抗衰老因子的Klotho延缓椎间盘退变的通过Toll样受体4 NF-进展κB通路

摘要

抗衰老蛋白Klotho细胞具有抗发炎的特性让人印象深刻，但在椎间盘损伤后早期下降，使得Klotho细胞修复治疗椎间盘炎症性疾病的有吸引力的策略。在这里，我们已经发现的Klotho在髓核富集的（NP）细胞和过度表达的Klotho衰减ħ_2个O型_2个基本上通过抑制Toll样受体4（TLR4）诱导的急性炎症。促炎症NF-κB信号和细胞因子的表达与Klotho抑制和TLR4的升高平行(H_2个O型_2个处理）和大鼠椎间盘（穿刺治疗）。TLR4的过表达下调的Klotho的表达，而干扰TLR4表达减弱H的抑制作用_2个O型_2个在NP细胞中的Klotho。在椎间盘退变(IDD)模型中，RNA干扰导致的Klotho基因表达的降低在很大程度上减弱了抗炎和椎间盘保护作用。因此，我们的研究表明TLR4-NF-κB信号与Klotho在NP细胞中形成负反馈环。此外，我们还证明，Klotho的表达受TLR4-NF上调和下调之间的平衡调节-κ乙信令。

1.介绍

椎间盘退变是腰椎间盘突出症的主要原因。腰椎间盘是人体最重的部位。一般认为椎间盘在20岁以后开始退变，但现在进一步证实退变开始于15岁。细胞核的含水量逐渐下降。椎间盘的弹性和抗负荷能力减弱。近期研究发现，一系列炎症因子参与了IDD过程，与IDD的发生发展密切相关[1个–三]。然而，各种炎症因子参与了IDD的作用和分子机制尚未完全明确。

椎间盘由中央髓核、外纤维环和上下端终板组成。其主要功能是维持脊柱的正常结构和承受脊柱的生物应力。NP组织中含有大量的水和蛋白多糖，是椎间盘生理功能和应激的必要前提。在椎间盘细胞胚胎发生过程中，NP细胞在组织形成中起关键作用，可能直接参与髓核的发育。在某些物种中，如人类，NP细胞最终可能会丢失并被软骨细胞样细胞所取代，直到椎间盘完全由纤维构成[4个,5个]。因此，老化是椎间盘退变的危险因素之一。

Klotho是一种新发现的抗衰老基因。Klotho缺失可导致哺乳动物多种衰老样表型[6个,7个]. 相反，在Klotho-/-小鼠中过表达Klotho可延长其寿命[八]。Klotho是一种富含肾脏的蛋白质，在矿物质代谢和保护肾脏方面起着关键作用[7个,9个–11]。它还在心脏，脑，和甲状旁腺[表达12–14]. Klotho基因编码单个跨膜蛋白和分泌蛋白，通过影响多个细胞膜受体和转运蛋白以及相关的信号通路，如老化、炎症、凋亡、氧化应激，促进多种细胞过程的调节，人类Klotho基因多态性与衰老时的病理生理性骨丢失有关[15、脊柱疾病[16]，骨钙蛋白水平[15]，和骨矿物质密度[17]. 此外，Klotho蛋白在椎间盘的表达也有报道。但其在椎间盘特异性作用的分子机制尚不清楚。

炎症因子是一类参与由细胞和体液，从而起到椎间盘的变性主要作用产生的炎性反应的物质。他们参与和推动国际长途的进展[18]. 研究表明，退变椎间盘组织中炎性因子的表达水平明显高于正常椎间盘组织，且炎性因子的表达水平与椎间盘退变程度呈正相关[19]. 白细胞介素-1β（IL-1）β），肿瘤坏死因子α（TNFα)退变椎间盘组织中可检测到前列腺素E2（PGE2）等炎症因子[20,21]。这些炎性细胞因子是导致椎间盘组织的炎性反应的主要因素，并在IDD [的过程中发挥了重要的作用22]。因此，本研究的目的是双重的：确定在髓核细胞的Klotho表达，并确定椎间盘退变期间的Klotho表达和炎性反应之间的关系。这些研究将提供新的见解治疗IDD与Klotho细胞靶向炎症因子。

