文摘

背景和目的。木贼属arvense提取(EA)施加各种生物效应,包括抗炎活性。EA在牙槽骨破坏的影响还没有被报道。因此,我们旨在确定EA可以抑制牙槽骨的破坏与牙周炎在牙周炎是使用脂多糖诱导的大鼠模型大肠杆菌(E。杆菌有限合伙人)。方法。生理盐水或E。杆菌有限合伙人或E。杆菌有限合伙人/ EA混合局部管理的牙龈沟上摩尔老鼠的区域。3天后,摩尔地区收集的牙周组织。免疫组织化学进行了组织蛋白酶K,受体激活剂NF -κB配体(RANKL), osteoprotegerin(功能)。的组织蛋白酶k为破骨细胞在牙槽骨被数。EA影响因素调节osteoclastogenesis成骨细胞的表达E。杆菌-LPS-stimulation也检查了在体外。结果。EA治疗显著降低破骨细胞的数量减少的RANKL-expression和增加OPG-expression牙周韧带治疗组相比E。杆菌lps组。的在体外研究表明,upregulation》κB激酶α和β(p-IKKα/β),p-NF -κB p65, TNF -α、白细胞介素- 6和RANKL的差别,对这些semaphorin 3 (Sema3A),β连环蛋白和成骨细胞的功能E。杆菌与EA-treatment -LPS-stimulation改进。结论。这些发现表明,局部EA鼠模型中抑制牙槽骨吸收E。杆菌-LPS-induced牙周炎通过维护一个平衡在RANKL /功能比通过NF -的途径κB, Wnt /β连环蛋白和Sema3A / Neuropilin-1。因此,EA可能具有预防骨质破坏通过抑制osteoclastogenesis归因于细胞因子下破裂斑块堆积。

1。介绍

牙周炎是一种传染病引起的牙周组织炎症/牙菌斑在牙齿和齿龈之间的接口。牙菌斑中细菌的组件,如脂多糖(LPS),促进破骨细胞的分化通过促炎因子的生产,如肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),(il - 1)及前列腺素的成骨细胞(1]。LPS促进osteoclastogenesis不仅间接通过成骨细胞的炎性细胞因子的生产也直接通过核转录因子的受体激活剂的生产κB配体(RANKL),一个osteoclastogenic因素。此外,有限合伙人也抑制osteoprotegerin的表达(功能),RANKL的诱饵受体,从而增加了RANKL /功能比最后导致破骨细胞的形成和成熟,而因此导致骨吸收(2- - - - - -5]。

因此,消除菌斑堆积,细胞因子破灭,RANKL的生产过剩,生产功能下降归因于有限合伙人是必不可少的预防牙槽骨的破坏与牙周炎有关。

目前,除菌斑和口腔环境的创建抗血小板粘附形成牙周炎的预防和治疗的基础(6]。定期刷牙是最有效手段防止牙周炎的保持良好的口腔卫生(7]。然而,被禁用或卧床不起的人往往会有一些困难在满意地刷牙和容易严重牙周炎。因此,补充口腔护理的发展方法,防止牙槽骨的破坏与牙周炎,任何人都可以很容易地应用于日常除了需要刷牙。

木贼属arvense(大肠arvense)是一种蕨类植物,广泛在北半球,特别是在欧洲和北美和中美洲8,9]。其药用价值一直以来探索古希腊人和古罗马人也使用治疗伤口(10,11]。大肠arvense提取(EA)有各种潜在药理性质,包括防腐、antiseborrheic,利尿,抗炎,抗氧化剂,王亚南,vasoprotective, vasorelaxant, antinociceptive [8- - - - - -14]。此外,大肠arvense包含二次代谢物,如槲皮素、山柰酚、木樨草素,芹黄素,齐墩果酸,桦木酸,乌索酸13,15,16),积极影响成骨细胞骨形成的(17- - - - - -26]。此外,在已知的植物,大肠arvense含有最高浓度的硅(27,28]。然而,EA对骨的影响机制了解甚少。此外,EA在牙槽骨破坏的影响归因于牙周炎尚不清楚。

