抑制TGF -β1信号由IL-15：IL-15 TGF-抵消：在肾小管上皮 - 间质转化的控制中的新作用对IL-15β1诱导的肾纤维化的EMT

抽象

肾间质纤维化是终末期肾脏疾病的最终共同途径，其特征是通过肌成纤维细胞分泌的细胞外基质（ECM）成分的异常积累。管状2型EMT，由TGF-β诱导的β，起着肾脏纤维化的重要作用，在肌纤维母细胞产生直接或间接的参与。TGF-ββ1诱导的细胞凋亡和纤维化实验性慢性鼠肾脏疾病伴随有肾内相关的IL-15的存活因子的表达下降。由于IL-15 TGF-反作用β在不同的细胞模型中，我们分析了(1)人类慢性炎症性肾病向纤维化发展是否也可表现为肾内IL-15表达减弱，(2)IL-15可抑制人肾近端小管上皮细胞上皮间充质转化(EMT)和过量基质沉积(RPTEC)。我们的数据显示，不同的人类慢性肾脏疾病的特点是肾内IL-15的表达强烈下降，这在糖尿病肾病中尤为相关，其中2型肾小管EMT在纤维化中发挥重要作用。此外，缺乏生长补充物的原代上皮小管培养物可迅速产生活性TGF-β1诱导“自发” EMT过程，其特征在于膜结合IL-15（mbIL-15）表达的损失。两个“自发” EMT和重组人（rh）TGF-β用rhIL-15处理RPTEC和HK2细胞可以抑制1诱导的EMT模型。通过持久的磷酸化c-jun激活，IL-15抑制rhTGF-β1诱导表达SNAIL1，EMT的主诱导剂，和块TGF-β1诱导的EMT管状和下游胶原蛋白合成。总之，我们的数据表明，肾内IL-15可能是TGF-β的天然抑制剂β在人类肾能保证上皮细胞内环境稳定和防止EMT过程。因此，无论是体内和体外在肾内IL-15和TGF-β的不平衡β1个水平可能使RPTEC细胞更易于经历EMT过程。外源IL-15的治疗可以在某些人类肾病如糖尿病肾病是有益的。

1.简介

上皮 - 间充质转换（EMT）是发生在正常发展和病理设置，其中上皮细胞失去上皮性质和增益间充质特性[关键的工艺1]。EMT被分为三种类型。1型EMT与胚胎发生相关联，并且正常器官作为中间步骤领先，通过间充质上皮转化（MET）过程中发生，以更成熟的上皮细胞的产生。2型EMT与组织修复响应从上皮到在实质器官修复受损组织产生肌纤维母细胞相关联;然而，赔偿性过程可以退化成纤维化2]。3型EMT涉及恶性肿瘤，其中肿瘤细胞获得的表型洄游侵入周围组织并有利于转移过程[2]。

肾间质纤维化是慢性炎症过程的最终结果在不同细胞之间的相互作用的组件和一个复杂的网络信号通路导致肾myofibroblasts负责发展的过度积累的细胞外基质(ECM)成分,主要和常见的标志不同的慢性肾脏疾病(CKD) [3]。然而，肌成纤维细胞的来源，这可以从肾上皮/内皮细胞，成纤维细胞间质细胞，或间充质周细胞派生，仍然是有争议的辩论的主题[4-8]。结果已发生冲突，或者分配的重要或具有可忽略的作用，管型肌成纤维细胞第2代EMT [9-12]，其介入然而仅限于糖尿病肾病（DN）[13-15]。在这方面，最近的一项研究调和上EMT的角色冲突数据，显示出部分和可逆的管状EMT，通过SNAIL1活化诱导的，继电器信号到间质从肾或肾外来源的细胞促进成肌纤维细胞的分化，证实了新的角色EMT在肾纤维化的16]。此外,TGF -βTWIST1或SNAIL1的1诱导的表达诱导的局部EMT，导致G2停滞肾小管上皮细胞的，限制了它们的潜在的修复和再生[11]。

2型EMT是由多种可溶性因子触发。最纤维化之一是肾内TGF-ββ1，其生产的肾细胞已被链接到发展的不同肾病，膜质肾病，和其他慢性肾脏疾病〔17]。TGF-ββ1通过任Smad蛋白或非的Smad途径和诱导培养的肾上皮细胞的采集与肌纤维母细胞标记物和上皮所丢失的多个[表达相关的纺锤形的形态发挥其效果18]。

