l -塑素肽生物降解纳米颗粒的体外持续递送和抑制破骨细胞功能的研究GydF4y2Ba

摘要GydF4y2Ba

我们最近证明，分子量小的氨基末端L-丝束（10个氨基酸的肽;“MARGGydF4y2Ba小号GydF4y2BaVGydF4y2Ba小号GydF4y2BaDEE”）抑制内源性L-丝束的磷酸化。因此，新生密封区域（NSZs）和骨吸收的形成减少。本研究的目的是开发可以加载与所关注的L-丝束肽的生物可降解的和生物相容的PLGA纳米载体并确定功效GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba在破骨细胞的文化。L-plastin玛格GydF4y2Ba小号GydF4y2BaVGydF4y2Ba小号GydF4y2BaDEE（P1）和扰频控制（P3）肽负载PLGA-PEG纳米颗粒（NP1和NP3，分别）通过双乳液技术合成。对破骨细胞的纳米颗粒的生物作用可被免疫沉淀评价，免疫印迹，的肌动蛋白丝罗丹明鬼笔环肽染色，和坑形成试验。良好分散的NP1和NP3的物理表征证明〜130-150纳米尺寸，<0.07的多分散指数，〜-3毫伏GydF4y2BaζGydF4y2Baζ-电位和肽的三周持续释放。在破骨细胞培养物的生物表征证明以下情况：NP1显著降低（a）中的内源性L-丝束磷酸化;（b）中形成NSZs和密封环;（c）中的再吸收。然而，足体这对细胞粘附关键的组件并没有受到影响。L-丝束肽负载PLGA-PEG纳米载体已经有希望用于与骨损失有关的疾病的治疗潜力。未来的研究将采用肽战略的这种缓释系统地抑制破骨细胞的骨吸收活动GydF4y2Ba在活的有机体内GydF4y2Ba在显示骨丢失的小鼠模型中。GydF4y2Ba

1.简介GydF4y2Ba

在骨重建过程中，成熟的骨组织被称为骨吸收，新的骨组织形成的过程称为骨化或骨形成。骨吸收和骨形成分别由破骨细胞和成骨细胞介导。破骨细胞是多核巨细胞，吸收骨的无机和有机相(rev. in [GydF4y2Ba1GydF4y2Ba，GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]）。期间骨吸收，破骨细胞形成骨表面上的紧密密封，在其上它们分泌酸和蛋白酶以促进骨吸收过程[GydF4y2Ba3GydF4y2Ba-GydF4y2Ba五GydF4y2Ba]。这种骨表面的紧密密封与肌动蛋白丝环的形成有关，这种肌动蛋白丝环被称为密封环[GydF4y2Ba6GydF4y2Ba，GydF4y2Ba7GydF4y2Ba]。GydF4y2Ba

骨吸收过程中的破骨细胞的密封环形成的调节是在病理骨损失的关键组件。密封环形成的调节是依赖于与肌动蛋白丝调节肌动蛋白的调节性蛋白（或多个）的相互作用的信号传导机制。我们最近的研究已经确定了前体区域的组件在活性，骨再吸收的破骨细胞的密封环的形成[初期（表示为新生密封区域（NSZs））GydF4y2Ba6GydF4y2Ba]。我们证明了在形成密封圈的过程中，肌动蛋白捆绑蛋白L-plastin (LPL)和肌动蛋白结合蛋白corn之间存在一种新的机制联系[GydF4y2Ba6GydF4y2Ba]。LPL显示出存在于破骨细胞的足体[GydF4y2Ba8GydF4y2Ba]。然而，它的功能仍然难以捉摸的足体。我们以前和最近的研究表明，LPL具有密封环形成的早期阶段，破骨细胞的调节作用[GydF4y2Ba6GydF4y2Ba，GydF4y2Ba7GydF4y2Ba，GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]GydF4y2Ba

质体有三种异构体(L-、T-和i -质体)。在这三种基因中，只有L-和t -质体通过信号转导途径调控细胞骨架重组[GydF4y2Ba10个GydF4y2Ba]。的L-丝束这是最初在白细胞称为“造血丝束同种型”（REV标识。在[GydF4y2Ba11个GydF4y2Ba])属于肌动蛋白交联或捆绑蛋白的大家族，例如。，GydF4y2BaαGydF4y2Ba辅肌动蛋白和细丝蛋白[GydF4y2Ba德意志北方银行GydF4y2Ba]. 在这三种质体中，只有L-质体具有捆绑能力GydF4y2BaβGydF4y2Ba有效地肌动蛋白[GydF4y2Ba13个GydF4y2Ba]。Plastin包含两个磷酸化丝氨酸残基(Ser-5和Ser-7)和Ca2+结合位点，在氨基末端(NT)侧接EF-hand基序。c末端部分包含两个连续重复的肌动蛋白结合域，每一个都由两个顺序的钙蛋白同源性(CH)域组成[GydF4y2Ba14个GydF4y2Ba]. 在这三种亚型中，只有LPL在细胞中被磷酸化[GydF4y2Ba10个GydF4y2Ba]。LPL在Ser-5和Ser-7氨基酸(aa)上的磷酸化涉及到细胞趋化和细胞粘附过程所需的细胞骨架[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba-GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]。GydF4y2Ba

我们以前已经证明，在Ser 5和Ser 7 aa上，LPL被TNF磷酸化-GydF4y2BaαGydF4y2Ba信号调节破骨细胞[参与NSZs形成的肌动蛋白集束处理GydF4y2Ba6GydF4y2Ba]。随后，通过转导TAT融合全长LPL肽（FL-LPL），我们证实在NSZs形成LPL的作用。在这些破骨细胞的骨吸收的增加与增加NSZs和密封环的数量对应良好。此外，丝氨酸磷酸化的上NSZs和牙本质骨吸收的形成中的关键作用表现在与由Ser-5和Ser-7 AA的TAT融合的氨基末端LPL（NT-LPL）肽转导的破骨细胞。NT-LPL肽的转导有可能降低内源性LPL磷酸化这对NSZs [形成的抑制作用GydF4y2Ba7GydF4y2Ba]。此外，小分子量氨基末端LPL肽(sNT-LPL;MARGSVSDEE;10aa)含有Ser-5和Ser-7 aa的细胞也表现出类似的抑制破骨细胞吸收的作用，通过抑制NSZs和密封圈的形成。但是，骨形成是由成骨细胞完成的GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba是由该SNT-LPL肽不受影响。在Ser-5和Ser-7为Ala-5和Ala-7的SNT-LPL肽的取代对破骨细胞介导的事件没有这样的抑制作用[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]。对tat融合的sNT-LPL肽的研究表明，LPL可能是一种不影响骨形成的治疗骨丢失的新靶点。GydF4y2Ba

