilt大学、美国)是用于1:20000稀释。使用单克隆抗膜都是标准化的γ微管蛋白(σ)1:10000稀释。辣根过氧化物酶活性与二次抗体检测与ECL衬底(皮尔斯)在300年富士胶片LAS智能黑盒静脉成像系统。使用多计软件执行微。

2.10。肝代谢产物

免费测量肝葡萄糖,glucose-6-phosphate (G6P)和乳酸,酸匀浆从冰冻的肝脏。简而言之,高氯酸10%添加到冻块肝(5:1 v: w)和混合均质在波特Elvehjem装置在1500 rpm。匀浆然后离心机在20000 g×10分钟在4°C。上层清液的pH值是7 K₂有限公司₃4 N和离心去除KClO₄在中和形成。免费的葡萄糖测定使用葡萄糖氧化酶工具包(σ)。G6P spectrofluorometric后测量方法所描述的朗&米甲,位于G6PDH的催化反应。简而言之,分析解决方案包含三乙醇胺0.2 M pH值7.6,辅酶ii⁺0.2米,MgCl₂5毫米,G6PDH 0.17 U /毫升。乳酸是由一个基于反应催化分光光度法测定乳酸脱氢酶,古特曼& Wahlefeld。简单,反应电池包含肼/ 0.25米/ 0.7米甘氨酸缓冲,pH值9.3,EDTA 0.15毫米,河畔⁺2毫米,和35 U /毫升的乳酸脱氢酶。

fructose-2, 6-bisphosphatase (F2 6 bp)决心,冷冻肝脏均质在0.1 M氢氧化钠,加热到80°C,持续15分钟,在12000×g离心5分钟。F2 6 bp在上层的决定能够激活pyrophosphate-dependent 6-phosphofructo-1-kinase从马铃薯块茎,所描述的范Schaftingen et al。21]。

肝triacylglyceride(标签)内容以3 M KOH, 65%乙醇提取使用标签工具包(σ),基于该方法的鲑鱼和Flatt肝脏皂化。

肝糖原含量测量本质上所描述的其他地方(22]。

2.11。全身葡萄糖利用率

U -的一个解决方案¹⁴比较和葡萄糖是腹腔内注入5小时禁食STZ-diabetic老鼠(0.2毫克葡萄糖,10μCi /动物)。血液、肝脏、脑和肌肉得到30分钟后注入和溶解成解决(珀金埃尔默)。血样漂白与EDTA 0.1 M和H₂O₂(30%),肝和大脑样本漂白与H₂O₂(30%)。放射性物质被添加液体闪烁(Ecoscint H)量化和计算Wallac 1409 - 001计数器。

2.12。统计分析

结果表示为平均值±标准错误(SE)。统计分析是由单向方差分析Bonferroni期末测验。差异被认为是重要的时候。

3所示。结果

3.1。肝脏Overxpression pGK pGK_A456V

pGK_A456V野生型GK (pGK)和一个空向量(pControl),介绍了肝脏的链脲霉素(STZ)治疗的老鼠。Hydrodynamic-based交付质粒DNA导致特定的中央静脉周围肝细胞转染(23,24],繁殖的生理分布GK在肝脏腺泡(25]。这种技术诱发肝酶的瞬时释放返回控制价值观注入后的第二天。端点,转氨酶水平较低的分析,和类似的在所有治疗组(pControl 207.5±29.88 U / L, pGK 121.0±48.43 U / L, pGK_A456V117.5±40.35 U / L;9)。

时注入小鼠高血糖的(> 350 mg / dL)和胰岛素水平是发现不了的(< 0.1μg / L)。48小时接受的表达转染鼠门将和星期_A456V通过rt - pcr检测(数据没有显示)。进一步确认门将超表达是通过免疫印迹从肝提取物(图1(一)(图)和GK活性鉴定1 (b))。GK活动中无法在pControl转染肝无论葡萄糖浓度,如预期的那样在长期STZ糖尿病动物。相比之下,pGK和pGK_A456V转染组有类似GK活动100毫米葡萄糖(μg /新鲜),证明两治疗组有近似的GK蛋白质。符合葡萄糖的门将_A456V从pGK、肝提取物_A456V又动物两倍的门将活动从pGK-injected动物肝脏生理血糖浓度(5毫米)(图1 (b))。