在另一方面，参与肾脏修复和再生大量的内源性抗纤维化因素已被确定。这些稳压器特别形态发生蛋白7（BMP-7）和肝细胞生长因子（HGF）禁止特别管状EMT与TGF-β的干扰β1-信令。然而，这两种因子的表达据报道，在慢性肾损伤中下调[4，19]。抗纤维化治疗的重要策略是增加或恢复病变的肾脏纤维化的因子的表达。

此外，根据最近的研究，似乎更多的因素在EMT的调控中发挥的作用，表示难以理解这一复杂的过程[14]。在这种情况下，因此，可能的额外因素肾内调节功能被低估，如白细胞介素-15（IL-15），其作用，通过自分泌环，作为一个强大的存活[20，21]和稳态因子[22，23对于肾上皮细胞。事实上，在IL-15实验 - / - 和IL-15Rα- / - 小鼠显示，肾内IL-15，本既作为分泌的和膜结合，形式（mbIL-15）通过IL-15R锚定α连锁保护肾上皮细胞，对抗细胞凋亡和肾炎时的炎症反应[20，21]。此外，在几个实验鼠肾病有肾内IL-15，其病理胁迫期间是有害的肾细胞存活和肾功能的一个尖锐的和快速降低[20，21]。另一方面，我们最近的数据显示，IL-15诱导CD105+肾癌干细胞分化为上皮细胞，由于获得了自身的IL-15，这些上皮细胞与正常肾小管细胞具有一些共同的特性[24]。基于这些数据，肾内IL-15似乎是上皮内稳态的强有力的内源性因子。此外，IL-15能够在除了抵消TGF-β1个信号和在不同的细胞模型的效果[25-29]。

在该手稿，我们探索在不同人炎性肾病朝向肾纤维化演变肾内IL-15的表达和观察到的表达的重要下降，如图鼠模型[20，21]。此外，我们还表明重组人IL-15（白细胞介素 - 15）以抵消TGF-容量β1诱导的2型EMT在两种经典的人类细胞模型：HK2，永生化近端小管上皮细胞系的初级近端肾小管上皮细胞（RPTEC）的和文化。的rhIL-15治疗减弱TGF-ββRPTEC和HK2细胞1诱导EMT均干扰TGF-β1个信令。

这些数据提示(i)肾内IL-15可以作为TGF-的天然抑制剂β1和（ii）外源性IL-15治疗对某些人类肾病如糖尿病肾病可能是有益的。

2.方法

2.1。公共转录组数据集

2.1.1。移植背景下的人类肾脏转录组

转录组矩阵(Transcriptome matrix, GSE1563)经软件MAS 5.0归一化后，在基因表达综合(Gene Expression Omnibus, GEO)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)和注释用GEO平台GPL8300对应的Affymetrix人类基因组U95版2号数组技术。将无临床排斥反应(n=10)的移植患者的肾组织与有肾功能障碍的移植患者的肾组织进行比较(n=5) [三十]。

2.1.2。肾脏肾小管间质转录在人类肾病的语境

在GEO数据库上下载RMA算法归一化的转录组矩阵(GSE47184)，使用与Affymetrix GeneChip Human Genome HG-U133A技术相对应的GEO平台GPL14663进行注释。将来自对照组(n=4)的肾小管间质与来自不同肾病的相同组织进行比较，如糖尿病肾病(n=11)、微小改变病(n=10)、薄膜病(n=6)、局灶性和节段性肾小球硬化(n=10)、高血压肾病(n=1)、IgA肾病(n=1)和膜性肾小球肾炎(n=18) [31]。

2.1.3。生物信息学和统计分析

转录组分析在R软件环境3.4.3版中进行。使用ggplot2图形定义绘制箱线图[32]。对Fisher单因素方差分析(ANOVA)和双侧学生t检验进行统计检验，误差为5%。

2.2。细胞因子，抗体和试剂

重组人（rh）TGF-β1和IL-15从美天旎（GmbH，德国）购得。抗体（Abs）以下针对E-钙粘蛋白（AF648），IL-15（IC2471P），IL-15Rα（FAB1471P），IL-15Rβ(FAB224P) IL-15Rγ（MAB2842），TGF-β和β1（AB-100-NA) and the U0126 MEK specific inhibitor (1144) were obtained from Bio-Techne Ltd. (Lille, France) and Abs against N-cadherin (4061), p-c-Jun (3270), vimentin (sc-73260), and Snail1 (3895) from Cell Signaling Technology (Leiden, Netherlands). Ab against ZO-1 (18-7430) was purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA) and Abs against tubulin (sc-5274), GAPDH (sc-47724), andβ从Santa Cruz公司（海德堡，德国）的肌动蛋白-HRP（SC-47778）。针对胶原IV（Ab6586）的Ab从Abcam公司（剑桥，英国）购得。合适的HRP或Alexa-Fluor488或TRITC缀合的第二抗体来自Jackson免疫实验室公司（西林，PA，USA）。具体JNK抑制剂SP600125和荧光素二乙酸酯（FDA，F7378）购自Sigma-Aldrich公司（圣康坦，法拉维耶，法国）购买的。