2。材料和方法

2.1。IDD动物研究

所有的动物和实验过程与大学指南批准进行，并经西京医院的机构动物管理委员会（IACUC）（2018007）的批准。12周龄的只SD雄性大鼠从西京医院动物模型研究中心购买，并在无特定病原（SPF）与标准温度条件下放置（ ）湿度（50-60%）和光照条件（12小时光/暗循环）。采用先前研究的大鼠IDD模型[23]. 大鼠被分为两组( 在每个基团）：（1）假手术组：无处理;（2）IDD组：针穿刺。用于siRNA在体内研究中，大鼠的小干扰RNA（siRNA）的Klotho被采用，其靶向ATATT TATTG TAGAA AATGG。对照siRNA包含加扰的RNA序列。A single dose of siRNA (10 nm in 200 μPBS）的升通过尾静脉注射，每周两次之前和期间IDD（施加到每个大鼠1天IDD操作之前，然后进行到IDD模型 在每组中）。实验结束后，用一氧化碳处死大鼠_2个吸入，大鼠尾盘被手术取出并保存在-80℃以作进一步分析。

2.2。NP细胞的分离

总体而言，用于该研究20 12周龄SD雄性大鼠。NP细胞通过使用报道的方法[分离24]. 总之，大鼠注射过量的戊巴比妥钠后被安乐死。在无菌条件下分离尾盘。用显微镜痰将凝胶状NP组织完全取出，置于含PBS的培养皿中。组织被切成 blocks by ophthalmic scissors, and the tissue suspension was collected and centrifuged at 1000 rpm for 5 min. The pellet were placed in 2 volumes of 0.1% type II collagen and shaken at 37°C for 4 h, then collected the cell suspension, centrifuged at 1000 rpm for 5 min, discarded the supernatant, and finally resuspended in complete medium (containing 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin in DMEM/F12 medium). The cells were counted, inoculated in a 25 cm^2个于饱和湿度培养箱(37℃，5% CO .)中培养_2个). 4天后，第一次更换液体。将细胞传代90%融合，以1∶2的比例接种到新的培养瓶中。分别记录贴壁时间和细胞生长至90%融合的时间。由于从大鼠椎间盘组织获得的细胞在形态上是可变的，直到传代2-3，我们使用传代（<3）细胞在单层培养进行所有实验。

2.3。免疫荧光染色

After NP cells were cultured on cover slips and treated, 4% PFA (paraformaldehyde) fixed at room temperature for 30 min, 洗涤3次，每次5 min，0.1%Triton X-100（稀释 )透明10分钟， washed 3 times for 5 min each time, 5% BSA blocked at 37°C for 1 h, primary antibody (diluted with 5% BSA) incubated at 4°C overnight, washed 3 times for 5 min each time, secondary antibody (diluted with 5% BSA) incubated at 37°C for 1 h free to light, washed 5 times for 5 min each time, DAPI (1 μg/ml）孵育5 min，和 每次洗5次，每次5 分钟。最后，通过共焦显微镜（日本奥林巴斯）收集图像。

2.4。组织学研究

准备椎间盘切片，切片（4 μm） 苏木精-伊红染色。组织学标本由实验室观察者盲选。正常椎间盘AF胶原片组织良好，NP细胞分布均匀。损伤后，NP的大小随着核细胞被密集的蛋白多糖基质聚集和分离而减小，胶原层变得紊乱。每只动物随机抽取10块田地进行检查。

2.5。逆转录PCR（RT-PCR）和定量实时PCR（定量RT-PCR）

总RNA通过使用TRIzol试剂RNA分离方案（Invitrogen）从大鼠髓核细胞或组织中提取。将cDNA用FastKing RT试剂盒（具有gDNase）（Qiagen）进行合成。RT-PCR和定量RT-PCR通过使用一个SuperReal预混合物Plus试剂盒（SYBR绿）（Qiagen公司）进行。所有的引物由宝生物株式会社（日本东京）合成。IL-1β: F-CACCT CTCAA GCAGA GCACA G, R-GGGTT CCATG CCATG GTGAA GTCAA C;NOS2: F-GACCA GAAAC TGTCT CACCT G, R-CGAAC ATCGA ACGTC TCACA;IL-18: F-ATATC GACCG AACAG CCAAC, R-TTCCA TCCTT CACAG ATAGG G;GAPDH: F-GGCAC AGTCA AGGCT GAGAA TG, R-ATGGT GGTGA AGACG CCAGT