生物材料，特别是聚合纳米颗粒，已经极大地研究了各种各样的应用，包括骨组织工程以提高植入物的组织再生和骨结合以及防止感染[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba-GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]。因此，我们探索了使用聚合物纳米颗粒以可控和持续的方式传递和释放感兴趣的sNT-LPL肽的方法。在聚合物、脂类、陶瓷和金属等不同类型的材料中，聚合物特别适合于受控和持续给药的应用[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]。最常用的生物相容的和生物可降解聚合物包括聚（l-丙交酯）（PLA），聚乙醇酸（PGA），聚己内酯€（PCL），或PLA和PGA的共聚物 - 聚（L-丙交酯GydF4y2Ba合作GydF4y2Ba乙醇)(PLGA) [GydF4y2Ba25GydF4y2Ba，GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]。GydF4y2Ba

二膦酸盐（BPS）仍然是骨质疏松症的当前治疗程序的主要治疗偏好中的一个。阿仑膦酸盐（福善美又名）是在骨损失的治疗成人[二膦酸GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]. 作为破骨细胞封闭环形成和体外活性的特异性抑制剂[GydF4y2Ba6GydF4y2Ba，GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]. PLGA-阿仑膦酸钠（PLGA-ALE）纳米颗粒可破坏破骨细胞的密封环形成并诱导其凋亡。因此，可以观察到胶原降解的抑制作用。总体而言，PLGA-ALE纳米颗粒显示出抗破骨细胞活性[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba-GydF4y2Ba31GydF4y2Ba]。然而，已经提出，继续使用双膦酸盐治疗的（例如，阿仑膦酸盐）以外的3至5年的治疗时期可能会导致成骨细胞介导的骨形成的减少，从而导致非典型骨骼骨折谁曾使用他们[患者GydF4y2Ba32GydF4y2Ba-GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]. 在非典型骨折旁使用BPs的各种风险对新型抗吸收药物的开发具有挑战性。因此，我们认为LPL是一种新的治疗靶点，这些纳米颗粒的初步观察将为在小鼠模型体内检测纳米颗粒提供依据。GydF4y2Ba

在此，我们的目的是确定sNT-LPL肽载PLGA纳米粒在参与破骨细胞环形成和功能的肌动蛋白重塑过程中的应用GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba. 这些研究结果表明，由聚合物形成的纳米颗粒可能具有适当的靶向性，并在体外以持续的方式将感兴趣的肽传递给破骨细胞。随后，这将使PLGA纳米颗粒制剂能够在给药后的几天内持续全身释放感兴趣的肽，可能避免通过注射每天给药肽。GydF4y2Ba

2。材料和方法GydF4y2Ba

2.1。材料GydF4y2Ba

甲氧基封端的PLGA-PEG（10:5 kDa）购自Polyscitech（威斯特拉斐特，印第安纳州）。聚乙烯醇（PVA，25kDa）购自Polysciences（宾夕法尼亚州沃灵顿）。抗L-plastin（SC-16657）抗体购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.（加州圣克鲁斯）。磷酸丝氨酸（125277）抗体购自Abcam（Cambridge，MA）。重组肿瘤坏死因子-GydF4y2BaαGydF4y2Ba（216-TA）和MCSF（416-ML）从研发系统（明尼苏达州明尼阿波利斯）购买。蛋白质测定试剂、蛋白质分子量标准品、聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂均购自Bio-Rad。从GE Healthcare获得用于免疫印迹的HRP结合二级抗体。PLGA（7-17kda，50:50）、二氯甲烷（DCM）、抗兔GAPDH抗体、罗丹明-法洛肽和其他化学物质均购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。sNT-LPL肽（荧光结合和非结合）由Genscript公司（Piscataway（NJ））制备。GydF4y2Ba

2.2。纳米颗粒的合成GydF4y2Ba

采用双乳液溶剂蒸发法制备了负载肽的纳米粒子。简单地说，将聚合物(14mg PLGA和14mg PLGA- peg)溶解在2ml DCM中，制备有机相。一次油包水乳状液形成如下:在剧烈搅拌条件下，在水溶液(P1或P3)溶液(50)中形成GydF4y2BaμGydF4y2Ba升，10毫摩尔）滴加到聚合物溶液中。PVA（5％W / V）溶解于水中，并通过0.2GydF4y2BaμGydF4y2Ba米过滤器以形成二次水相。搅拌30分钟后，将初级乳液加入到PVA水溶液（12ml）中，以形成水包油包水乳液。超声处理立即使用超声波探头（超音速的Vibra-细胞，牛顿，CT）在冰浴中在30％振幅与开关20秒脉冲进行2分钟。超声处理后，将乳液在室温下转移至磁力搅拌4小时，以允许DCM蒸发。纳米颗粒（NP）形成（PLGA-PEG_P1和PLGA-PEG_P3肽;此后表示为NP1和NP3）在21100进行三次洗涤微量离心×GydF4y2BaGGydF4y2Ba10分钟。接着，纳米颗粒再悬浮在超纯水中，并使用新鲜的实验[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]。GydF4y2Ba

2.3。纳米粒子的表征GydF4y2Ba

NPs在物理化学表征前用PBS (~ 10mm NaCl, ph7.4)稀释15X。水动力直径，多分散性指数(PDI)，和GydF4y2BaζGydF4y2Ba-用Zetasizer NanoZS（马萨诸塞州南部自治区Malvern仪器）通过动态光散射和激光多普勒风速测定电位（表面电荷）。粒径测量在25°C下以173°的散射角进行，并报告为数值平均值。粒子表面的电荷被报告为GydF4y2BaζGydF4y2Ba-潜在。使用在80kV操作的FEI TECNAI T12透射电子显微镜（TEM，FEI，希尔斯伯勒，OR）观察NP的结构和形态[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]。GydF4y2Ba