2.3。初级细胞和细胞系

原代人肾近端小管上皮细胞（RPTEC）（Lonza，Verviers，比利时）按照制造商的说明在体外扩增。在一些实验中，如前所述，在无添加剂和每日培养基更新的REGM培养基中培养细胞5天，诱导自发EMT[23]。永生化人近曲小管上皮细胞（HK-2），从美国典型培养物保藏中心（ATCC，马纳萨斯，VA，USA），在完全角质形成细胞无血清培养基（K-SFM）根据ATCC的说明培养和通道之间使用图3和15，在此之前的细胞因子暴露，将细胞在含有抗生素的最小饥饿培养基中培养。然后将细胞用rhTGF-孵育β1，的rhIL-15，和/或抗TGF-β1种抗体以指定的浓度，用于改变次。

2.4。人肾标本

回顾性分析了人肾活检组织石蜡包埋切片。知情的书面同意病人使用部分活检用于科学目的。所有程序和纸巾的使用都是按照《赫尔辛基原则宣言》进行的。

2.5。TGF-ββ1定量

转化生长因子的定量-β1 2-5天空调使用用于活性TGF-β的生物特异性测定进行从管状电池媒体β1 [33]其中TGFβ敏感的BL41细胞系稳定地与报道质粒携带的合成转染TGF-β-荧光素酶基因上游的可诱导DNA序列。转化生长因子的活性形式-β直接处理细胞上清和总TGF-，定量1β1潜TGF-的酸活化后（即，活性+潜）β然后1.数据标准化为每孔的总细胞数目。重复实验以一式三份的3倍和显示为平均值±SEM照片。

2.6。胶原蛋白定量

在48小时处理的细胞的细胞上清液胶原蛋白的量为使用进行量化市售天狼星红胶原检测试剂盒（Chondrex公司，公司，位于Redmond，USA）按照制造商的说明进行操作。在4℃下24小时;简言之，胶原是使用浓缩溶液（Chondrex公司，Inc。目录＃90626）的第一浓缩。在乙酸沉淀溶解后，样品用天狼星红溶液孵育在室温下30分钟，并使用提取缓冲液洗脱。所提取的溶液的吸光度在通过酶标仪540nm处读取。校准曲线在8-250的范围内，使用牛胶原-I构建 μ克/毫升。

2.7。Western印迹

下减少来自全细胞裂解物条件下进行的Western印迹分析在冷RIPA缓冲液制备如先前所描述[24]。随后用指示的一抗在夜间对印迹进行检测。使用适当的hrp标记的二抗。使用Image J软件(NIH)对可视化条带进行密度测量。

2.8。免疫组化

将细胞分配到实验室-Tek的组织培养腔室玻片（Nunc公司，伊利诺伊州内珀维尔）的8孔室，并在汇合时，用指定浓度的细胞因子处理，用于改变次。在-20℃下10分钟，而由一个0.5％的Triton X-100透化之后的4％多聚甲醛固定被用于细胞内染色用于进行膜染色，将细胞用冷甲醇固定：丙酮（1:1）。封闭步骤后，将细胞在4℃下温育用所示初级和荧光标记在封闭溶液中，3次洗涤之间稀释的第二抗体。将细胞安装在4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Invitrogen公司，Cergy Pontoise酒店，法国）并通过荧光显微镜（莱卡，德国）显影。

2.9。免疫组化

石蜡包埋的肾脏组织使用适当的抗原检索方法处理，如先前描述的34]。组织用抗IL-15染色，并施加在室温（DakoCytomation公司，丹麦）45分钟在Envision试剂盒，根据制造商的说明。染色使用DAB试剂盒（DakoCytomation公司，丹麦）显示并用苏木（Sigma-Aldrich公司，圣路易，美国）复染。以盲用计算机为基础的形态分析软件（TRIBVN ICS框架）阳性染色量化。被选定为代表围绕〜7毫米IL-15定量每个活检的整个肾脏矢状剖面²如前所述的皮层表面积[34]。测定在皮层阳性面积为每个试样和表示为总皮质肾部分的百分比。