2.6。质粒构建、过表达和敲除

HA标记的小鼠的Klotho（pUSEHA）和myc标记的TLR4（的pCDNA3.1）表达质粒从髓核细胞的mRNA，通过RT-PCR构建。所用的引物组cKlotho-F：TAAGC GGCCGÇCATG CCAGC CCGCG cccccct和cKlotho-R:CGCTC堵头TT ATTTA TAACG TCTCC GGCCT；cTLR4-F:CGGGA TCCAT GATGC CTCTC TTGCA TCTGG和cTLR4-R：GGGGT账户TC AGGTC AAAGT TGTTG CTTCT（限制性内切酶位点加下划线）。被用于在GV102载体的BamHI和HindIII位点构建shRNA的质粒的引物组的shRNA-TLR4。引物序列如下：F-GATCC CGGCA TAGAG GTACT TCCTA ATATT CAAGA GATAT TAGGA AGTAC CTCTA TGCTT TTTTG GAAA;R-AGCTT TTCCT AAAAA AGCAT AGAGG TACTT CCTAA TATCT CTTGA ATATT AGGAA GTACC TCTAT GCCGG。所有的引物由宝生物株式会社（日本东京）合成。

2.7。免疫印迹分析

2.7.1。从细胞与组织总蛋白提取

In brief, add 1 ml of lysate plus 10 μ在细胞和组织中溶解100 mM的PMSF，溶解30 min;用移液管将裂解液转移到1.5 ml离心管中，4℃下，12000 rpm离心5 min，上清置于0.5 ml离心管中，-20℃离心。30到60μ蛋白质/泳道的克通过使用10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（Bio-Rad公司，赫拉克勒斯，CA，USA）进行电泳。该解决蛋白质电泳转移到硝酸纤维素膜“印迹”。The blots were blocked with 5% BSA in TBST (50 mM Tris, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20) and incubated overnight at 4°C in 5% BSA in TBST with anti-Klotho (1 : 1,000; Cell Signaling), anti-TLR4 (1 : 1,000; Abcam), and anti-NF-KB (1 : 1,000; Cell Signaling). Immunolabeling was detected with electrochemiluminescence reagent (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Quantification of Western blots was performed by using ImageJ pixel analysis (NIH Image software). Data from Western blots are presented as band density normalized to the loading control (actin).

2.8。转染

简而言之，准备细胞：接种 髓核细胞在500 μl of complete medium without antidouble antibody 24 h before transfection, the cell fusion degree was 80-90% when transfected (note: when planting the plate, thoroughly digest the cells to avoid cell accumulation). For each transfection sample, prepare the following: dilute 0.8 μ克质粒DNA用50 μl Opti MEM，轻轻移液3-5次，室温下静置5 min，轻轻倒置，混合转染试剂，稀释2.0 μ脂质体2000（Invitrogen）中与50的升 μl Opti MEM，轻轻吸出3-5次，室温下静置5 min；将转染试剂与质粒DNA稀释液混合，静置3-5次，室温下静置20 min（注：一旦形成转染复合物，应立即加入培养皿中进行细胞转染）将转染复合物加入24孔细胞板中，在100 处μl/嗯，牢房板在前后都被轻轻摇晃;将细胞板置于37℃5% CO中_2个培养箱培养约6 h，更换培养基，用含10%血清的普通培养基代替，在37℃、5% CO条件下继续培养24 h_2个孵化器。要检查的转染效率，髓核细胞用编码绿色荧光蛋白质粒转染;用于髓核细胞的转染效率为60％〜70％。此外，该目标的过表达或沉默效率在mRNA水平或蛋白质水平证实。

2.9。统计分析

通常，数据是从至少三个独立的三联实验中收集的，每个实验在不同的培养基和不同的场合进行。数据显示为 （标准差）。两组之间的数据比较通过使用方差估计的检验或方差分析。 要么 被认为是统计显著或非常显著。

3.结果

3.1。减少的Klotho的表达和TLR4-NF-κB的激活κb信号的退行性变椎间盘

了解Klotho和TLR4-NF的联系-κB信号转导在退行性椎间盘疾病中的作用，我们采用了IDD大鼠模型。针刺大鼠2周，椎间盘损伤严重。正常椎间盘AF胶原片组织良好，NP细胞分布均匀。损伤后，NP的大小随着核细胞的聚集和蛋白多糖基质的密集区域的分离而减小，胶原层变得杂乱无章（图1（甲））。所述Klotho蛋白质和mRNA的两者的表达降低（图1（b）和1（c）). 小时owever, the expression of TLR4 and p-Iκ乙α升高时，伴随着我κ乙α白细胞介素-1的蛋白还原和高炎症细胞因子诱导β、NOS2和IL-18（图1（d）). 提示Klotho表达降低，TLR4-NF活化-κ乙退行性椎间盘的信令。