2.4条。肽的装载和释放GydF4y2Ba

对于肽装载的测量，感兴趣的FITC缀合的SNT-LPL肽在以下上述相同的双乳液方法纳米颗粒负载。纳米颗粒制备后，1个毫克冻干的纳米颗粒溶解在0.2ml DCM中，向其中加入0.5ml水，涡旋，并进行相分离备用。含有肽的水相，小心地从顶部收集而不干扰底部相。所收集的肽溶液的荧光通过在495nm处激发和520nm的发射波长光谱仪进行分析。用于肽释放的研究中，冻干的纳米颗粒的已知量的悬浮于PBS中，并放置在浮动-A-Lyzer渗析管（3.5-5 kDa的MW截止，光谱实验室，牧场格斯，CA）。将样品上，在37℃的定轨摇床中并对PBS透析。以预定时间间隔，将1ml的透析液被收集，并且在同一体积用新鲜的PBS补充在37℃下温育。所有收集的肽释放的样品在与上述波长设置的光谱仪进行分析。肽浓度从通过读取连续稀释的已知的肽浓度的荧光强度产生的标准曲线进行定量。肽释放％由下式计算：GydF4y2Ba

肽释放（％）=（在透析液肽的量×100）/（在纳米颗粒中肽的量的透析管内）GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]。GydF4y2Ba

2.5。从RAW264.7巨噬细胞样细胞系制备破骨细胞前体GydF4y2Ba

小鼠破骨细胞由所述的RAW264.7细胞产生[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]。简单地说，RAW264.7细胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco 's modified Eagle 's medium (DMEM)中以低密度电镀。24 h后，用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF;10 ng/ml)和GST-RANKL (60 ng/ml)。两天后，在上述指示浓度下，用新鲜M-CSF和RANKL代替培养基。重组GST-RANKL如前所述纯化[GydF4y2Ba6GydF4y2Ba]。成熟的多核破骨细胞是从起3天看到。GydF4y2Ba

2.6。破骨细胞的加法与肽和骨粒后，裂解液的制备GydF4y2Ba

小鼠骨粒子和加法的骨粒子的成熟破骨细胞的制备如先前所述进行[GydF4y2Ba6GydF4y2Ba]。三到六个孔用于纳米颗粒装载的肽或转导与tat融合的sNT-LPL肽和裂解制剂。用TAT融合肽转导或用纳米颗粒治疗，破骨细胞首先保存在无血清的DMEM中2小时。在无血清的DMEM中，将TAT蛋白(100-150 nM)或感兴趣的纳米颗粒(150 nM)加入培养基中2小时。随后，骨颗粒(60-80GydF4y2BaμGydF4y2Bam尺寸；100GydF4y2BaμGydF4y2Ba克/孔）和TNF-GydF4y2BaαGydF4y2Ba（20毫微克/毫升）加入到细胞中，并继续依赖于实验条件4小时或6小时的温育。GydF4y2Ba

各种处理后，在冰冷的PBS中洗涤三次后，破骨细胞在RIPA缓冲液(10 mM Tris- HCl, pH 7.2, 150 mM NaCl, 1%脱氧胆酸盐，1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1%抑肽酶，2mM PMSF, 100 M Na)中溶解GydF4y2Ba_3GydF4y2Ba签证官GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba和1％抑肽酶）中并在4℃下在15,000rpm下离心5分钟。将上清液用于使用Bio-Rad蛋白测定试剂蛋白估计。GydF4y2Ba

2.7条。制备免疫沉淀和免疫印迹分析GydF4y2Ba

等量的裂解物的蛋白质（100-150GydF4y2BaμGydF4y2Ba克）用于免疫沉淀。如先前所述进行免疫沉淀和Western印迹[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba，GydF4y2Ba37GydF4y2Ba]。GydF4y2Ba

2.8。肌丝的罗丹明鬼笔环肽染色的破骨细胞GydF4y2Ba

破骨细胞来源于上述264.7巨噬细胞样细胞系。为了对足虫体进行染色，将原始细胞置于玻片上，用M-CSF和RANKL进行如上所述的分化。成熟多核破骨细胞在第三天出现。未分化的原始细胞用细胞剥离液(Sigma)轻轻去除，破骨细胞要么用塔特融合肽转导，要么在TNF-存在时用NPs处理GydF4y2BaαGydF4y2Ba和骨骼颗粒。为了检测NSZs和密封环，成熟破骨细胞与细胞剥离剂溶液中除去和再接种于牙本质片。使细胞附着到为四到五个小时矿化基质;然后将细胞或者与TAT融合肽转导或与纳米颗粒中TNF-α的存在下处理GydF4y2BaαGydF4y2Ba. 孵育3-4小时检测NSZ或12-14小时检测密封圈[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]。肌动蛋白染色在这些破骨细胞与罗丹明鬼笔完成的描述GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]。用Bio-Rad共聚焦激光扫描显微镜拍摄染色破骨细胞。图像以TIF图像格式存储，并由Adobe Photoshop (Adobe Systems Inc.， Mountain View, CA)处理。GydF4y2Ba

2.9。再吸收坑形成试验GydF4y2Ba在体外GydF4y2Ba使用牙本质片GydF4y2Ba

如前所述进行再吸收试验[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba]。为了确定再吸收效率，再接种于牙质片的破骨细胞被允许附着到矿化基质为四到五个小时。随后，破骨细胞或者与TAT融合肽转导或与纳米颗粒中TNF-α的存在下处理GydF4y2BaαGydF4y2Ba。继续培养12-14h检测骨吸收陷窝[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]。吸收区采用Bio-Rad共聚焦显微镜进行扫描。图像以TIF格式存储，并由Adobe Photoshop (Adobe Systems Inc.)进行处理。GydF4y2Ba

2.10条。MTT法测定细胞活力GydF4y2Ba

用线粒体脱氢酶（Sigma）测定3-（4-5-二甲基噻唑-2-基）2-5-二苯基四唑溴（MTT）盐裂解形成的蓝色甲酰胺（formazan）对细胞活力的影响。用纳米粒（NP1和NP3；150nm）或TAT融合肽（P1和P3；150nm）转染分化破骨细胞4h，进行活性测定。向各孔中加入MTT，并在37℃下孵育2小时。为停止化学反应，向孔中加入制造商提供的MTT增溶溶液。随后，按照制造商（Sigma）提供的协议中的说明，在570 nm处读取板。从空井中减去背景值，并将数据标准化为未经任何肽对肽处理的破骨细胞。每次使用3到4口井。统计显著性的测量如下所述。GydF4y2Ba

2.11。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）-StainingGydF4y2Ba

简言之，将细胞处理或用4小时的目的肽，然后用4％多聚甲醛处理，然后用PBS洗涤三次。根据由制造商提供的方案; TRAP染色用白细胞酸性磷酸酶试剂盒（387-A Sigma）中进行。染色的细胞用相差显微镜进行拍照，并且图像在Adobe Photoshop（Adobe系统公司）进行处理GydF4y2Ba