2.10条。流式细胞术分析

将细胞用Accutase（Sigma-Aldrich公司）和IL-15的细胞表面表达和IL-15R脱离α如前所述，采用流式细胞术进行分析[35]. 简单地说，细胞在含有1%FCS和2 mM EDTA的FACS缓冲液中洗涤，并用针对IL-15和IL-15R的藻红蛋白（PE-）结合抗体染色α。洗涤3次后，10.000分析细胞上的Fortessa流式细胞仪（BD Biosciences）中，并使用FlowJo软件（Tree星公司）分析数据。三次重复用于各条件和实验重复至少三次。

2.11条。统计分析

我们比较了使用曼 - 惠特尼差异ü测试或配对学生的t测试，视情况而定。所有分析均采用GraphPad Prism 5.0软件进行。时，数据被认为具有统计学意义值<0.05。所有数据表示为平均值±SEM照片。

3.结果

3.1。IL-15表达降低在移植肾功能不全和人炎性肾病

由于在几种实验性小鼠肾病中肾内IL-15显著降低，损害了肾功能[20，21，我们首先通过基于微阵列数据集的生物信息学研究了移植患者和人类肾病肾活检中IL-15的表达谱。研究人类肾病多样性的转录组实验已经使用Affymetrix技术进行了处理。发表的GES1563数据集分析[三十]所示IL-15转录物在肾功能障碍（N = 5）移植一个显著下调与运转良好的移植排斥反应与没有临床证据（N = 10）（图图1（a），左面板;t检验的p值= 0.0042）。TGF-ββ在人类移植反应和肾功能不全的情况下，1被发现呈负相关(图1)图1（a），右图;t检验的p值= 0.016）。从患者不同肾病如糖尿病性肾病，微小病变，薄膜病，局灶节段性肾小球硬化症，高血压性肾病，IgA肾病，和膜性肾小球肾炎肾间质也被相对于对照组织捐献者（GSE47184数据集[31]）。在此转录数据集IL-15转录物的定量分析揭示组样品（单因素ANOVA的p值= 0.05，图之间的显著调节图1（b）)。箱形图在IL-15的转录定量进行表现在几个肾病下调相比，控制捐助者和被发现这一全球趋势，由学生t检验（p值= 0.0038）证实。为了在蛋白质水平证实，IL-15的表达在人炎性肾病减少，免疫组织化学法对来自人肾小球活组织检查的石蜡包埋的肾脏组织进行。事实上，免疫组化分析（图图1（c））表示在正常肾脏IL-15的高表达水平，主要是在管状细胞（n = 5），而显著降低IL-15的表达（P <0.01）在急性间质性肾炎，观察到（AIN）（N = 5），IgA的肾病（N = 7），和糖尿病性肾病（N = 6）。

3.2。IL-15 / TGFβ比在“自发” EMT型号不平衡

我们最近表明，原发性肾上皮培养细胞（RPTEC）剥夺生长添加剂经历内5天“自发” EMT过程，这是抑制治疗细胞用10微克的rhIL-15 / mL的提示了这种细胞因子能够在肾脏保护潜在保持上皮表型[23，35]。自从intrarenal TGF -β激活是EMT过程的主要诱导物[17]，我们调查了体外自发EMT模型，一个潜在的TGF-ββ受累。使用用于活性TGF-β的生物特异性测定β1 [33]，我们测量了转化生长因子-β在肾小管细胞的条件培养基1个浓度为在不存在生长添加剂2和培养5天。在我们的管状原代培养物，我们观察到的TGF-两种活性和总形式的分泌的上调显著β1（图1 (d))。

除了分泌形式中，IL-15的形式，通过高亲和力的IL-15R锚定α在RPTEC细胞表面检测到链。这个膜结合的IL-15 (mbIL-15)，传递两种信号在顺[36]和在反式[20]通过中间亲和力受体IL-15Rβγ，被认为是肾内细胞因子的主要形式[20，23]。流式细胞术分析5天后停止生长补品显示mbi -15和细胞表面表达IL-15Rα沿着“自发” EMT过程中降低（图1 (e)，而那些IL-15Rβ和IL-15Rγ不受影响（补充数字S1)。评估TGF -β在这个过程中的参与，RPTEC细胞用重组人TGF-处理β1（rhTGF-β1）以诱导EMT的过程。甲伴随降低mbIL-15和表面IL-15R的表达α没有观察到对2天rhTGF-β1治疗RPTEC细胞（图1 (e)，下图），表明IL-15 / TGFβ比是在两个不平衡体外管状EMT车型。

3.3。两个TGF -β中和和rhIL-15处理抑制“自发性EMT”