之前,用一只老鼠模型LPS-induced牙周炎,我们证实了政府的EA的牙龈沟显著地降低immunoexpression TNF -α在联接的上皮细胞(29日]。肿瘤坏死因子-α促进破骨细胞祖细胞的增加在活的有机体内(30.- - - - - -33),而人类osteoclastogenesis的抑制在体外由EA也被报道(10,34];因此,我们建议EA可以抑制牙槽骨的破坏与牙周炎有关。

在这项研究中,我们旨在澄清EA是否能抑制牙槽骨的破坏与牙周炎相关使用牙周炎大鼠模型使用LPS诱导大肠杆菌(E。杆菌有限合伙人)。此外,我们调查是否EA是有用的预防和治疗牙周和其它骨破坏性的疾病,也决定的机制抑制EA对骨的影响破坏。

2。材料和方法

2.1。试剂

EA(从整体中提取大肠arvense50% 1,3-butylene乙二醇溶液)购买Maruzen制药有限公司有限公司(广岛、日本)。有限合伙人的大肠杆菌(E。杆菌有限合伙人:B6)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.2。细胞培养

ST2细胞,克隆从小鼠骨髓基质细胞行,阿尔法最低基本培养基培养(αmem)(美国马表达载体),含10%胎牛血清(美国马热费希尔科学)和补充与100 U /毫升的青霉素和100年μ链霉素的g / mL。细胞保持在37°C湿润孵化器有限公司为5%2。

2.3。定量实时聚合酶链反应(PCR)

ST2细胞(8×105细胞/ 3毫升/板)被播种到Φ6厘米板1天。在孵化后1天的新鲜培养基,细胞进一步孵化E。杆菌有限合伙人(1.0μg / mL)和EA (3μg / mL) 2、12和24小时分析osteoclastogenesis所涉及的信使rna,包括白细胞介素- 6 (il - 6)、肿瘤坏死因子-α,interleukin-1β(il - 1β3),RANKL、功能和semaphorin (Sema3A)。从ST2细胞总RNA提取和纯化使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)。互补脱氧核糖核酸合成后使用ReverTra Ace®(Toyobo有限公司,日本大阪)根据制造商的协议,应用生物系统公司®StepOne™实时PCR系统(美国马热费希尔科学)是由于“快速上手”项目使用的必不可少的DNA绿色大师(罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)根据制造商的协议。反应进行了长达45周期与变性在95°C,退火在57°C,并在72°C扩展。该系统使用的引物如下:鼠标TNF -α5′-ATGAGCACAGAAAGCATGATC-3′(意义)和5′-TACAGGCTTGTCACTCGAATT-3′(反义);小鼠白介素5′-TTACACATGTTCTCTGGGAAATCGT-3′(意义)和5′-TGGTAGCATCCATCATTTCTTTGT-3′(反义);小鼠il - 1β5′-AGAGAGCCTGTGTTTTCCTCCTTG-3′(意义)和5′-GCTTCAATGAAAGACCTCAGTGCAG-3′(反义);鼠标RANKL、5′-GCACACCTCACCATCAATGC-3′(意义)和5′-GTCTGTAGGTACGCTTCCCG-3′(反义);鼠标功能,5′-CAGAGACTAATAGATCAAAGGCA-3′(意义)和5′-ATGAAGTCTCACCTGAGAAGAAC-3′(反义);鼠标Sema3A 5′-CAGTTGGGGAACTCTGGCTC-3′(意义)和5′-CAGGTTGCCCTCTGGGTTAG-3′(反义);3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内标,5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′(意义)和5′- TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(反义)。

2.4。ELISA系统

ST2细胞(2.6×105细胞/毫升)被播种到12板1天。在孵化后1天的新鲜培养基,细胞进一步孵化E。杆菌有限合伙人(1.0μg / mL)和EA (3μg / mL) 3小时或48小时分析RANKL的生产或功能。细胞上清液由Quantikine修正和分析®ELISA鼠标恍惚/ RANKL / TNFSF11免疫测定(# MTR00、研发系统、MN、美国)或Quantikine®ELISA鼠标Osteoprotegerin / TNFRSF11B工具包(# MOP00、研发系统、MN、美国)根据制造商的协议。