2.12。统计分析GydF4y2Ba

我们使用单向或双向方差分析，然后进行多重比较测试，以确定显著性（Graph Pad Software，Inc.，La Jolla，CA）。所有数值均表示为平均值±扫描电镜。p<0.05被认为是显著的。GydF4y2Ba

3.结果GydF4y2Ba

我们最近表明，转导TAT融合小分子量氨基末端L-丝束肽（10个氨基酸;“1MARGGydF4y2Ba小号GydF4y2BaVGydF4y2Ba小号GydF4y2Ba含有磷酸化Ser-5和Ser-7的DEE10”）有可能竞争性地抑制内源性LPL的磷酸化，从而抑制破骨细胞对NSZ的形成和吸收[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]。接着，以确定感兴趣的肽的有效吸收和释放，我们装载有从RAW 264.7鼠细胞系衍生的破骨细胞的兴趣SNT-LPL肽（NP1和NP3）使用纳米颗粒。RAW细胞源性破骨细胞已被广泛用于体外研究中的几个由于其可用性和简单的培养体系[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba，GydF4y2Ba40GydF4y2Ba-GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]。GydF4y2Ba

3.1。在RAW 264.7鼠细胞系分析中得出与SNT-LPL肽破骨细胞GydF4y2Ba

3.1.1。SNT-LPL肽的依赖于时间的吸收GydF4y2Ba

我们首先其特征RAW细胞衍生的破骨细胞是否显示出破骨细胞从鼠骨髓响应于骨颗粒和TNF-α衍生相似的特性GydF4y2BaαGydF4y2Ba[GydF4y2Ba6GydF4y2Ba，GydF4y2Ba7GydF4y2Ba]。原始细胞来源的破骨细胞在2-4小时内也显示出LPL水平随时间的增加(图2)GydF4y2Ba图1（a）GydF4y2Ba，第2和第3车道）并在之后减少（第4和第5车道）。GydF4y2Ba

3.1.2。tat融合的sNT-LPL肽的氨基酸序列GydF4y2Ba

以下TAT融合小分子量氨基末端-LPL肽（sNT-LPL；10aa）的氨基酸（aa）序列如图所示GydF4y2Ba图1（b）GydF4y2Ba：P1：含磷酸丝氨酸-5和Ser-7肽;P2：丝氨酸-5和Ser-7用Ala-5和Ala-7;P3：加扰的肽;P4：含有TAT序列的肽只有（11个氨基酸）。GydF4y2Ba

3.1.3条。sNT-LPL肽P1降低内源性LPL的磷酸化GydF4y2Ba

然后，我们证实了SNT-LPL-P1肽是否具有抑制在RAW细胞衍生的破骨细胞的内源性LPL磷酸化的电势（图GydF4y2Ba图1（c）GydF4y2Ba)。破骨细胞用所示TAT融合肽转导的4小时和裂解物进行免疫沉淀用抗体LPL（图GydF4y2Ba图1（c）GydF4y2Ba通道1 - 4)。用P2肽转导的破骨细胞裂解物与种特异性非免疫血清(NI, Lane 5)免疫沉淀。免疫沉淀物用p-丝氨酸抗体免疫印迹(图5)GydF4y2Ba图1（c）GydF4y2Ba， 最佳）。与P1转导的肽的破骨细胞中观察到内源性LPL的磷酸化甲显著抑制作用（图GydF4y2Ba图1（c）GydF4y2Ba;泳道1）与对照肽P2-P4相比（图GydF4y2Ba图1（c）GydF4y2Ba;2-4道）。与P1肽的抑制被认为是大于60％，与对照（P2-P4）相比，（图GydF4y2Ba1（e）中GydF4y2Ba)。每个免疫沉淀中LPL蛋白的水平在用LPL抗体进行分离和重吸后显示(图的底部面板)GydF4y2Ba图1（c）GydF4y2Ba)。用GAPDH抗体对总裂解物进行免疫印迹，证实免疫沉淀使用了等量的蛋白质(图2)GydF4y2Ba1（d）GydF4y2Ba)。GydF4y2Ba

这些观察结果证实了我们之前对小鼠破骨细胞的研究[GydF4y2Ba7GydF4y2Ba，GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]。因此，我们使用RAW细胞衍生的破骨细胞的系统，以进一步确认LPL肽负载PLGA-PEG纳米颗粒（NP1和NP3）上的内源性LPL磷酸化的影响，破骨细胞的肌动蛋白参与NSZs的形成重塑过程，密封环，和再吸收坑。我们使用乱序肽加载的纳米颗粒（NP3）作为对照。GydF4y2Ba

3.2。负载LPL肽的PLGA-PEG纳米颗粒的物理化学特性GydF4y2Ba

如前所述，利用双乳液技术合成了L-质体肽负载的PLGA-PEG纳米粒子（NP1和NP3）[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]. 用动态光散射法测得的纳米粒子的水动力直径，NP1和NP3分别为157±4nm和136±5nm（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)。的0.058和0.062 PDI（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)，以及较窄的尺寸分布(图GydF4y2Ba图2（a）GydF4y2Ba和GydF4y2Ba图2（b）GydF4y2Ba动态光散射分析表明，纳米粒子在溶剂中具有良好的分散性和稳定性。此外，通过TEM对纳米颗粒的成像证实了纳米颗粒的大小以及圆形颗粒的形貌(如图所示)GydF4y2Ba图2（c）GydF4y2Ba和GydF4y2Ba图2（d）GydF4y2Ba). 这两幅TEM图像的差异是由于样品中纳米粒子的浓度不同所致。此外，还用表面电荷测量了纳米颗粒的zeta电位。两种纳米颗粒的中性电荷分别为-3.6mV和-3.1MV（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)。GydF4y2Ba

3.3。纳米颗粒的肽装载和释放GydF4y2Ba

肽装载效率通过从FITC缀合的肽测量荧光评价。我们估计约5％w / w的纳米粒子肽加载（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)。然后进行肽释放研究，以量化从纳米肽的释放曲线。我们在最初3天，然后缓慢和持续释放在一段三周观察都与爆发释放的肽的双相释放曲线（图GydF4y2Ba3GydF4y2Ba)。我们还观察到P3肽的更高和完全的（100％）的释放相比，P1的。GydF4y2Ba