3.2。不同划分的门将和星期_A456V

GKRP保留门将在细胞核中葡萄糖浓度和较低版本GK当胰岛素,血糖高,或fructose-1P存在26,27]。不同的研究表明,A456V突变削弱GKRP监管在体外(6,28]。因此,我们评估GKRP-dependent核封存主要从STZ-treated大鼠肝细胞转染与pGK pGK_A456V在pGKRP的存在与否。微核和胞质分数经由上述西方墨点法的实验结果分析表明,细胞的星期_A456V分布没有影响的存在GKRP(数据没有显示)。我们接下来进行划分的门将和星期_A456V在活的有机体内通过免疫组织化学。pGK-treated老鼠GK整个肝脏的免疫反应性,特别是在核(图2)。有趣的是,过表达GK_A456V蛋白质主要是局部转染肝细胞的胞质。这些数据表明,受损GKRP绑定到星期_A456V改变它的划分在活的有机体内。

3.3。葡萄糖喂养动物的体内平衡

两星期酶葡萄糖代谢的影响在美联储首次评估动物。两个门将和门将_A456V稍微降低血糖(图3(一个))。探讨肝脏中葡萄糖的命运,我们测量几个代谢物肝提取物(表1)。美联储pGK-treated老鼠显示明显高于F2 6 bp和糖原的内容(图4(一)乳酸),一起上升,表明更高的糖酵解通量。门将_A456V表达肝脏还显示肝葡萄糖自由高于控制和GK集团,尽管G6P相似的内容在所有三组。此外,F2, 6 bp和乳酸含量增加。糖原含量显著高于控制但类似pGK-treated组(图4(一))。

3.4。葡萄糖在5小时禁食动物体内平衡

pGK_A456V对待动物显示后血糖显著降低(图5快3(一个))。乳酸只是增加pGK治疗后(pControl 7.296±0.772毫米;pGK_A456V,8.778±0.649毫米;pGK, 10.62±0.608 mM -和pControl pGK_A456V-)。肝免费pGK葡萄糖含量很低_A456V治疗组(表1)。G6P水平降低到相同的程度上控制和星期_A456V组,而GK-expressing动物显示出类似的G6P和ATP浓度丰衣足食的动物。F2 6 bp和乳酸水平仍然高两治疗组比控制。GK-expressing动物糖原含量显著高于控制和星期_A456V表达组。Fed-to-fast过渡产生明显减少糖原在pGK商店_A456V对待动物相比pControl pGK,建议增加肝糖分解率的星期_A456V表达动物(图4 (b))。为了澄清是否葡萄糖分布在活的有机体内支持肝脏,我们估计的数量¹⁴C放射性来源于吸收和代谢¹⁴比较在不同组织中注射后30分钟。¹⁴C标签增加只在肝脏pGK和pGK_A456V治疗组(控制100±7.88%;门将,138.73±14.63%;门将_A456V144.1±8.99%;门将与控制和pGK_A456V与控制)。评估是否pGK_A456V在健康小鼠表达会影响葡萄糖的间隙,我们进行了葡萄糖耐量试验转染后1周(图3 (b))。

肝脏GK超表达与dislipidemia[有关29日]。坚持,我们的数据表明显著增加血清标记(pControl 33.5±7.72 mg / dL, pGK_A456V38.13±7.66 mg / dL, pGK 74.00±14.76 mg / dL,和pControl pGK_A456V)和NEFA (pGK pControl 0.325±0.09毫米_A456V0.4013±0.05毫米,pGK 0.66±0.10毫米对pControl)只有在postabsorptive状态。此外,GK overexpressing老鼠倾向于增加肝标签内容,这是符合文献[30.,31日]。相比之下,门将_A456V超表达并没有促进dislipemia,就是明证保持水平的循环NEFA和标签。有一个显著增加βpGK羟基丁酸水平_A456V集团(pControl 0.18±0.03毫米;pGK_A456V,0.27±0.03毫米-与pControl;pGK, 0.20±0.01毫米)。