2.5。西方墨点法

ST2细胞(3×105细胞/毫升)在Φ6厘米培养板和刺激E。杆菌有限合伙人(1μg / mL), EA (3μg / mL)。西方墨点法进行如前所述的奖赏et al。35]。总之,细胞颗粒在冰冷的裂解resuspended缓冲区。蛋白质sds - page分离,在硝化纤维膜electro-blotted,可视化的ECL免疫印迹检测系统(英国通用电气医疗集团)(美国新泽西州Amersham,皮斯卡塔韦)。以下抗体从细胞信号技术被用作主要抗体:p-NF -κB p65 (# 3033;1:1000),NF -κB p65 (# 8242;1:1000),p-p38mitogen-activated蛋白激酶(p-p38 MAPK) (# 4511;1:1000),p38 MAPK (# 8690;1:1000),p-SAPK /物(# 4668;1:1000),t-SAPK /物(# 9258;1:1000),p-IKKα/β(S176/180)(# 2697年代;1:1000)、IKKβ(# 2678;1:1000)和β肌动蛋白(# A2228;1:8000;Sigma-Aldrich)。以下从GeneTex作为主要的抗体抗体:β连环蛋白抗体(N1N2 - 2),N术语(# GTX101435;1:1000)。

2.6。动物实验

如下描述的实验协议是广岛大学动物保健委员会批准(许可证号码:A20-32)。总共11日8-week-old雄性Wistar鼠体重330±11.9 g(范围:315 - 355 g)(查尔斯河日本公司,日本横滨)被安置在一个specific-pathogen-free设施在12小时光照周期提供水和食物随意和保持在一个恒定的环境温度和湿度(22°C, 50±5%相对湿度)。

在老鼠实验中,用一个腹腔内注射麻醉,组成的混合三种麻醉剂(4.56毫升/公斤/动物):medetomidine盐酸盐(0.03毫克/毫升,Dorbene®兽医,饲有限公司东京,日本),咪达唑仑(0.4毫克/毫升,咪达唑仑注入10毫克,Sandoz K·K。、东京、日本)和酒石酸布托啡诺(0.5毫克/毫升,Vetorphale®,明治精华制药有限公司,有限公司,东京,日本)与生理盐水稀释(大冢生理盐水,大冢制药工厂,Inc .东京,日本)。所有的努力都是尽量减少痛苦。

老鼠被固定在他们的一个实验性的站。实验结束后,所有的老鼠都牺牲了使用有限公司2气体。

每个解决方案(生理盐水(PS),E。杆菌有限合伙人(5毫克/毫升)E。杆菌有限合伙人(5毫克/毫升)/ EA (15μg / mL)局部应用到右或左上颌磨牙的牙龈沟每10分钟1小时(六次,2μL每次)。牙周组织样本随后获得3天,局部应用后,免疫组织化学。在这个模型中,增加破骨细胞表面的牙槽骨向牙周韧带被证实在3天之后LPS-application [36]。组织准备执行如前所述Yamano et al。(37]。计算数量的破骨细胞形成牙槽骨表面,4.5μ米部分,包括根从牙槽脊区到牙根尖区,准备从第一和第二磨牙和周围的牙周组织苏木精和伊红染色(圆))常规组织学评价。

2.7。免疫组织化学

免疫组织化学染色进行如前所述,Furusho et al。38]。后脱蜡和补液,4.5μm部分孵化在0.3%的过氧化氢甲醇室温下30分钟(范围:22±5°C)淬火内源性过氧化物酶的活动。孵化后蛋白质块(DAKO日本,东京,日本)10分钟在室温下,immunolocalization RANKL的功能,组织蛋白酶K检测使用anti-rat sRANKL兔抗体(# ab62516;1:2000稀释,Abcam、CB、英国)或功能anti-rat兔抗体(# ab73400;1:400稀释,Abcam、CB、英国)或anti-rat组织蛋白酶K兔抗体(# ab19027;1:500稀释,Abcam、CB、英国)。Anti-rabbit IgG抗体(设想+系统——合称为聚合物Anti-Rabbit Dako日本)被用作二次抗体。洗后的部分两次磷酸盐(PBS) 5分钟,染色是可视化使用轻拍过氧化物酶(合)衬底工具包(Dako日本)生产棕色反应产物的抗原定位的说明。