3.4。NP1和NP3对内源性L-Plastin磷酸化的影响分析GydF4y2Ba

然后，我们确定在骨颗粒和TNF-α的存在NP1和NP3的内源性LPL的磷酸化的影响GydF4y2BaαGydF4y2Ba分别为4h和6h(图2)GydF4y2Ba4GydF4y2Ba). 由这些破骨细胞制成的裂解物用LPL抗体免疫沉淀（图GydF4y2Ba4GydF4y2Ba，通道1-4）或非免疫血清（NI，通道5）。用p-丝氨酸抗体进行免疫印迹。如图所示GydF4y2Ba图1（c）GydF4y2Ba与P1肽，NP1证明在4小时和6小时（图上的内源性LPL的磷酸化显著抑制作用GydF4y2Ba4GydF4y2Ba与NP3(第二及第四道)相比，第4h(78%)的抑制作用高于第6h (53%)GydF4y2Ba4GydF4y2Ba;前面板)。每个免疫沉淀中LPL蛋白的水平在用LPL抗体进行分离和重吸后显示(图3)GydF4y2Ba4GydF4y2Ba;底部面板)。实验重复2次，分别在4h和6h时获得与NP1相当的抑制效果。这些研究评估了PLGA-PEG纳米颗粒(NP1)抑制内源性LPL蛋白磷酸化的效率。这些研究表明，PLGA-PEG纳米颗粒可以作为抑制破骨细胞功能的肽传递载体。GydF4y2Ba

3.5条。MTT法和TRAP染色分析细胞活力GydF4y2Ba

我们还用MTT法和trap -染色法测定了添加或不添加多肽处理后4h的细胞存活率。将264.7原始细胞分化成多核骨吸收破骨细胞后，用细胞剥离液(Sigma)缓慢去除未分化的原始细胞。随后，多核破骨细胞与很少或没有原始细胞处理如图所示GydF4y2Ba五GydF4y2Ba存在骨颗粒和TNF-GydF4y2BaαGydF4y2Ba4 h。处理4h后，MTT法检测细胞活力(见图)GydF4y2Ba5(一个)GydF4y2Ba)或对作为破骨细胞标志物的TRAP酶进行染色（图GydF4y2Ba5 (b)GydF4y2Ba). MTT法和TRAP染色显示，任何肽处理均不影响细胞存活率或形态（图GydF4y2Ba5(一个)GydF4y2Ba)。分布良好的多核成熟破骨细胞TRAP酶阳性(图)GydF4y2Ba5 (b)GydF4y2Ba)。未处理的细胞（ - ）表现出对生存力和形态与指示的肽或纳米颗粒处理的细胞类似的特性。GydF4y2Ba

3.6。多肽(P1和P3)和纳米颗粒(NP1和NP3)对体外肌动蛋白调节的影响分析GydF4y2Ba

为了进一步定义和强调丝氨酸磷酸化对肌动蛋白捆绑过程的影响，在矿化基质(骨盘)上镀破骨细胞，用罗丹明phalloidin对肌动蛋白进行4小时和12小时的NP1和NP3处理。分别用4个处理和12h处理测定NP1对NSZs和密封圈形成的抑制作用(图2)GydF4y2Ba6GydF4y2Ba)。我们使用tat融合肽(P1和P3)作为NP1和NP3的对照(图3)GydF4y2Ba6GydF4y2Ba(A))。用P1肽转导的破骨细胞显示NSZs和密封圈数量显著减少(图2)GydF4y2Ba6GydF4y2Ba（A） （A和b组）与经肽P3转导的破骨细胞（c和d组）相比。NP1和NP3处理的破骨细胞（图GydF4y2Ba6GydF4y2Ba（A） ；面板e-h）证实了用P1和P3观察到的结果（图GydF4y2Ba6GydF4y2Ba（一个）;面板A-d），分别。NSZs和密封环的数目在约75-85破骨细胞进行计数，如在图的曲线图和表中提供GydF4y2Ba6GydF4y2Ba(面板(B) - (F);n = 3)。在用P1转导或用NP1处理的破骨细胞中，nsz和密封圈的数量明显减少。这种抑制作用与对内源性LPL磷酸化的显著抑制作用相对应(图1)GydF4y2Ba4GydF4y2Ba，顶部板，泳道1）。如前所示[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]，这些肽不影响足体的组织中的破骨细胞接种于玻璃盖玻片上，并与（P1和P3）或纳米颗粒（NP1和NP3）处理（图GydF4y2Ba6GydF4y2Ba(一)、板我)。GydF4y2Ba

3.7。使用牙本质和骨吸收的标记通过免疫印迹骨吸收活性分析GydF4y2Ba

（ⅰ）骨吸收陷窝形成测定GydF4y2Ba。用P1肽转导的破骨细胞和用NP1肽转导的破骨细胞吸收凹点均显著减少(图2)GydF4y2Ba图7（a）GydF4y2Ba)与NSZ和密封圈数量减少相对应（图GydF4y2Ba6GydF4y2Ba)。测量凹坑面积，每处理3个切片收集数据。所示数据为一次实验的平均值±标准差(图2)GydF4y2Ba图7（b）GydF4y2Ba和GydF4y2Ba7 (c)GydF4y2Ba)。该散积图GydF4y2Ba7 (c)GydF4y2Ba显示每个坑的面积。一个明显的抑制是与P1或NP1处理破骨细胞明显。GydF4y2Ba

（ii）与抗体对组织蛋白酶K和TRAP的免疫印迹GydF4y2Ba。为了进一步确认是否在吸收的减少是由于具体的再吸收标志物水平的降低，我们做了免疫印迹与抗抗体组织蛋白酶K和TRAP分析（图GydF4y2Ba7 (d)GydF4y2Ba)。Western blot结果显示，所有研究组样本TRAP表达在37kDa左右，Cathepsin K表达在24kDa左右，均为单条带表达，各组间TRAP或Cathepsin K的表达水平无显著差异(图)GydF4y2Ba7 (d)GydF4y2Ba；车道1-5）。GydF4y2Ba

4。讨论GydF4y2Ba

用NP1获得的结果不仅显示了破骨细胞对NPs的摄取，而且还显示了所感兴趣的肽的传递和生物学效应。用NP1得到的结果与tat -熔融P1肽的结果一致。聚合物纳米颗粒已被广泛应用于受控递送、生物降解性、生物相容性、表面修饰的方便性，以及其递送大范围有效载荷的能力[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba，GydF4y2Ba三十GydF4y2Ba，GydF4y2Ba45GydF4y2Ba-GydF4y2Ba50GydF4y2Ba]. PLGA-NP作为多肽载体在小鼠和大鼠体内均能引起强烈的反应[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba，GydF4y2Ba49GydF4y2Ba，GydF4y2Ba51GydF4y2Ba，GydF4y2Ba52GydF4y2Ba]. 这些研究结果显示破骨细胞分化受到抑制或破骨细胞骨吸收所需的信号通路受到抑制[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba，GydF4y2Ba48GydF4y2Ba，GydF4y2Ba53GydF4y2Ba]。尽管如此，还需要更多的研究来改善骨质疏松症的治疗，因为全世界有超过2亿人的骨质流失。确定不同的靶向治疗和持续给药是降低破骨细胞分化或功能的关键。在这里，我们发现NP1对破骨细胞粘附牙本质表面没有影响，但抑制了密封圈的形成。我们的研究结果表明，以plga为基础的纳米载体作为LPL肽的递送系统，在小鼠模型体内抑制破骨细胞功能具有很大的潜力。持续释放多肽数天，可避免每天给小鼠注射多肽。GydF4y2Ba