为了阐明机制负责代谢剖面观察、分析蛋白质和关键酶和转录因子mRNA水平。两个门将和门将_A456V治疗是伴随着增加L-PK蛋白(数字5(一个)和5 (b))。pGK-treatment导致更高水平的无处不在的PFK2 (Pfkfb3)蛋白(数据5(一个)和5 (b)),但不是信使rna(表2)符合F2升高6 bp观察到治疗组(表1)。内生,鼠标GK mRNA表达诱导在pGK-injected小鼠的肝脏,当检测到特异性的存在。相关的表达的诱导内源性GK, cMyc mRNA在pGK-treated动物只会增加。其他监管因素涉及内生GK表达式的规定,如磷脂和LXR等α,没有受到与pGK pGK治疗_A456V(表2)。

作为增量GK表达式在肝脏通常增加脂肪生成(32,33),酶和转录因子参与新创脂肪生成进行了分析。门将,pGK_A456V为Fasn mRNA表达组提出增加内容和Mod1 pGK-treated动物的更为明显。此外,Acc1和Chrebp所诱导的超表达g·比星期_A456V。

门将,通过生产xylulose-5P,调节糖质新生的抑制葡萄糖(34,35]。F2 6英国石油公司(36)也与葡萄糖代谢的抑制作用相关的糖质新生。始终如一,我们观察到蛋白质含量的减少PEPCK pGK——和pGK_A456V治疗的老鼠。然而,PEPCK mRNA只在GK-overexpressing动物减少。同样,PGC-1α和HNF4αmrna在pGK-injected减少老鼠,而门将_A456VPGC-1 -overexpressing肝脏只显示减少α信使rna。

相比之下,催化亚基的mRNA水平glucose-6-phosphatase (Glc6Pase)明显高于星期_A456V-overexpressing动物,符合更多的糖原分解后观察到一个5小时的快。Glc6Pase蛋白质也增加评估免疫组织化学(图5 (c))。也观察到类似的结果健康小鼠overexpressing pGK_A456V经过短暂的快速(数据未显示)。

4所示。讨论

评估的后果GK GKRP激活和放松管制的肝脏,我们水动力地pGK注入_A456VSTZ-diabetic小鼠的肝脏。这个策略允许我们获得一个小鼠模型的影响外生门将孤立于内生GK(中检测不到鼠标GK mRNA和活动在pControl-treated动物)和胰岛素(胰岛素水平< 0.1μ在所有治疗组g / L)。此外,使用水动力基因转移提供了适当的纬向门将和门将的表情_A456V在perivenous肝细胞(23,25]。这种基因转移技术的效率是可变的。因此,只有动物,积极为外源表达GK由存在决定(控制3 x SD)被选为进一步分析(数据未显示)。选择后,GK-overexpressing组相同的蛋白质含量和最大活动(100毫米的葡萄糖)的数据1(一)- - - - - -1 (b)。这些结果不一致的报道不稳定肝GK蛋白质在PHHI-GK_A456V转基因小鼠(28)和GKRP淘汰赛模型(37,38),可能是因为缺乏内生pGK转录控制_A456V。此外,门将_A456V活动5毫米葡萄糖在肝中提取更高,如预期的动态变化与变异有关。

的门将_A456V突变驻留在铰链酶的构象变化与GKRP交互和变构激活有关。GKRP保留酶调节GK行动在肝细胞的细胞核在低葡萄糖浓度和解放GK当胰岛素,血糖水平高,或fructose-1P存在26,27]。我们展示这星期_A456V主要是胞质转染动物的肝脏中,与预期的野生型核划分星期。此外,门将_A456V没有适当地转移到糖尿病主要肝细胞的细胞核的存在过剩GKRP(数据没有显示)。缺乏GKRP绑定的星期_A456V显示了Heredia et al。6]在体外和推断GK绑定到合成的催化剂的结构特征(12,39]。最近的报告在GKRP P446L突变还表明,减少GK抑制导致门将活动增加,表明GK本地化的胞质(13]。

分析门将和星期_A456V过度肥胖的动物表现出小但重要的血糖的变化,结合肝葡萄糖代谢增加,所提出的更高的F2, 6 bp和糖原含量,在没有血清脂质代谢产物的变化。没有观察到变化在酶或调节蛋白参与了美联储的糖质新生动物(数据未显示)。这些结果部分符合表型观察到Morral et al。31日,33,40),使用低剂量的GK-expressing腺病毒(主要表达在门静脉周的肝细胞,41,42]),但不同于那些获得使用高剂量的腺病毒,这表明剂量和/或带状的表达g·g·超表达的代谢影响的影响。