为了证明TGF-ββ在“自发” EMT过程中的参与，其特征在于由所述鹅卵石形态的损失，降低随着间质标记物（波形蛋白和N-钙粘蛋白），肾小管细胞孵育5天的中和抗相关的E-钙粘蛋白表达TGF-ββ1马伯。TGF-与rhIL-15治疗相似β1个中和保留上皮性状，具有维修E-钙粘蛋白表达的（图2(一个)和2 (b))，防止波形蛋白上调(图2(一个)，补充图S2a）和N-钙粘蛋白（图2 (b)）的表达。这些结果加强EMT的调控机制这两种细胞因子之间的可能的相互作用如在其他过程中就已经观察到25-29]。

3.4。IL-15抑制TGF-β1诱导的EMT在RPTEC和HK2细胞

然后，我们在两个主（RPTEC）研究和永生化（HK-2）的人近端肾小管上皮细胞，无论是重组人IL-15能直接抑制rhTGF-β诱导EMT。为了检查在抑制TGF-IL-15的预期功效β1-induced EMT,我们首先对待HK2细胞浓度增加rhIL-15(0.1、1和10 ng / mL),我们确定1 ng / mL rhIL-15浓度的差别能够更有效地抑制对这些上皮标记上皮与间充质标记的upregulation N-Cadherin(图3（甲））和波形蛋白（图补充开通）由rhTGF-触发β1个处理（3纳克/毫升，48小时）。上述浓度在以下实验随后使用。类似的结果在RPTEC细胞中观察到（图3（b）)。这些结果通过在RPTEC细胞免疫荧光分析证实（图3（c）)。事实上，rhTGF-β1触发EMT过程，其特征是细胞形态发生改变，从分化的上皮细胞单层的有组织的“鹅卵石样”外观到无组织的拉长成纤维细胞样表型，上皮标记物(E-cadherin和ZO-1)消失，间充质标记物波形蛋白显著增加。值得注意的是，rhIL-15 (1 ng/mL)共孵育有效地抵消了TGF-β1（3毫微克/毫升）动作保持形态变化和细胞RPTEC上皮特征。

3.5。IL-15抑制TGF-β1点诱导胶原IV的合成在RPTEC和HK2细胞

肾小管间质纤维化的特征是细胞外基质成分的积累增加，这主要是由于它们的过度产生和降解的减少[37]。随后，我们通过分析IL-15对rhTGF-诱导的IV型胶原合成和分泌的影响，研究IL-15是否能抑制管状EMT过程的终步β1次治疗。在图图4（a），免疫荧光研究表明rhTGF-β1个治疗强烈增加24小时内胶原在两个上皮细胞类型中隐秘颗粒IV表达，并且这样的生产显着通过的rhIL-15治疗抑制。这种IL-15抑制对胶原产生活性用天狼星红总胶原检测试剂盒（图定量图4（b）). 因此，48小时rhTGF-β1处理使HK2细胞上清液胶原含量增加3倍，rhIL-15共孵育完全抑制rhTGF的刺激作用-β1.综上所述，我们的结果支持rhIL-15抑制由rhTGF-诱导的EMT的观点β1肾人肾小管上皮细胞。

3.6。在TGF-β，IL-15抑制SNAIL1表达βc-Jun激活1-刺激的HK-2细胞

为了破译机制参与rhTGF-的重组人IL-15抑制β1诱导的EMT，我们研究了rhTGF-控制的分子通路β1通过的rhIL-15治疗的影响。TGF-ββ1个诱导通过转录阻抑，诸如SNAIL1的SMAD3依赖性诱导EMT;一个锌指转录因子，其作为EMT的关键调节剂，足以单独转录再加压E-钙粘蛋白和诱导EMT [16，38]。Western blot分析显示，rhTGF-呈强阳性β1诱导表达SNAIL1用的rhIL-15 48小时（图cotreating HK-2细胞时几乎完全抑制图5（a）)。随后，我们研究了如何rhTGF-的rhIL-15干涉β1个信号转导。在其它细胞模型最近的数据已经表明，IL-15不抑制Smad2 / 3的信号传导途径的初始步骤，但作用于Smad2 / 3的-DNA复合物的形成，通过磷酸化c-jun的Smad3的辅阻遏物[25]。在此，补充图S3，我们确认的rhIL-15治疗不抑制TGFβR表达（TGF-βRI和TGF-ββRII,图S3A）磷酸化（图S3B）和Smad2的核易位/ 3复合物（图S3C）在rhTGF-β1刺激的HK-2细胞。