3.2条。H降低NP细胞Klotho表达_2个O型_2个

收集原始NP细胞，分别用SOX9、型胶原蛋白和Aggrecan染色，结果证实99%以上的细胞为NP细胞(图2)2（甲））。Klotho的在肾脏中表达据报道，小鼠巨噬细胞RAW264.7（RAW）[25]。我们检测在大鼠NP细胞Klotho蛋白质（图图2（b）），这意味着Klotho细胞可能直接调节椎间盘局部和全身性炎症过程。NP细胞中表达的Klotho蛋白质和mRNA，而ħ_2个O型_2个治疗剂量依赖性地降低其丰度并伴有明显的TLR4蛋白升高（图图2（c））。此外，H_2个O型_2个剂量依赖性地升高的IL-1的表达β、NOS2和IL-18（图图2（d）)，表示H_2个O型_2个Klotho细胞的下调可能涉及其TLR4的仰角和炎性细胞因子表达的NP细胞。

3.3条。TLR4-NF对Klotho的调节作用-κB信号在NP细胞中

为了探讨Klotho以及TLR4-NF-的电势校κ在NP小区B信令，我们评估了TLR4收益或损失是否影响的Klotho表达。结果表明，^ h_2个O型_2个诱导TLR4积累与TLR4-NF-κB信号激活，但Klotho在NP细胞中的表达减弱（图图3（a）). myc标记的TLR4在NP细胞中的过度表达下调了Klotho的表达（图图3（b））。相反，具有小的发夹RNA（shRNA）特异于TLR4染的髓核细胞减少上的Klotho（图的抑制作用3（c））。这些表明，Klotho细胞是由TLR4-NF-调节κB信号在NP细胞中。

3.4。在TLR4-NF-的Klotho细胞抑制κB信号在NP细胞中

确定Klotho在TLR4-NF抑制中的关键作用-κ炎症信号，Klotho过表达对TLR4-NF抑制的影响-κ乙信令和炎性细胞因子的表达进行了研究。在NP细胞的Klotho表达消除ħ_2个O型_2个-诱导TLR4积累与Iκ乙α降解（图4（甲））和废止NF-κB核移位（图4（b）). 小时_2个O型_2个IL-1诱导的促炎细胞因子表达β在高表达Klotho的细胞中，NOS2和IL-18也被显著地抑制（图4（c）)，说明Klotho有效地抑制了TLR4-NF-κB信号在NP细胞中。

3.5。在退变椎间盘Klotho细胞的功能作用

进一步考虑在体内的Klotho的相关性，的Klotho敲除的小干扰RNA（siRNA）在抗炎和在IDD的大鼠模型椎间盘保护的影响进行测试，如图5个. 分别注射siRNA对照组和siRNA-Klotho，给大鼠NP治疗2周，观察大鼠椎间盘病理生理变化和炎性细胞因子表达。根据AF和NP细胞判断，Klotho基因敲除明显增加了椎间盘损伤（图图5（a）），TLR4和对我κ乙α积累，我κ乙α减少（数字图5（b）)，增强IL-1的表达β、NOS2和IL-18（图图5（c）). 因此，Klotho修复不仅可以抑制TLR4信号和相关细胞炎症反应，还可以减轻椎间盘损伤。

4.讨论

在这项研究中，我们提出在本研究中新发现：TLR4-NF-κB信号和Klotho在NP细胞中形成负反馈环，其表达受TLR4-NF上调和下调的平衡调节-κB信号（图6个). 因此，我们的研究结果阐述了一种新的作用方式，通过这种方式，Klotho可以集中发挥其抗炎活性，这可能对其椎间盘和肾外保护功能有重要贡献。

我们通过观察Klotho蛋白在椎间盘退变过程中的表达变化，探讨了椎间盘退变的分子机制。一些研究表明，Klotho在心脏、主动脉、肾脏、大脑、肺、肝脏、胰腺、脾脏、骨骼肌和脂肪组织中均有表达[26–28]. 然而，一项研究表明，Klotho蛋白在椎间盘有表达[29]。