当动物经过短暂的快速检查(postabsorptive),观察组间显著区别。

(1)GK过度降低血糖~ 15%,符合增强肝脏中葡萄糖代谢,增加G6P如图所示,F2, 6 bp,糖原含量、糖酵解和脂肪生成的酶与更高的血清乳酸,NEFA和标记浓度。松板大辅et al。43)表明,fed-to-fast过渡STZ-diabetic老鼠导致增加gluconeogenic潜力和肝脏中脂肪酸氧化,符合pControl-treated动物在目前的研究中结果。相反,导致减少PEPCK和PGC1 pGK治疗α信使rna,支持认为GK超表达间接抑制醣类和脂肪酸氧化。一致,我们测量高NEFA和标签postabsorptive血清水平虽然没有改变状态β羟基丁酸被观察到。这些结果表明,增强葡萄糖代谢造成GK超表达对血糖的影响小,可能是因为pGK剂量很低。

(2)门将_A456V过度导致显著降低血清葡萄糖的~ 60%符合高葡萄糖间隙在空腹葡萄糖耐量试验,健康的小鼠。空腹低血糖也观察到在人类的运营商P446L GKRP突变(14,44]。门将_A456V过度的浓度血清脂质而不影响β羟基丁酸是增加,与血脂异常在GK overexpressing动物在早期的研究,包括人类的运营商P446L GKRP突变(14,44]。动能和监管问题可能解释观察到的差异。

肝F2、6 bp和L-PK蛋白质增加,但其他指标(G6P Fasn mRNA, ChREBP蛋白质,信使rna和糖原内容)的葡萄糖利用率低于GK-expressing肝脏。重要的是,糖原平衡(fed-to-fast)显著低于星期_A456V表达动物,表明一个重要的糖原的净损失。G6Pase表达式也在这群动物,提供一个增加的糖原解释观察到的星期_A456V包含的肝脏。肝糖分解的G6Pase参与积极的调节已被证明在一些动物模型overexpressing P36或P46组件G6Pase系统,导致肝细胞糖原水平下降(45- - - - - -48]。此外,缺乏G6Pase系统活动中观察到疾病1型糖原存储,或G6Pase KO促进糖原累积(49]。磷酸戊糖途径的激活nonoxidative分支,由于外源性葡萄糖高,瞬变upmodulates G6Pase mRNA水平和稳定的胰岛素依赖的方式34,35]。门将_A456V表达肝脏显示G6PDH活性更高,谷胱甘肽(GSSG比率比控制或GK集团fed-to-fast过渡期间(数字4 (c)- - - - - -4 (d)和表1)。增加G6Pase信使rna和蛋白质的星期_A456V建议一个诱导葡萄糖循环。生理的解释的途径不是完全理解。然而,表明此计数器法规对葡萄糖稳态有重要的影响如果持续,因为发生在这个星期_A456V模型。

总而言之,目前的数据证实pGK超表达在肝脏导致血糖的变化相对较小,但公开dislypidemia。目前的模型表示第一次尝试过表达pGK perivenous肝细胞,并使用腺病毒(确认了以前的观测29日]。与斯科特等人的作品。50)和Morral et al。40),GK超表达在perivenous肝细胞没有明显影响Glc6Pase表达式,表明分带是一个重要的实验变量不能充分解决到目前为止。此外,我们表明,星期_A456V超表达降低血糖在很大程度上,可能诱发Glc6Pase由于其能力。

我们得出这样的结论:受损GKRP监管和星期_A456V改变动力学极大地影响肝脏代谢,获得的结果符合人类变异GKRP。此外,它表明激活GK专门在糖尿病、肝脏可能是一个可行的战略GKA研究范围的扩大。相似的结论,基于其强大的感应肝脏葡萄糖的间隙,鸡肝脏特异性GK激活在之后取得了最近的一项研究土堆et al。51]。2型糖尿病的动物模型的研究在我们实验室为了评估代谢影响的环境中胰岛素抵抗和肥胖。

确认

作者要感谢桑德拉·m·奥坎波弗朗西斯x布拉斯科和生物学的研究支持服务单位bellvige(巴塞罗那)大学博士的技术援助和玛丽亚翻车鱼回顾手稿宝贵的援助。答:诉Alabro收到DURSI奖学金(Generalitat de加泰罗尼亚)。a . Mendez-Lucas收到奖学金阵线(Ministerio de Educacion y Ciencia)。这项工作是支持的资助Ministerio de Educacion y Ciencia (bfu2006 - 02802)。