因此，我们评估了c-Jun的途径是否参与SNAIL1表达分析c-Jun的磷酸化水平的重组人IL-15处理的HK2细胞的抑制。Western印迹（图5 (b)）和免疫荧光（图5 (c)）的研究显示，重组人IL-15在HK-2细胞中诱导对c-Jun的表达的显着增加后才延长的细胞因子刺激（24H-48H）。与SP600125分子，C-Jun N-末端激酶（JNK）的选择性抑制剂coincubating细胞时（这个作用可被图5 (c)，补充图S4)。

为了证明在SNAIL1表达的抑制在重组人IL-15 / rhTGF- P-c-Jun的的具体参与β在6h rhTGF下诱导Snail1表达前，用rhIL-15预处理1个共处理细胞、HK2细胞30min或24hβ-1治疗。rhTGF-β单独治疗没有激活c-Jun和对c-Jun的磷酸化，其长期的rhIL-15温育后仅诱导不干扰（图6(一),上半部分)。有趣的是，只有后者会抑制TGF-β1诱导SNAIL1表达（图6(一)较低的面板)。免疫荧光分析(图图6（b））和蛋白质印迹（图图6（c）)加强这些数据，因为rhIL-15对TGF的抑制活性-βJNK SP600125特异性抑制剂阻断了1诱导的Snail1核转位，表明rhIL-15对Snail1的抑制作用依赖于c-Jun的激活。

4。讨论

肾间质纤维化，其特征在于由负责过度基质沉积成肌纤维细胞的积累，是在几乎所有的进行性慢性肾脏疾病（CDK）[最终共同结果8]。在此背景下，这些细胞的确切来源不明确，有争议的，仅在几分钟肾病如糖尿病肾病，肾脏纤维化的发展更清楚地肾内TGF-β相关β1个诱导的肌纤维母细胞对细胞次级上皮细胞的过渡：所谓II型EMT [13-15]。有趣的是，最近的一项研究对EMT在肾纤维化中的作用有了新的认识。事实上，Grande等人证明了这一点体内部分和可逆的管状EMT的机构，通过激活SNAIL1诱导，继电器以促进从肾和骨髓衍生的细胞，成肌纤维细胞纤维化分化和维持炎症[间质信号16]。

EMT涉及的分子机制非常复杂，已经发现了许多调控这一过程的信号网络和介质。其中纤维化因子为TGF-β，其上调已链接到DN纤维化的发展，膜性肾病和其他CDK，是EMT的主要诱导和肾脏纤维化的主要介质[4]。几个内源性抗纤维化因素，特别是HGF和BMP-7，其能够精确地拮抗型TGF-β的作用纤维化β，也已确定[39-41]。此外，在上述因素中下调慢性肾损伤[4，19，表明纤维化/抗纤维化因子的失衡是组织纤维化的一个中心参数。抗纤维化治疗的一个重要策略是增加或恢复病变肾脏中抗纤维化因子的表达[4]。然而，只有少数的临床试验已经成功锁定纤维化CKD，这可能反映了一个事实，即炎症是多方面的，自我维持。因此，有必要考虑其他人能够完成这项工作的抗纤维化因素。

在此背景下，大量证据支持白介素-15 (IL-15)可能是这些候选者之一的假设，其功能在人类肾脏病理生理学中被低估。IL-15是一种多效性细胞因子，不仅参与先天免疫，还参与免疫系统外的功能。值得注意的是，肾小管和皮质上皮细胞是IL-15的重要来源，其作用形式多种多样。事实上，肾细胞在低水平分泌单体IL-15，它可以通过高亲和力的IL-15R以自动/旁分泌的方式发挥作用αβγ复杂的，表现为一个功能强大的存活因子特别的Bcl-2 / Bax比值增加[20，21，42]。此外，这些细胞也表达膜结合的IL-15的形式，通过IL-15R锚定到细胞表面α链（mbIL-15）[35]，其transpresentation到邻近表达中等亲合力受体的细胞（IL-15Rβγ）在鼠模型中被认为是一个主要的生理机制确保肾体内平衡[20]。

几项研究表明TGF-β而IL-15则显示相反的动作。因此，对于原代培养的RPTEC, IL-15是一个显著的抗凋亡因子，而TGF则是一个显著的抗凋亡因子β显示促凋亡功能[20，43]。此外，IL-15 TGF-反作用β1诱导的肌成纤维细胞分化的人胎儿肺成纤维细胞，并可能发挥在肺纤维化的某些形式抗纤维化作用[26]。通过腹腔疾病相比之下，IL-15维持肠道炎症，抑制TGF-ββ-介导的T淋巴细胞免疫抑制信号[25]。最后，IL-15能够抵消由TGF-施加免疫抑制作用β在NK细胞从AML患者[27]。