2.8。Histomorphometrical分析破骨细胞的数量

histomorphometric评价的破骨细胞,超过12代表部分包含的牙根尖disto-palatal左翼和右翼的根源上从每个实验小组第一和第二磨牙。组织切片染色和组织蛋白酶K拍摄40×和组织蛋白酶K为破骨细胞形成的牙槽骨牙槽嵴的利润包含在1毫米数手动(图1(一))来评估LPS-induced破骨细胞的形成。第一和第二磨牙的平均值作为每个样本的破骨细胞数量。

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图1
的影响木贼属arvense提取(EA)对脂多糖(LPS)全身的破骨细胞的形成。EA(15的影响μg / mL)对破骨细胞的形成大肠杆菌(E。杆菌)有限合伙人(5毫克/毫升)。牙周组织收集治疗后3天,(包含IHC)及免疫组织化学染色。(一)插图的破骨细胞计数。组织蛋白酶K的(b) Immunoexpression破骨细胞标记后3天(A′)生理盐水(控制)、(b, b′)E。杆菌有限合伙人和(C, C′)E。杆菌有限合伙人/ EA的应用程序。比例尺条= 100μm。(c)的组织蛋白酶k为破骨细胞形成的牙槽骨边缘1毫米内牙槽嵴数。提出了数据意味着±标准差(n为每个组= 7)。Tukey-Kramer多重比较检验, 。
2.9。统计分析

结果报告为平均值±标准偏差。组间差异比较使用Tukey-Kramer多个对比试验,进行了使用multcomp包R(39]。统计学意义是 或 或 。

3所示。结果

3.1。局部的EA减少破骨细胞在牙槽骨

EA的抑制作用osteoclastogenesis分析使用的老鼠模型LPS-induced牙周炎,在时间变化的组织破坏,包括中性粒细胞迁移,osteoclastogenesis,和细胞因子的表达式,建立了(40]。

破骨细胞与单核细胞的多核细胞分化和巨噬细胞祖细胞是唯一的细胞突起钙化骨的能力。组织蛋白酶K是一个papain-like半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶家族的成员,在破骨细胞只在高水平表达。组织蛋白酶K据报道出现在溶酶体和胞浆内的囊泡osteoclast-bone吸收界面在破骨细胞(41]。图1 (b)显示了在每个实验组immunolocalization组织蛋白酶K。PS-applied对照组,几个组织蛋白酶K积极的破骨细胞,是小型和位于牙槽骨边缘,进一步从观察(数字1 (b)′)。有限合伙人应用诱导许多组织蛋白酶K积极多核破骨细胞在豪希普氏沿着牙槽骨缺损边缘(数字1 (b)B和B′)。在E。杆菌有限合伙人/ EA组,破骨细胞的数量明显减少(数字1 (b)C和C′)。

图1 (c)显示的数量组织蛋白酶k为破骨细胞出现在牙槽骨边缘区域从牙槽骨嵴(图1毫米1(一))。的组织蛋白酶k为破骨细胞显著增加在LPS组相对于对照组( )。相反,EA应用显著降低LPS-induced破骨细胞对照组水平( )。

3.2。EA维护一个平衡在RANKL /功能比牙周韧带

平衡在RANKL /功能中扮演着重要的角色在决定osteoclastogenesis水平。在目前的研究中,免疫组织化学染色验证RANKL的表达水平和执行功能(图2)。在对照组,强大的RANKL积极性在骨膜成骨细胞的细胞,和弱RANKL积极的牙周韧带细胞分散在牙槽脊区(数字2(一个)D和D′)。相比之下,LPS组中,一个非常积极的反应是在牙周韧带成纤维细胞的诱导牙槽脊区(数字2(一个)E和E′)。然而,在大肠杆菌有限合伙人/ EA组,RANKL的表达蛋白明显下降(数字2(一个)F和F′)。