补充材料

引用

1. t . l .筹码y梁,c . c . Pettepher et al .,“上游葡糖激酶启动子分析活动的葡糖激酶在转基因小鼠和识别罕见的大脑和内脏神经内分泌细胞,”生物化学杂志,卷269,不。5,3641 - 3654年,1994页。视图:谷歌学术搜索
2. f . c . Schuit p . Huypens h . Heimberg,葡萄糖和d . g . Pipeleers传感在胰腺β肽:一个模型研究其他glucose-regulated细胞在肠道,胰腺和下丘脑,”糖尿病,50卷,不。1、1 - 11,2001页。视图:谷歌学术搜索
3. d . Zelent m . l . Golson b Koeberlein et al .,“葡糖激酶的葡萄糖传感器作用垂体前叶细胞,”糖尿病,55卷,不。7,1923 - 1929年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. e . Van Schaftingen a . Vandercammen m . Detheux d·r·戴维斯,“肝葡糖激酶的调节蛋白,”酶调控的进步32卷,第148 - 133页,1992年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. e·阿尔瓦雷斯Roncero, j . a .乔温·巴斯克斯和e .他“证据表明葡糖激酶调控蛋白质表达和与葡糖激酶在老鼠大脑,”神经化学杂志,卷80,不。1,45-53,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. 诉诉Heredia, t·j·卡尔森·e·加西亚,金黄色的太阳,“生化基础葡糖激酶激活和监管由葡糖激酶蛋白在天然突变,”生物化学杂志,卷281,不。52岁,40201 - 40207年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. f . m . Matschinsky”评估潜在的葡糖激酶活化剂对糖尿病的治疗,”自然评论药物发现,8卷,不。5,399 - 416年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. j·格里姆斯比,r . Sarabu w . l . Corbett等。“别构葡糖激酶活化剂:在糖尿病治疗的潜在作用,”科学,卷301,不。5631年,第373 - 370页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. A . m . Efanov d·g·巴雷特·m·b·布雷纳et al。”小说葡糖激酶激活调节胰岛和肝细胞功能,“内分泌学,卷146,不。9日,第3701 - 3696页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. b·雷顿,a·阿特金森和m . p . Coghlan”小分子葡糖激酶活化剂作为新型抗糖尿病药物,”生化社会事务,33卷,不。2、371 - 374年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. k·j·布罗克赫斯特诉a·佩恩·r·a·戴维斯et al .,“刺激肝细胞葡萄糖代谢的新型小分子葡糖激酶活化剂,”糖尿病,53卷,不。3、535 - 541年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. m . Futamura h . Hosaka a Kadotani et al .,“葡糖激酶的变构激活损害葡糖激酶和葡糖激酶调控蛋白质之间的相互作用和调节葡萄糖代谢,”生物化学杂志,卷281,不。49岁,37668 - 37674年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. n . l .啤酒,n . d . Tribble l . j .麦克洛克et al .,“在GCKR P446L变体与空腹血糖和甘油三酯水平施加其影响通过增加肝脏、葡糖激酶活动”人类分子遗传学,18卷,不。21日,第4088 - 4081页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. m . Vaxillaire c . Cavalcanti-Proenca a Dechaume et al .,“共同P446L多态性在GCKR反向调节空腹血糖和甘油三酯水平和降低2型糖尿病风险有分准一般法国人口,”糖尿病卷,57号8,2253 - 2257年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. h .羽、k . Yamamura和j .宫崎骏”有效选择高表达与小说真核转染子向量,”基因,卷108,不。2、193 - 200年,1991页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. c . y z . y . Chen, l·默兹·m·a·凯,“沉默的游离转基因表达质粒体内细菌的DNA元素,”基因治疗,11卷,不。10日,856 - 864年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. Z.-Y。陈,s . r .纹身彭译葶。l·默兹,他沈,和m·a·凯,“线性dna concatemerize体内,导致持续的转基因表达小鼠肝脏,”分子治疗,3卷,不。3、403 - 410年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. g . y . k歌,f . Liu,刘,“Hydrodynamics-based转染:简单而有效的方法的引入和表达转基因动物静脉注射的DNA,”方法酶学ID 5条,卷。346年,第105 - 92页,2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. a·l·戴维森和w . j . Arion“潜在因素显著低估葡糖激酶活动原油肝提取物:生理的影响细胞活性更高,”生物化学和生物物理学的档案,卷253,不。1,第167 - 156页,1987。视图:谷歌学术搜索