虽然有几种靶向疗法是目前可用于治疗和/或预防骨质疏松症通过阻断破骨细胞活性，有证据表明，长期治疗导致成骨细胞介导的骨形成的减少，导致骨骼非典型骨折[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba，GydF4y2Ba54GydF4y2Ba]。理想的治疗方案是在不干扰成骨细胞驱动的骨形成的情况下损害破骨细胞功能。我们最近发现，tat融合的LPL肽不能抑制成骨细胞形成骨。成骨细胞中表达的是质体3而非LPL(即质体2)。在小鼠中，质体素3的突变导致骨质疏松。这表明了在成骨细胞和非破骨细胞中，plastin 3的作用[GydF4y2Ba55GydF4y2Ba]。P1肽抑制骨吸收而非骨形成，强调了LPL在破骨细胞肌动蛋白重塑中的重要性[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]。这里，我们发现形成NSZs的，密封环，以及骨吸收陷窝的衰减与NP1和不NP3治疗破骨细胞验证了参与NSZs形成肌动蛋白调制的调控LPL磷酸化的重要性。这些观察表明，肽负载PLGA纳米颗粒（NP1和NP3）（A）对破骨细胞分化的无毒性的NP对生存力或粘附，因为破骨细胞显示周podosomal结构没有影响;（b）是生物活性的。NP1的生物活性性质是在以竞争方式的内源性LPL的磷酸化的抑制表观;因此NSZs的由破骨细胞的形成，密封环，和再吸收减少。然而，这些变化不与NP3（原理图图观察GydF4y2Ba8GydF4y2Ba)。我们已经确定在破骨细胞的LPL一个新的调控作用。这似乎在肌动蛋白捆绑参与NSZs的形成过程中不可缺少的过程。GydF4y2Ba

骨丢失的治疗主要依赖于使用阻断破骨细胞骨吸收的药物(例如，二膦酸盐、雌激素、血清素和降钙素)。雌激素缺乏与破骨细胞活化增加、成骨细胞功能下降、炎症性骨吸收细胞因子如白介素-6 (IL-6)和TNF-增加有关GydF4y2BaαGydF4y2Ba. 雌激素替代疗法（ERT）对绝经后妇女的骨丢失有明显的降低作用，但其使用后乳腺癌风险增加和其他副作用仍然引起关注。抗肿瘤坏死因子也能控制骨丢失-GydF4y2BaαGydF4y2Ba治疗。不幸的是，只有病人数量有限顺应这种治疗[GydF4y2Ba56GydF4y2Ba-GydF4y2Ba59GydF4y2Ba]。最近的研究表明，全身抗TNF-αGydF4y2BaαGydF4y2Ba治疗通过减少骨吸收的不同机制防止小鼠骨丢失。然而，有报道称其存在一些缺点，包括治疗费用、免疫反应抑制和神经症状的出现[GydF4y2Ba60GydF4y2Ba]。我们已经使用了传统的破骨细胞培养模型系统，以提供用于使用PLGA-PEG-NP1作为破骨细胞介导的骨损失的抗吸收的治疗替代了良好的理由（图GydF4y2Ba8GydF4y2Ba)。GydF4y2Ba

本文的重要局限性在于GydF4y2Ba在活的有机体内GydF4y2Ba研究的动物模型。为了推动这一目标，我们未来的研究将集中在SNT-LPL肽对骨骼老化重塑其证明骨质流失的影响和卵巢切除的小鼠模型。然而，对于每日注射的肽处理小鼠是具有挑战性的。因此，我们认识到发展的持续肽释放系统的重要性。控制和持续释放药物已被公认为最先进的研究领域之一，和几个策略已经用于实现这样的系统。涂覆有纳米颗粒的PEG已显示降低血液中的吞噬作用和补体激活，以及延长循环时间[GydF4y2Ba51GydF4y2Ba，GydF4y2Ba61GydF4y2Ba-GydF4y2Ba63GydF4y2Ba]。我们认为，这种纳米治疗肽设计将提供新的途径，目标肌动蛋白参与了破骨细胞的骨吸收调制不影响破骨细胞的存活和粘附到骨表面GydF4y2Ba在活的有机体内GydF4y2Ba. 由于成骨细胞不表达LPL，sNT-LPL肽似乎是一种新的类肽治疗骨丢失的方法GydF4y2Ba在活的有机体内GydF4y2Ba。GydF4y2Ba

5.结论GydF4y2Ba

我们评估了肽负载PLGA纳米颗粒作为肽模拟物的透视系统地减少破骨细胞功能，而不会影响podosome组件或粘附。在NSZs和密封环的形成的减少可以与破骨细胞转导的与P1或NP1处理的骨吸收活性的降低来连接好。P1或NP1对骨吸收标记物的表达没有抑制作用。我们相信，装载了LPL肽纳米粒子可能提供影响破骨细胞活性的药物递送系统的发展有前途的基础。从PLGA纳米粒子释放肽具有在通过减少LPL的磷酸化减少破骨细胞的细胞骨架重组和骨吸收的生物学活性。针对LPL是我们的，因为它在密封环形成的早期阶段，这是破骨细胞的骨吸收关键作用的根本利益。这些GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba这一发现对于即将进行的体内研究（衰老和去卵巢）显示骨丢失的小鼠模型至关重要。GydF4y2Ba