IDD的病理生理机制仍不清楚。近年来，巨大的努力已经作出的IDD的病理生理机制的研究。它认为，病理生理机制主要包括以下病理生理学过程：减少细胞外基质的合成，增加了分解细胞外基质的酶的分泌，增加细胞衰老和凋亡，以及由神经和血管[侵入椎间盘组织1个]。炎症因素密切相关的这些过程。以前的研究已经表明，Klotho的抑制TNF的上调α-诱导细胞间黏附分子和血管细胞黏附分子与NF的激活-κB，其直接抵抗促炎细胞因子的炎症反应的影响[三十]。此外，Liu等发现细胞内Klotho与衰老细胞中视黄酸诱导的基因1相互作用，抑制视黄酸诱导的基因1诱导的白细胞介素6 (IL-6)和IL-8的表达，证实Klotho抑制衰老相关的炎症反应[31]. 之后，我们研究了炎症信号与Klotho的关系。最后，我们研究了Klotho对IDD的保护作用。

很显然，椎间盘的退变随着年龄的增加而增加。我们推测Klotho蛋白质维持在正常椎间盘NP动态平衡。出乎意料的是，我们发现，在表达的Klotho在NP细胞减少由炎症信号的激活椎间盘变性期间引起。如已知的，Klotho蛋白质由三个部分组成：细胞外结构域，跨膜结构域，和细胞内结构域。膜的Klotho充当调节磷排泄在活性维生素d的肾脏和合成的受体[32,33]。分泌的Klotho调节多种生长因子的活性11〔34]。Doi等报道了分泌的Klotho抑制TGF-β1通过与细胞表面上直接结合至II型TGF-β受体（TGFBR2）和TGF-β防止信令β从1与受体结合的[35]。TGF-ββ1是NP细胞中最有效的基质诱导因子。Kuro-o发现Klotho可以直接调节内分泌FGF家族[36]。因此，Klotho细胞的髓核细胞中的作用可能有许多不同的结果。未来的研究将集中在人样品，以确定的Wnt信号传导，以确定细胞生长和基质合成的Klotho的调节是否是特异性的NP细胞中的作用。此外，有必要检查的Klotho是否影响髓核细胞多个信号通路，包括可能涉及椎间盘退变TGF，FGF，或MMP家族的活性的活性。

5。结论

我们研究了Klotho在椎间盘和NP细胞中的表达，阐明了Klotho与炎症信号的相互作用，炎症信号是椎间盘退变的潜在诱因。我们证实了Klotho与TLR4-NF-的相互拮抗作用κB制备髓核炎症模型，发现炎症途径。这些实验有力地表明炎症信号的激活抑制了NP细胞中Klotho蛋白的表达。相反，增加Klotho的表达抑制NP细胞的炎症信号。这些结果可能支持Klotho不仅仅是TLR4-NF的拮抗剂-κB炎性信号传导及TLR4-NF-κB信号与Klotho在NP细胞中形成负反馈环。为了阐明椎间盘退变的机制，需要进一步的研究来确定不同炎症信号通路上的哪些分子与Klotho相互作用来调节髓核细胞生长和基质合成。