20. s . r . Pekovich p·r·马丁和c k . Singleton”硫胺素pyrophosphate-requiring期间改变酶pyrithiamine-induced硫胺素缺乏培养人类淋巴母”营养学杂志》,卷126,不。7,1791 - 1798年,1996页。视图:谷歌学术搜索
21. e . Van Schaftingen b·莱德尔r . Bartrons h . g .她,“焦磷酸的动力学研究:fructose-6-phosphate磷酸转移酶从马铃薯块茎。应用程序的microassay果糖2 6-bisphosphate”欧洲生物化学杂志,卷129,不。1,第195 - 191页,1982。视图:谷歌学术搜索
22. p .哈基米m·t·约翰逊,j·杨et al .,“磷酸烯醇丙酮酸carboxykinase cataplerosis的关键作用在肝脏代谢的控制,”营养和代谢,卷2,货号。33岁的2005人。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. a·g·Gomez-Valades a . Vidal-Alabro m .翻车鲀类et al .,“克服diabetes-induced高血糖通过抑制肝脏磷酸烯醇丙酮酸carboxykinase RNAi(三磷酸鸟苷),“分子治疗,13卷,不。2、401 - 410年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. v . g . Budker v . m . Subbotin t . Budker m·g·塞巴斯蒂g . Zhang和j·a·沃尔夫”机制的质粒传递水动力锡箔静脉注射。二世。形态学研究。”医学杂志》上的基因,8卷,不。7,874 - 888年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. t . Kietzmann,罗斯,美国Freimann和k . Jungermann“动脉氧气分压降低的胰岛素依赖型感应perivenously葡糖激酶在鼠肝细胞文化:模仿动脉氧压力过氧化氢,”生物化学杂志,卷321,不。1,17 - 20,1997页。视图:谷歌学术搜索
26. d .黄宗泽,p·梅达,p . b . Iynedjian”葡糖激酶和葡糖激酶调节蛋白:核本地化,相互依赖”生物化学杂志,卷348,不。1,第222 - 215页,2000。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. n . De La Iglesia m·穆赫塔尔j . Seoane j . j . Guinovart和l . Agius”监管的葡糖激酶蛋白的作用的肝细胞葡萄糖感官机制,“生物化学杂志,卷275,不。14日,第10603 - 10597页,2000年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. k·d·m·f·皮诺k . Kim谢尔顿et al .,“葡糖激酶不耐热性和肝监管蛋白结合至关重要因素预测血糖错义突变表型,”生物化学杂志,卷282,不。18日,第13916 - 13906页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. r·m·奥多尔蒂·d·l·雷曼s Telemaque-Potts和c b . Newgard”在肝脏代谢活性超表达的影响:降低喂养老鼠的血糖伴有高脂血症,”糖尿病,48卷,不。10日,2022 - 2027年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. t·费雷a . Pujol e . Riu f .博世和瓦勒拉,“纠正糖尿病改变葡糖激酶,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷93,不。14日,第7230 - 7225页,1996年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. n . Morral“基因治疗1型糖尿病:新方法,”密涅瓦》,卷95,不。2、93 - 104年,2004页。视图:谷歌学术搜索
32. t·费雷e . Riu s Franckhauser j . Agudo f .博世,“长期超表达转基因小鼠的肝脏中葡糖激酶导致胰岛素抵抗,“Diabetologia,46卷,不。12日,第1668 - 1662页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. 董n . Morral r . McEvoy h . et al .,“Adenovirus-mediated葡糖激酶的表达在肝脏作为辅助治疗1型糖尿病,”人类基因治疗,13卷,不。13日,1561 - 1570年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. d .紧密”监管葡萄糖发生glucose-6-phosphatase基因的转录和转录后机制。微分的影响葡萄糖和木糖醇”,生物化学杂志,卷276,不。6,4055 - 4062年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. 紧密d . w .陈:Barzilai et al .,“碳通量通过磷酸戊糖途径调节肝glucose-6-phosphatase表达式和磷酸烯醇丙酮酸carboxykinase基因在有意识的老鼠,”生物化学杂志,卷273,不。1,第234 - 228页,1998。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. c, d . a . Okar c . b . Newgard和a·j·兰格”过度6-phosphofructo-2-kinase / fructose-2 6-bisphosphatase在小鼠肝脏降低血糖,抑制肝葡萄糖生产,”临床研究杂志,卷107,不。1,第98 - 91页,2001。视图:谷歌学术搜索