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图2
牙周组织的免疫组织化学检查。(一)苏木精和伊红染色(圆))来自动物的组织3天后大肠杆菌(大肠杆菌脂多糖(LPS)局部管理。(一)控制(PS-applied控制),(B)E。杆菌有限合伙人,(C)E。杆菌有限合伙人/木贼属arvense提取(EA)应用程序。Immunoexpression NF -受体激活的κB配体(RANKL)在牙槽骨的上部区域,(D, D′)控制、(E, E′)E。杆菌有限合伙人,(F, F′)E。杆菌有限合伙人/ EA的应用程序。比例尺条= 100μm。(b))染色的组织从动物获得3天之后E。杆菌有限合伙人局部管理。(一)控制,(B)E。杆菌有限合伙人和(C)E。杆菌有限合伙人/ EA的应用程序。Immunoexpression osteoprotegerin(功能)的上部区域,牙槽骨(D, D′)控制、(E, E′)E。杆菌有限合伙人,(F, F′)E。杆菌有限合伙人/ EA的应用程序。比例尺条= 100μm。

弱OPG-positive反应是既定的牙周韧带成纤维细胞的发现和骨膜成骨细胞的细胞对照组(数字2 (b)D和D′)。功能的表达降低LPS组(数字2 (b)和E′)。有趣的是,在E。杆菌有限合伙人/ EA组的表达功能恢复和倾向于更增强比对照组(数字2 (b)F和F′)。此外,在对照组,RANKL表达强烈的上牙槽骨的一部分;然而,功能也表示在这一领域,osteoclastogenesis并非诱导自平衡功能在RANKL /维护(数字2(一个)D和D′)。

在对照组,RANKL的表达抑制低水平,功能和表达(数字2(一个)D和2 (b)D)。LPS-administered组牙周韧带成纤维细胞和成骨细胞RANKL水平增加,但功能抑制(数字的表达2(一个)E和2 (b)E)。相比之下,E。杆菌有限合伙人/ EA-administered组,RANKL镇压,而功能恢复表达,和染色强度高于控制表达式(数字2(一个)F和2 (b)F)。

3.3。EA抑制LPS-Induced因素的变化调节破骨细胞的形成

破骨细胞分化和功能紧密由成骨细胞的成骨细胞和其他细胞谱系。调查EA的表达的影响因素调节破骨细胞形成与LPS刺激,ST2细胞的信使rna表达il - 6、TNF -α,il - 1β,RANKL、功能和Sema3A被定量实时PCR检测。

结果表明,EA显著抑制肿瘤坏死因子-α信使rna表达归因于LPS刺激(图3(一个))和显示RANKL的抑制趋势,il - 6和il - 1β信使rna表达(图3(一个)罪犯)。

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图3
的影响木贼属arvense提取(EA)对破骨细胞形成相关因素。(一)据报道,刺激成骨细胞的脂多糖(LPS)改变破骨细胞的表达形成相关因素。因此,我们调查了EA对破骨细胞的影响形成相关因素。肿瘤坏死因子-α白介素(IL) 6和NF -受体激活κB配体(RANKL) mRNA的表达ST2刺激大肠杆菌(E。杆菌)有限合伙人(1μg / mL)有或没有EA (3μg / mL) 2小时,总rna提取(A, B, C), il - 1β和Sema3A mRNA的表达ST2刺激E。杆菌有限合伙人有或没有EA 12小时,总rna提取(D, F)。Osteoprotegerin(功能)mRNA的表达ST2刺激E。杆菌有限合伙人有或没有EA 24小时,(E)中提取总rna。3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内部控制。提出了数据意味着±标准错误(n为每个组= 7)。Tukey-Kramer多重比较检验, , , 。(b) RANKL和功能蛋白质的表达ST2刺激大肠杆菌(E。杆菌(1)脂多糖(LPS)μg / mL)。收集细胞培养上清液3小时(对于RANKL)或治疗后48小时(功能)使用ELISA测定和分析。提出了数据意味着±标准错误(n为每个组)= 6。Tukey-Kramer多重比较检验, 。

另一方面,EA显著调节功能mRNA(图3(一个)E)表达抑制LPS刺激。此外,LPS-induced抑制Sema3A mRNA(图3(一个)F)显示经济复苏趋势。