基于上述结果，我们提出肾内IL-15可以作为TGF-的内源性调节因子β1个活性。为了证实这一假设，我们首先在各种人类肾病研究了IL-15的表达。有趣的是，我们发现了一个显著IL-15在转录水平在人肾病由生物信息学基于微阵列数据减少的表达。这种降低的IL-15表达通过在间质性肾炎和DN免疫组织化学在蛋白质水平证实，而在正常肾IL-15的表达是高的，主要是在小管如先前实验肾病[描述20，21]. 同时，我们证实，缺乏生长补充剂的RPTEC细胞会迅速发生自发的EMT，这不仅仅是rhIL-15治疗所有效阻止的[23但也使用中和的抗tgf -β1马伯。此外，我们还表明，在这个模型中，RPTEC细胞迅速表现出膜结合IL-15和IL-15R的显著下降α表达，而那些IL-15R的β和IL-15Rγ不受影响。与此同时,TGF -β1个分泌增加，再现实验炎性肾病什么观察。事实上，rhTGF-β1个处理引起IL-15和IL-15R的表面表达的快速下降α在RPTEC细胞上，这一现象与体外和体内到的活化肾内TGF-β1。因此，有可能的是，在一些人的糖尿病肾病，不平衡生产肾内IL-15和TGF-β的β1可能致使上皮细胞更容易纤维化刺激。

IL-15在保护人肾上皮细胞免受TGF损伤中的作用-β1-induced EMT体外中，我们使用RPTEC（主细胞）和HK-2细胞（永生化细胞系），两个上皮模型广泛用于研究EMT。第一结果表明，重组人IL-15治疗抵消EMT在两种细胞类型中，保存上皮标记（E-钙粘蛋白和ZO-1）和抑制间质酮（N-钙粘蛋白，波形蛋白）和总胶原蛋白的产生/分泌的表达（i.e., collagen IV) (Figure图7（a）)。我们确定，1毫微克/毫升是最小的rhIL-15浓度能够抑制TGF-ββ1个效果表明IL-15作用由中间亲和力受体IL-15R介导的βγ对这些细胞。解剖IL-15抑制机制表明，重组人IL-15干扰了转录因子蜗牛，EMT的主调节器，通过c-jun的途径的持久活化的诱导（图图7（b）)。阻断SNAIL1活化IL-15是一个关键步骤，因为它是可能的肾内IL-15可以由钝蜗牛触发的局部管状EMT其体内代表一个重要的检查点，促进从不同类型的肾和骨髓来源的细胞和纤维形成的肌成纤维细胞分化[16]。此外，重组人IL-15治疗在1纳克/毫升有效地抵消rhTGF-β1诱导的细胞凋亡，通过依赖于IL-15R MAPK途径βγ复合物（图补充S5），表明存活因子IL-15可以与管状的TGF-直接干扰β诱导的细胞凋亡，其与在实验肾病间质纤维化[相关21]。

肾脏纤维化的进程，其中多个细胞事件和分子介质参与和互动演唱会，是非常复杂。在这方面，肾内IL-15可作用于参与肾纤维化其他事件，抑制例如对肾炎趋化因子的诱导，MCP-1，一个强大的趋化对于那些TGF-的强大的源的巨噬细胞β[21]。备选地，IL-15可抵消TGF-β1诱导的成纤维细胞对成肌纤维细胞中所报告的肺纤维化模型分化[26]。因此，对肾纤维化的不同参与者，尤其是肾小管细胞的作用，推测肾损伤时IL-15活性的降低可能是纤维化发展的一个关键事件。此外，与无排斥反应的功能正常移植患者相比，无排斥反应的移植患者的活组织检查中IL-15的表达降低。综上所述，这些数据表明肾源性IL-15的下降对肾功能有害，有利于肾纤维化的发展。

有趣的是，肾内IL-15的减少与IL-15R的变化密切相关α在几个实验鼠肾病[20，21]。因此，肾内IL-15R的下调α链可以是损害不仅分泌细胞因子的单体的作用的主要限制因素通过高亲合力受体的可用性也是膜结合的IL-15的上皮细胞上的形成减少。

因此，在患病的肾脏亲和抗纤维化信号之间的平衡的恢复似乎是预防或延缓（或者甚至扭转）与CKD相关的肾纤维化的重要治疗策略。在这方面，针对TGF-ββ1个及其信号传导途径是只有一半的方程。另一种方法可以增加抗纤维化因子，如IL-15，在患病的肾脏。