37. d法雷利,k . s .布朗,a Tieman et al .,”老鼠突变葡糖激酶调控蛋白表现出减少肝脏葡糖激酶:一个封存在代谢调节机制,“美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷96,不。25日,第14516 - 14511页,1999年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. j·格里姆斯比,j·w·科菲·m·t·Dvorozniak et al .,“表征葡糖激酶监管身上的老鼠,”生物化学杂志,卷275,不。11日,第7831 - 7826页,2000年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. k . Kamata m .迁址,t . Nishimura j . i Eiki y .经营,“结构性基础的变构调节单体的人类葡糖激酶变构酶,”结构,12卷,不。3、429 - 438年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. 埃登贝里n . Morral h . j ., s . r .有意的j . Altomonte t·楚和m . Brown声称,“葡萄糖代谢的影响的基因调控方式的脂肪酸合成和甘油三酯在肝脏分泌,”脂质研究期刊》的研究,48卷,不。7,1499 - 1510年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. p . Lefesvre j . Attema a . Lemckert m . Havenga和d . van Bekkum”基因异质性腺病毒基因治疗,”BMC分子生物学卷,4篇文章。4、2003。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. r·j·诺埃尔糖尿病遗传操纵的前景爱思唯尔,阿姆斯特丹,荷兰,1996年。
43. t·松阪h .禧马诺:Yahagi et al .,“胰岛素依赖诱导固醇调节元件结合protein-1c表达式streptozotocin-treated小鼠的肝脏,”糖尿病,53卷,不。3、560 - 569年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. t . Sparsøg·安德森,t·尼尔森et al .,”的GCKR rs780094多态性与升高空腹血清三酰甘油,降低空腹和OGTT-related insulinaemia,并降低2型糖尿病的风险,”Diabetologia,51卷,不。1,第75 - 70页,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. j .一个y, g . Van De时和c b . Newgard”的过度P46 (T1)移位酶组件glucose-6-phosphatase复杂的肝细胞损害糖原累积通过水解葡萄糖1-phosphate,”生物化学杂志,卷276,不。14日,第10729 - 10722页,2001年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. j . Seoane k .陈r·m·奥多尔蒂et al .,“代谢的影响adenovirus-mediated超表达肝细胞葡萄糖- 6-phosphatase催化亚基的”生物化学杂志,卷272,不。43岁,26972 - 26977年,1997页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. s . Aiston刘贤美陈,a·j·兰格c . b . Newgard和l . Agius Glucose-6-phosphatase过度降低葡萄糖6-phosphate,抑制糖原合成和糖酵解在肝细胞而不影响葡糖激酶易位。反馈抑制的葡糖激酶证据。”生物化学杂志,卷274,不。35岁,24559 - 24566年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. 刘贤美陈,r·m·奥多尔蒂·安德森a·j·兰格和c b . Newgard”燃料扰动引起的体内平衡的过度glucose-6-phosphatase催化亚基在正常大鼠肝脏,”生物化学杂志,卷273,不。47岁,31615 - 31620年,1998页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
49. g . Van De只有a·兰格c . Newgard m . c . Mechin y,和a . Berteloot”新课程规定的葡萄糖代谢葡萄糖6-phosphatase系统教的,”欧洲生物化学杂志,卷267,不。6,1533 - 1549年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
50. d·k·斯科特,j·j·科利尔,t·t·t·Doan et al .,“适度葡糖激酶过度美联储在肝脏促进糖酵解和脂肪生成的酶基因的表达水平在禁食状态不改变SREBP-1c表情,“分子和细胞生物化学,卷254,不。1 - 2、327 - 337年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
51. n .土堆m . Derouet j·格里姆斯比,j·西蒙,”葡糖激酶激活引发强大的低血糖没有招聘胰岛素和抑制食物摄取鸡,”一般和比较内分泌学,卷169,不。3、276 - 283年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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