随后,我们检查了EA的影响E。杆菌lps诱导ST2细胞RANKL的蛋白质分泌的酶联免疫分析法(ELISA)系统。结果表明,EA显著抑制RANKL蛋白质分泌(图3 (b)EA)。此外,显著增加了功能分泌降低LPS刺激(图3 (b)B)。

3.4。EA抑制LPS-Induced IKK的磷酸化,NF -κB在ST2

核因子-κB (NF -κB)及MAPKs仍旧扮演了一个重要的角色在LPS-TLR4信号造成的炎症细胞因子的生产(42,43]。因为我们的结果表明,EA LPS-stimulated降低炎性细胞因子的表达,我们建议EA也可能抑制NF -的磷酸化κB和MAPKs;c-JunN终端激酶(物)和p38,上游的炎性细胞因子。我们调查了EA对这些信号通路的影响所致E。杆菌有限合伙人(1μ通过免疫印迹g / mL)。课程分析显示的时间E。杆菌lps诱导激活NF -κB p65、物和p38 15-60分钟期间,减少后90分钟(图4(一))。随后,EA的磷酸化的影响kB激酶阿尔法,我kB激酶β(IKKα/β),NF -κB p65、物和p38检查在LPS刺激后30分钟。EA强烈表达下调p-IKKα/β和p-NF -κB p65激活E。杆菌有限合伙人,但没有表达下调pJNK或p-p38(图4 (b))。

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图4
EA对LPS诱导NF -κB和MAPKs ST2的信号通路。(一)大肠杆菌有限合伙人(1μg / mL)应用于ST2细胞和收集在几个时间点。NF -κB p65 MAPKs物和p38) ST2细胞被免疫印迹分析。β肌动蛋白作为加载控制。EA (b):木贼属arvense提取(3μg / mL)在30分钟ST2细胞进行预处理,然后E。杆菌有限合伙人(1μg / mL)此外用于ST2细胞。IKKα/βNF -κB p65, MAPKs物和p38) ST2细胞被西方墨点法评估在30分钟。β肌动蛋白作为加载控制。
3.5。EA抑制LPS-Induced退化β连环蛋白在ST2

由于功能表达式是由Wnt /β连环蛋白信号通路在成骨细胞(44EA),建议增加了功能降低LPS刺激通过Wnt /β连环蛋白信号通路。因此,我们调查的影响在Wnt / EAβ连环蛋白信号通路引起的E。杆菌有限合伙人(1μ通过免疫印迹g / mL)。过程分析表明,E。杆菌lps诱导退化β连环蛋白后30分钟后刺激E。杆菌有限合伙人(图5(一个))。随后,我们对EA的降解的影响β连环蛋白的E。杆菌有限合伙人。结果表明,EA抑制β连环蛋白降解ST2刺激细胞E。杆菌有限合伙人(图5 (b))。

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的差别EA对LPS诱导对这些Wnt /β在ST2连环蛋白信号。(一)大肠杆菌有限合伙人(1μg / mL)应用于ST2细胞和收集在几个时间点。β连环蛋白ST2细胞被免疫印迹分析。β肌动蛋白作为加载控制。(b)E。杆菌有限合伙人(1μg / mL)和/或EA;木贼属arvense提取(3μg / mL)对待ST2细胞10小时ST2细胞。β连环蛋白ST2细胞被免疫印迹分析。β肌动蛋白作为加载控制。

4所示。讨论

在这项研究中,我们证实了EA抑制牙槽骨破坏的控制通过osteoblast-mediated osteoclastogenesis通过减少磷酸化NF -κB,肿瘤坏死因子-α,和RANKL和移植Sema3A,β连环蛋白,并与LPS刺激功能。值得注意的是,EA只有LPS引起的抑制破骨细胞的增加应用程序的控制水平,表明EA可能不会抑制生理骨重塑。这是第一个报告展示osteoclastogenesis EA的抑制作用在活的有机体内。