数据可用性

在这项研究中产生的或分析所有的数据都包括在此发表的文章。

利益冲突

作者声明，这篇论文的发表没有利益冲突。

作者的贡献

作者方方毕，文博刘和宗陶武同等贡献这项工作。

致谢

这项研究是由西京医院（2018XJ-010）和陕西省自然科学基础研究发展计划（计划号2018JM7140）的发展资金支持。

参考

1. C. K.开普勒，R. K. Ponnappan，C. A. Tannoury，M. V. Risbud和D. G.安德森，“椎间盘退变的分子基础”，脊柱杂志卷。13，没有。3，第318-330，2013。查看位置：出版商网站|谷歌学者
2. S、 王俊丽，田俊杰等，“高幅低频循环机械应变通过核因子促进人髓核细胞变性-κB p65通道细胞生理学杂志卷。233，没有。9，第7206-7216，2018。查看位置：出版商网站|谷歌学者
3. H、 江，陈，陈，等，“瘦素通过mTORC1信号促进大鼠肌腱组织异位骨化的发生”细胞生理学杂志卷。233，没有。2，第一○一七年至1028年，2018。查看位置：出版商网站|谷歌学者
4. R、 沃尔姆斯利，“椎间盘的发育和生长，”爱丁堡医学杂志卷。60，没有。8，第341-364，1953。查看位置：谷歌学者
5. W、 M.Erwin和R.D.Inman，“脊索细胞调节椎间盘软骨细胞蛋白多糖的产生和细胞增殖，”脊柱卷。31，没有。10，第1094至1099年，2006年。查看位置：出版商网站|谷歌学者
6. M.九郎邻，Y.松村，H. Aizawa等人，“鼠标_klotho_基因导致的综合征类似于老化的突变，”性质，第390卷，不。6655页，45-51页，1997。查看位置：出版商网站|谷歌学者
7. P. U.托雷斯，D. PRIE，V.莫利纳-Bletry，L.贝克C.西尔夫，和G.弗里德兰德，“Klotho的：参与矿物质和维生素d代谢抗衰老蛋白”，肾脏国际卷。71，没有。8，第730-737，2007。查看位置：出版商网站|谷歌学者
8. T.山下，A. Nifuji，K.古屋，Y.锅岛，和M.野田，“在转基因小鼠携带的Klotho基因座突变导致的综合征类似于老化骺骨小梁的伸长率，”在中华内分泌的卷。159，没有。1，第1-8页，1998年。查看位置：出版商网站|谷歌学者
9. Y.王和Z.太阳报“的Klotho基因传递阻止自发性高血压和肾功能损害的进展，”高血压，第54卷，第4期，第810-8172009页。查看位置：出版商网站|谷歌学者
10. 张，刘，林等人，“大黄酸通过启动子去甲基化逆转klotho抑制作用，并保护患有慢性肾病的小鼠的肾脏和骨骼免受伤害，”肾脏国际，第91卷，第1期，第144-156页，2017年。查看位置：出版商网站|谷歌学者
11. 张，尹，刘，刘，曹，“大黄逆转DNA高甲基化相关的klotho抑制改善小鼠肾纤维化，”科学报告卷。6，没有。1，文章34597年，2016年。查看位置：出版商网站|谷歌学者
12. 十，旷，Y. S.陈，L. F. Wang等人，“Klotho的上调有助于阿尔茨海默氏症小鼠模型中藁本内酯的神经保护”衰老神经生物学卷。35，没有。1，第169-178，2014。查看位置：出版商网站|谷歌学者
13. N、 Tangri，A.Alam，E.C.Wooten和G.S.Huggins，“白种人Klotho基因变异与瓣膜和血管钙化缺乏关联：弗雷明翰后代队列的候选基因研究，”肾病，透析，移植卷。26，没有。12，第3998-4002，2011。查看位置：出版商网站|谷歌学者
14. H. S.于，J. J.金，H. W.金，M. P.刘易斯和I.墙“对骨和周围组织的细胞行为的机械拉伸的影响，”组织工程杂志卷。7年，2016年。查看位置：出版商网站|谷歌学者
15. K.河野，N.绪方，M. Chiano等人，“带有陈年绝经后妇女的骨密度相关联的Klotho基因多态性，”中国骨与矿物质研究的，第17卷，第10期，第1744-17512002页。查看位置：出版商网站|谷歌学者
16. N.绪方，Y.松村，M. Shiraki等人，“协会klotho基因绝经后妇女腰椎骨密度和脊椎病的基因多态性，”骨头卷。31，没有。1，第37-42页，2002年。查看位置：出版商网站|谷歌学者
17. Y、 Yamada，F.Ando，N.Niino和H.Shimokata，“日本女性中雄激素受体和klotho基因多态性与骨密度的关系，”[分子医学卷。83，没有。1，第50-57，2005。查看位置：出版商网站|谷歌学者
18. M、 Monchaux，S.Forterre，D.Spreng，A.Karol，F.Forterre和K.Wuertz Kozak，“与犬椎间盘突出症相关的炎症过程”免疫学前沿卷。8，文章1681年，2017年。查看位置：出版商网站|谷歌学者