总之，IL-15为肾小管上皮细胞的重要因子稳态，能够抵消TGF-β诱导原代（RPTEC）和永生化（HK-2）人近端肾小管上皮细胞凋亡和EMT。在这种情况下，转化生长因子的增加-β与内源性抗纤维化因子（如IL-15）活性降低相关的产物可能至少部分解释了多发性肾病的纤维化发展和肾功能衰竭。很有可能提示肾内mbIL-15是肾内TGF的天然抑制剂-β1和治疗策略，以恢复或增加肾脏损伤的IL-15水平可能是一些人的肾病如糖尿病肾病有利。

数据可用性

用于支持该研究结果的数据包括在项目和补充数据内。

利益冲突

没有任何作者有任何利益冲突要披露。

致谢

我们感谢塞文琳莱古特博士和索菲Ferlicot博士他们的技术支持和科学建议。这项工作是部分由Vaincre癌症中心，NRB基金会和法国（无。R12065LL）资助。辛迪Gallerne来自Vaincre癌症中心，NRB和ARC基金会博士后奖学金的获得者。

补充材料

补充图S1。IL-15R的表达β和IL-15Rγ链在自发EMT过程中不受影响。的IL-15R的细胞表面表达β和IL-15Rγ上RPTEC细胞链，通过流式细胞仪分析后第5天在“自发” EMT模型进行分析。灰色直方图是指同种型匹配的控制和黑色直方图IL-15R链的表达。对于每个标记物的平均荧光强度值示于每个直方图。补充图S2。抑制rhTGF -β通过重组人IL-15 1诱导的波形蛋白表达。（一个）波形蛋白（间充质标志物）通过Western印迹在第5天在RPTEC细胞在标准（完整REBM分析表达）和“自发EMT”的条件下，在存在或不存在中和TGF-β的β1种抗体（5μ克/ mL）和/或的rhIL-15治疗（1毫微克/毫升）（N = 1）。（b)用1ng/mL rhIL-15和3ng/mL rhTGF分析波形蛋白在RPTEC细胞上的表达-β1表示48h (n=1)。补充图S3。的rhIL-15治疗不影响TGF-ββR的表达，也没有Smad2和Smad3磷酸化和在rhTGF核易位β1处理的HK-2细胞。（一个）TGF-Western blot分析βRI和TGF-ββ24和48h的rhIL-15处理后，RII（1毫微克/毫升）。条形图代表TGF-ββRI和TGF-ββRII表达归一化至GAPDH（N = 3，±SEM照片）。抗体（ABS）对TGFβRI（AF3025）和转化生长因子βRII（AF-241-NA）购自R＆d系统（欧洲）有限公司，Abingdon的，UK获得。（b)通过western blotting分析rhTGF后Smad2/3的表达和磷酸化情况β1个处理（3纳克/毫升，30分钟）在HK-2细胞预处理或不与重组人IL-15（1纳克/毫升，24小时）。条形图代表P-Smad2和P-Smad3的表达归一化至其天然形式（n = 3时，±SEM照片）。GAPDH被示出为上样对照。对P-Smad2的（400800），Smad2的（511300），P-Smad3的（44246G），和Smad3（511500）的Ab自Invitrogen（Carlsbad，CA）购买。（C）Smad2的核易位（SAB4300562，Sigma-Aldrich公司）的混合物在相同的细胞因子治疗揭示的免疫荧光染色。免疫荧光数据是三个独立实验的代表。补充图S4。SP600125抑制剂抑制rhIL-15诱导的C-Jun磷酸化。磷酸的c-Jun的Western印迹分析，以16小时的rhIL-15治疗（1毫微克/毫升）±特定JNK抑制剂SP600125的后48h表示。磷酸的c-Jun表达归一化至β肌动蛋白。补充图S5。重组人IL-15抑制细胞凋亡诱导的rhTGF-β1 RPTEC细胞。RPTEC细胞用或不用U0126处理（10μM)和rhIL-15 (1 ng/mL)， TGF-存在β在rhIL-15和/或TGF-后，1 (3 ng/ml)持续48hβ1个处理，细胞在37℃下孵育5分钟，荧光探针荧光素二乙酸酯（FDA）在0.2μg/ml评估细胞活力(FDA-green阳性，活细胞)。在Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences)上分析了10.000个细胞。rhIL-15处理抑制了rhTGF-诱导的细胞凋亡β1 RPTEC细胞而用U0126，ERK1 / 2的上游激酶MEK1 / 2的特异性抑制剂共处理，完全消除的rhIL-15的活性。条形图表示凋亡细胞（FDA绿色阴性细胞）的比例（p<0.05，n = 3时，±SEM照片）。（补充材料）

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