牙周炎是由重复的挑战有害刺激物,如有限合伙人,在牙周组织由于牙周细菌导致慢性持续性感染宿主免疫和炎症反应和组织破坏,包括牙槽骨吸收。骨成骨细胞之间通过共同沟通,保持体内平衡bone-degrading破骨细胞,骨细胞和骨头的mechanosensory细胞。

EA已经成骨的属性和报道诱导人类成骨细胞在体外(45]。据说EA可以促进骨愈合骨手术后和骨折。然而,考虑osteoclastogenesis EA的抑制作用,据报道,EA抑制破骨细胞祖细胞分化由巨噬细胞集落刺激因子和RANKL刺激引起的在体外(34]。此外,没有报告验证与炎症相关的EA对骨吸收的影响在活的有机体内我们是第一个演示EA的抑制作用在LPS-induced osteoclastogenesis使用动物模型。

破骨细胞分化和活动是由RANKL和功能,主要由成骨细胞谱系细胞产生。在这项研究中,我们发现,EA抑制RANKL的生产,由有限合伙人,增强和恢复功能的生产由有限合伙人表达下调,使用牙周炎大鼠模型。特别是牙周韧带组织的功能表达E。杆菌有限合伙人/ EA组与对照组相比显著调节。功能是一种可溶性的分子调节强有力地抑制破骨细胞骨破坏。

由于功能表达式是由Wnt /β连环蛋白信号通路在成骨细胞(44),我们使用成骨细胞谱系细胞进行免疫印迹(ST2)调查的影响EA的上游信号RANKL和LPS引起的功能。

图6显示了一个示意图表示建议的机制EA抑制LPS osteoclastogenesis: LPS诱导IKK的激活α/β及其下游NF -κB通过TLR4、移植肿瘤坏死因子-αWnt / RANKL的表达,使其失去活性β功能的差别连环蛋白信号通路,导致对这些基因的表达。此外,分泌蛋白的生产Sema3A降低,抑制neuropilin-1-mediatedβ连环蛋白功能退化和核易位和抑制表达(图6(一))。相比之下,EA强烈抑制IKKα/β和NF -κB LPS刺激引起的激活,导致减少RANKL。

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图6
EA抑制破骨细胞形成的机理提出LPS所致。(一)LPS-induced牙周炎,TLR4-mediated磷酸化的我κB激酶α和β(IKKα/β)和NF -κB诱发炎性细胞因子的表达,如肿瘤坏死因子(TNF)α在牙周组织细胞和代osteoclastogenic受体激活剂NF -κB配体(RANKL),一个osteoclastogenic因素。然而,它可灭活Wnt /β连环蛋白信号通路和促进β连环蛋白退化。此外,生产的分泌蛋白质semaphorin 3 (Sema3A)却降低了;Sema3A / neuropilin-1 (Nrp1)介导的β连环蛋白降解和核易位被抑制,转录和表达的osteoprotegerin(功能),RANKL的诱饵受体。最后,RANKL /功能比增加,导致破骨细胞形成和成熟和随后的骨吸收。(b)提出EA-induced抑制机制由有限合伙人osteoclastogenesis: EA强烈抑制IKK的激活α/β和NF -κB,这表明Wnt /β连环蛋白信号通路被激活β连环蛋白降解是抑制。此外,Sema3A产量高,Sema3A / Nrp1-mediatedβ连环蛋白降解是镇压,和核迁移是晋升。这种抑制破骨细胞形成和过度的骨吸收。

而功能是调节通过激活Wnt /β连环蛋白信号通路,促进Sema3A / neuropilin-1-mediated核迁移β连环蛋白。因此,EA抑制破骨细胞形成和过度引起的骨吸收有限合伙人(图6 (b))。