缩写GydF4y2Ba

ABP:GydF4y2Ba	Actin-binding蛋白质GydF4y2Ba
RANKL：GydF4y2Ba	NF-受体激活剂GydF4y2BaκGydF4y2Ba配基GydF4y2Ba
M-CSF：GydF4y2Ba	巨噬细胞集落刺激因子GydF4y2Ba
LPL:GydF4y2Ba	L-PlastinGydF4y2Ba
SNT-LPL：GydF4y2Ba	小分子量的氨基末端L-丝束肽GydF4y2Ba
NT-LPL:GydF4y2Ba	氨基末端L-质体蛋白肽GydF4y2Ba
TNF-αGydF4y2BaαGydF4y2Ba：GydF4y2Ba	肿瘤坏死因子GydF4y2Ba
答:GydF4y2Ba	与转化特性反式激活肽GydF4y2Ba
解放军：GydF4y2Ba	聚（L-丙交酯）酸GydF4y2Ba
PLGA：GydF4y2Ba	聚（L-丙交酯GydF4y2Ba合作GydF4y2Ba乙醇酸)GydF4y2Ba
PCL：GydF4y2Ba	聚己内酯€GydF4y2Ba
新产品1：GydF4y2Ba	纳米颗粒中含有P1肽GydF4y2Ba
NP3：GydF4y2Ba	纳米颗粒装载有P3肽GydF4y2Ba
BMP-2:GydF4y2Ba	骨形态发生蛋白-2GydF4y2Ba
挂钩:GydF4y2Ba	聚乙二醇GydF4y2Ba
NSZs：GydF4y2Ba	新生的密封区。GydF4y2Ba

数据可用性GydF4y2Ba

用于支持该研究结果的数据包括在项目之内。GydF4y2Ba

附加分GydF4y2Ba

突出了GydF4y2Ba。（ⅰ）加载有小分子量肽（抑制（P1）和控制（P3））L-丝束的可生物降解的PLGA-PEG纳米颗粒（N）证明了在体外的破骨细胞的成功细胞摄取和释放GydF4y2Ba。GydF4y2Ba（ii）从NP1释放的抑制性肽P1降低显著通过体外破骨细胞的密封环，并因此牙本质基质的再吸收的形成。（ⅲ）结果强烈支持使用该纳米颗粒的策略作为治疗骨损失的可能性。GydF4y2Ba

利益冲突GydF4y2Ba

所有作者声明他们没有利益冲突。GydF4y2Ba

作者的贡献GydF4y2Ba

Sunipa马宗达和Aniket S. Wadajkar同等贡献这项工作。GydF4y2Ba

致谢GydF4y2Ba

作者非常感谢由约瑟夫博士Mauban（经理）在共聚焦核心设施和汝清博士（医学中心生物医学创新资源，马里兰州巴尔的摩的马里兰大学），她在TEM拍摄辅助提供的技术援助纳米粒子（经理，电子显微镜中心实验室，牙科马里兰大学）。这项工作是由美国国立卫生研究院对米纳克什Chellaiah（5R01AR066044）和安东尼·金（R37CA218617）研究经费由美国癌症学会院校研究格兰特Aniket S. Wadajkar支持和（IRG-97-153-10）。GydF4y2Ba