19. K、 L.Phillips，N.Jordan Mahy，M.J.Nicklin和C.L.Le Maitre，“白细胞介素-1受体拮抗剂缺乏小鼠为人类椎间盘退变的发病机制提供了见解，”风湿病学年鉴，第72卷，第11期，第1860-1867页，2013年。查看位置：出版商网站|谷歌学者
20. K. T.韦伯，D. O.阿利普伊，C.P。西逊等人的“促炎细胞因子白细胞介素6的血清水平变化基于与腰椎间盘疾病的个体的诊断，”关节炎研究和疗法，第18卷第2期。1、2016年第3页。查看位置：出版商网站|谷歌学者
21. J、 J.Park，H.J.Moon，J.H.Park，T.H.Kwon，Y.K.Park和J.H.Kim，“巨噬细胞样THP-1细胞诱导椎间盘细胞产生促炎性细胞因子需要丝裂原活化蛋白激酶活性。”中华神经外科杂志。脊柱卷。24，没有。1，第167-175，2016。查看位置：出版商网站|谷歌学者
22. M.太阳，R.D。贝迪，D.K。Wright等人，“治疗白细胞介素1受体拮抗剂减轻神经炎症和多发伤后的脑损伤，”大脑，行为与免疫卷。66，第359-371，2017。查看位置：出版商网站|谷歌学者
23. D、 陈，夏，潘，等，“二甲双胍对髓核细胞凋亡和衰老的保护作用及对椎间盘退变的改善作用”体内,”细胞死亡和疾病卷。7，没有。10，文章e2441年，2016年。查看位置：出版商网站|谷歌学者
24. J、 Liu，J.Wang，和Y.Zhou，“营养剥夺诱导髓核细胞凋亡时BNIP3的上调和向线粒体的转运”关节，骨骼，脊柱卷。79，没有。2，第186-191，2012。查看位置：出版商网站|谷歌学者
25. F.碧，陈楼，Y.李，魏A.，和W.曹，“Klotho细胞保存由莱茵促进Toll样受体4蛋白水解和衰减脂多糖诱导的急性肾损伤，”[分子医学，第96卷，第9期，第915-927页，2018年。查看位置：出版商网站|谷歌学者
26. “klotho蛋白在小鼠大脑、肾脏和生殖器官的免疫组织化学定位”细胞结构与功能卷。29，没有。4，第91-99，2004。查看位置：出版商网站|谷歌学者
27. I. Z.奔多夫，H. Galitzer，V. Lavi的-Moshayoff等人，“甲状旁腺是用于在大鼠中的FGF23靶器官，”临床研究杂志2007年，第117卷，第12期，第4003-4008页。查看位置：出版商网站|谷歌学者
28. M. C.胡，M.施，J. Zhang等人，“Klotho的：作为在肾近端小管的自分泌酶的新颖phosphaturic物质，”实验生物学联合会会刊，第24卷，第9期，第3438-3450页，2010年。查看位置：出版商网站|谷歌学者
29. A.桧山，F.新井，D.酒井，K.横山和J.持田，“氧张力和抗衰老因子的影响Klotho细胞关于髓核细胞Wnt信号转导的研究，”关节炎研究和疗法，第14卷，第3期，第R105条，2012年。查看位置：出版商网站|谷歌学者
30. Y.前川，K.石川，O. Yasuda等人，“Klotho的禁止显示TNF-α-内皮细胞粘附分子的诱导表达及NF的抑制-κB启动，”内分泌卷。35，没有。3，第341-346，2009。查看位置：出版商网站|谷歌学者
31. F.刘，吴S.，H仁和J.顾炎武“的Klotho禁止显示RIG-I介导的衰老相关的炎症，”自然细胞生物学，第13卷，第3期，第254-262页，2011年。查看位置：出版商网站|谷歌学者
32. H.黑须，Y.小川，M. Miyoshi等人，“成纤维细胞生长因子23的Klotho信号的调节，”生物化学杂志卷。281，没有。10，第6120-6123，2006年。查看位置：出版商网站|谷歌学者
33. M、 Kuro-o，“Klotho作为成纤维细胞生长因子信号和磷酸盐/钙代谢的调节因子”肾脏病与高血压卷。15，没有。4，第437-441，2006年。查看位置：出版商网站|谷歌学者
34. A、 Hiyama，D.Sakai，M.Tanaka等人，“Wnt之间的关系/β连环和TGF-ββ/椎间盘细胞中的BMP信号，”细胞生理学杂志卷。226，没有。5，第1139至1148年，2011。查看位置：出版商网站|谷歌学者
35. S.土井，Y.邹，O. Togao等人，“Klotho的抑制转化生长因子β1（TGF-β1） 对小鼠肾纤维化和肿瘤转移的信号传导和抑制作用，”生物化学杂志，第286卷，不10、2011年第8655-8665页。查看位置：出版商网站|谷歌学者
36. M.九郎-O，“内分泌FGF和klothos：新兴的概念，”内分泌学和新陈代谢趋势卷。19，没有。7，第239-245，2008。查看位置：出版商网站|谷歌学者

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