多种促炎细胞因子增强破骨细胞分化和功能。例如,TNF -α促进破骨细胞祖细胞的增加在活的有机体内(30.- - - - - -33]。此外,il - 1α和β直接作用于破骨细胞没有RANKL延长生活和激活破骨细胞骨吸收(46]。炎性细胞因子也会影响骨形成。例如,TNF -α行为的抑制成骨细胞分化和生存方式;肿瘤坏死因子-α据报道,抑制胰岛素样生长因子1的生产,以起到增加成骨细胞祖细胞的数量(47],抑制runt-related转录因子2的转录,转录因子对成骨细胞分化[大师48]。此外,肿瘤坏死因子-α和il - 1β已报告作用于成骨细胞增加Fas表达和诱导细胞凋亡49]。以前,通过使用的老鼠模型LPS-induced牙周炎,我们证实了EA治疗显著降低immunoexpression TNF -α在联接的上皮细胞(29日]。在目前的研究中,评价利用成骨细胞谱系细胞证明了EA的强烈的抑制作用E。杆菌-LPS-induced炎性细胞因子(TNF -的生产α,il - 1β和il - 6)。这些发现表明,EA可能强烈抑制osteoclastogenesis功能恢复生产和抑制LPS引起的炎症细胞因子和RANKL的生产。

这些影响的EA可以归因于中包含的化合物大肠arvense。例如,槲皮素大肠arvense已被证明能够抑制形成、扩散和成熟破骨细胞的50,51]。据说Osteoblast-like细胞与槲皮素治疗功能显示增加趋势在生产和RANKL的显著下降52,53]。此外,槲皮素具有促进成熟破骨细胞凋亡的影响(50,54]。

在目前的研究中,我们专注于EA在骨破坏的抑制作用;然而,积极的效果也将在骨生成。当前的在体外研究表明,EA恢复Sema3A和差别LPS-induced对这些β连环蛋白,这是自我平衡地由成骨细胞谱系细胞。通过neuropilin-1 Sema3A抑制破骨细胞分化在破骨细胞祖细胞,也作用于成骨细胞,促进成骨细胞分化通过Wnt /β连环蛋白信号通路(55]。大肠arvense包含几个化合物报道促进成骨细胞的形成。中乌索酸大肠arvense它可以促进成骨细胞分化和矿化在体外(26]。此外,硅,丰富的大肠arvense促进钙和其他矿物质的沉积,减少破骨细胞的数量,刺激成骨细胞的活性,促进胶原蛋白的合成,促进粘多糖和胶原蛋白的合成,导致骨骼和结缔组织的形成28,56]。这些证据表明,在EA促进成骨细胞形成的化合物;因此,EA预计的效果不仅抑制破骨细胞的形成,而且促进成骨细胞的骨形成在活的有机体内。EA的成骨的活动应该在将来的研究中得到证实。

Antiresorptive和合成剂是有效的治疗监测病变;然而,一些副作用的报告。开出抗再吸收引起的下颌骨坏死的例如,anti-RANKL抗体和磷酸盐治疗已成为一个主要问题(57]。激素替代疗法可以属性增加静脉血栓栓塞的风险和心血管事件(58,59]。长期治疗期和高政府的重组人甲状旁腺激素(teriparatide)增加骨肿瘤的发病率60]。因此,EA等天然化合物具有强osteoprotective属性和一些副作用可能是另外一个策略来克服现有监测病变的治疗方法的缺点以及制定口腔护理方法,以防止牙槽骨的破坏与牙周炎有关。

5。结论

本研究的主要限制是使用E。杆菌有限合伙人的动物实验。虽然我们应该使用有限合伙人从牙周病原体,我们选择这个模型的建立时间进程牙周炎引起的组织学变化E。杆菌有限合伙人管理。E。杆菌有限合伙人是一个类型的Aggregatibacter actinomycetemcomitans有限合伙人,一个主要的牙周病原体;然而,EA的有限合伙人的影响牙周pathogen-induced牙周的变化在活的有机体内在未来的研究中应当明确。

这项研究表明,EA可以用于预防或治疗牙周疾病和其他bone-destroying病变。考虑到临床应用,日常使用的牙膏和漱口水含有EA可以抑制牙槽骨吸收与牙周口袋和抑制牙菌斑堆积有关流动性和牙齿脱落归因于牙周炎,最终导致一辈子维护健康的牙齿。

数据可用性

所有数据可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。

确认

作者要感谢一Takahata, Erina Terao,和Takuto Uramoto,研发总部,地球公司,有限公司,为他们贡献的人物6。这项工作是财务支持地球公司和广岛大学的支持。