工具书类GydF4y2Ba

1. S. L.泰特鲍姆，X.曹，H.三村，M.千叶，和F. P.罗斯，“蜂窝和骨吸收的分子机制，”GydF4y2Ba矿物质和电解质代谢紊乱GydF4y2Ba卷。21，没有。1-3，第193-196，1995。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
2. 《破骨细胞与整合素》，S. L. Teitelbaum，GydF4y2Ba科学纽约科学院年鉴GydF4y2Ba，第1068卷，编号1，第95-99页，2006。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
3. I. R.赫斯特，J.佐，J.姜和L. S.霍利迪，“肌动蛋白相关蛋白2/3复合体所需的肌动蛋白环的形成，”GydF4y2Ba中国骨与矿物质研究的GydF4y2Ba，第19卷，no。3，第499-506，2004。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
4. S、 Batsir，B.Geiger和Z.Kam，“培养破骨细胞封闭区的动力学”GydF4y2Ba骨架GydF4y2Ba，第74卷，否。2，第72-81，2017年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
5. D、 Georges，I.Machuca Gayet，A.Blangy和P.Jurdic，“足体组织驱动破骨细胞介导的骨吸收”GydF4y2Ba细胞黏附和迁移GydF4y2Ba，第8卷第1期。3，第192-204，2014。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
6. T. Ma, K. Sadashivaiah和M. A. Chellaiah，《破骨细胞中L-plastin和corn对密封圈形成的调节》GydF4y2Ba生物化学杂志GydF4y2Ba，第285卷，no。39页，29911-29924,2010。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
7. M. A. Chellaiah，T.马和S.马宗达“ L-丝束磷酸化调节由肌动蛋白在小鼠的破骨细胞捆绑过程的密封环形成的早期阶段，”GydF4y2Ba实验细胞研究GydF4y2Ba卷。372，没有。1，第73-82，2018。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
8. S. G.巴布，P.松平，M.佐藤，I.科雷亚，和S.-S.廉，“在丝束单核细胞来源的破骨细胞足体”GydF4y2Ba细胞运动性和细胞骨架GydF4y2Ba，第37卷，no。4、308-325页，1997。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
9. M. A. Chellaiah, S. Majumdar和H. Aljohani，“在体外，L-plastin的类肽抑制剂降低破骨细胞的吸收活性，但不降低成骨细胞的骨形成活性。”GydF4y2BaPLoS.ONEGydF4y2Ba卷。13，文章ID e0204209，2018。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
10. C、 —S.Lin，A.Lau和T.F.Lue，“质体蛋白磷酸化的分析和定位”GydF4y2BaDNA与细胞生物学GydF4y2Ba，第17卷，第12期，第1041-10461998页。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
11. “肌动蛋白结合蛋白L-plastin支持t细胞运动和激活，”GydF4y2Ba免疫学检查GydF4y2Ba卷。256，没有。1，第48-62，2013。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
12. t.p. Stossel, J. conis, L. Cooley等人，“丝状蛋白作为细胞力学和信号传导的集成商，”GydF4y2Ba《自然》杂志回顾了分子细胞生物学GydF4y2Ba，第2卷第2期2，第138-145页，2001。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
13. 人T细胞l -胞浆素以钙依赖方式捆绑肌动蛋白丝，GydF4y2Ba生物化学杂志GydF4y2Ba卷。112，没有。4，第503-507，1992。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
14. S. C.莫利，“肌动蛋白集束蛋白L-丝束：免疫细胞功能的关键调节剂，”GydF4y2Ba国际细胞生物学杂志GydF4y2Ba， 2012年卷，文章ID 935173, 10页，2012年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
15. H、 Chen，A.Mocsai，H.Zhang等人，“质体在宿主防御中的作用区分整合素信号与细胞粘附和扩散。”GydF4y2Ba免疫GydF4y2Ba，第19卷，no。1，页95-104,2003。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
16. S. L. Jones和E. J.布朗，“FcgammaRII介导的粘附和吞噬作用诱导人嗜中性粒L-丝束磷酸化，”GydF4y2Ba生物化学杂志GydF4y2Ba卷。271，没有。24，第14623-14630，1996。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
17. E.福伦，P. McWilliam，D.凯莱赫，D.T。克罗克，和A.龙，“在结肠癌细胞中E-钙粘蛋白表达的蛋白质白细胞L-网诱导增殖，侵袭和损失，”GydF4y2Ba国际癌症杂志GydF4y2Ba，第118卷，否。8、2098-2104页，2006。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
18. M.五德阿鲁达，S.沃森，C.-S.林，J.里维特和P.松平，“丝束蛋白是细胞质磷蛋白丝束的同源物并具有同源性钙调蛋白和肌动蛋白的蛋白质凝胶化结构域，”GydF4y2Ba在细胞生物学杂志GydF4y2Ba卷。111，没有。3，第1069-1079，1990。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
19. S. L.琼斯，J.王，C. W.图尔克和E. J.布朗，“一种在白细胞整合功能的调节肌动蛋白捆绑蛋白L-网的作用，”GydF4y2Ba美国国家科学院院刊GydF4y2Ba，第95卷，第16期，第9331-93361998页。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
20. A、 S.Wadajkar，J.G.Dancy，N.B.Roberts等人，“降低非特异性粘附性，受体靶向（DART）纳米颗粒在侵袭性胶质瘤中表现出更好的分散性、细胞摄取和肿瘤保留。”GydF4y2Ba控制释放杂志GydF4y2Ba卷。267，第144-153，2017。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
21. A. Tautzenberger，L. Kreja，A.泽勒等人，“直接和对人类破骨细胞的形成和活性官能荧光标记的纳米颗粒的间接影响，”GydF4y2Ba生物材料GydF4y2Ba，第32卷，第6期，第1706-17142011页。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
22. A. Tautzenberger, A. Kovtun，和A. Ignatius，“纳米颗粒及其在骨骼中的应用潜力，”GydF4y2Ba国际纳米医学杂志GydF4y2Ba卷。7，第4545-4557，2012。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
23. C.危害，K.赫尔姆斯，T. Taschner等人，“在以负重缺陷纳米骨水泥的成骨能力的羊胫骨干骺端，”GydF4y2Ba国际纳米医学杂志GydF4y2Ba，第7卷，第2883-2889页，2012年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
24. S. C.李，M.乳木果，M.A.对战等人，“在大鼠股骨的大节段性缺损愈合是由的rhBMP-2在PLGA基质的帮助下，”GydF4y2Ba生物医学材料研究杂志B辑：应用生物材料GydF4y2Ba，第28卷，编号第1149-1156页，1994。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
25. 陈，刘，李，谭，张，“一种新的促进骨折愈合的生长因子控制药物释放系统:重组人骨形态发生-2和聚乳酸纳米球”GydF4y2Ba纳米科学与纳米技术杂志GydF4y2Ba卷。11，没有。4，第3107-3114，2011。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
26. A. E.梅尔卡，J.马，X. He和E.贾巴里，“释放特性和重组人骨形态发生蛋白2接枝到新颖的自组装的聚（丙交酯 - 共 - 乙富马酸酯）纳米颗粒的成骨活性，”GydF4y2Ba控制释放杂志GydF4y2Ba卷。140，没有。2期，第148-156，2009。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
27. R.巴伦，S.法拉利和R. G.罗素，“去甲氧基膦酸盐和二膦酸盐:不同的作用机制和效果，”GydF4y2Ba骨GydF4y2Ba，第48卷，no。4、第677-692页，2011。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
28. V. Samanna, T. Ma, T. W. Mak, M. Rogers和M. A. Chellaiah，“肌动蛋白聚合调节CD44表面表达、MMP-9激活和破骨细胞功能，”GydF4y2Ba杂志细胞生理学GydF4y2Ba卷。213，没有。3，第710-720，2007。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
29. 聚(d,l-丙交酯-羟基乙酸)纳米颗粒与阿仑膦酸盐的生物相容性，"GydF4y2Ba生物材料GydF4y2Ba，第29卷，no。10，第1400至1411年，2008年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
30. E、 Cenni，S.Avnet，D.Granchi等人，“聚（D，L-丙交酯-co-乙交酯）-阿仑膦酸盐结合纳米粒子对人破骨细胞前体的影响，”GydF4y2Ba杂志生物材料科学，聚合物版GydF4y2Ba卷。23，没有。10，第1285年至1300年，2012。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
31. D.李，D. N.许，H. Kim等人，“破骨细胞分化和抑制骨吸收由双膦酸盐缀合的金纳米粒子，”GydF4y2Ba科学报告GydF4y2Ba卷。6，没有。1，文章没有27336年，2016年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
32. B. A. Lenart, D. G. Lorich和J. M. Lane，“服用阿仑膦酸钠的绝经后妇女股骨干非典型骨折”GydF4y2Ba新英格兰医学杂志GydF4y2Ba，第358卷，第12期，第1304-13062008页。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
33. “非典型转子下和骨干股骨折:美国骨与矿物研究学会专题小组报告”，E. Shane, D. Burr, P. R. Ebeling et al.，GydF4y2Ba中国骨与矿物质研究的GydF4y2Ba卷。25，页。2267年至2294年，2010。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
34. D、 E.Sellmeyer，“非典型骨折作为长期双膦酸盐治疗的潜在并发症，”GydF4y2Ba美国医学会杂志GydF4y2Ba，第304卷，no。13页，1480-1484,2010。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
35. A.古普塔，B. S.李，M.A. Khadeer等人，“Leupaxin是在破骨细胞的粘附力区的一个关键衔接蛋白，”GydF4y2Ba中国骨与矿物质研究的GydF4y2Ba，第18卷，第4期，第669-6852003页。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
36. M. Chellaiah和K. Hruska的，“骨桥蛋白的凝溶胶蛋白能刺激磷酸肌醇相关水平和磷脂酰肌醇3-激酶的羟基”GydF4y2Ba细胞的分子生物学GydF4y2Ba卷。7，没有。5，第743-753，1996。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
37. M、 Chellaiah、C.Fitzgerald、U.Alvarez和K.Hruska，“C-GydF4y2Basrc公司GydF4y2Ba需要刺激明胶相关的PI3-K，”GydF4y2Ba生物化学杂志GydF4y2Ba卷。273，没有。19，第11908-11916，1998。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
38. M、 A.Chellaiah，N.Soga，S.Swanson等人，“Rho-A对破骨细胞胞体组织、运动和骨吸收至关重要，”GydF4y2Ba生物化学杂志GydF4y2Ba，第275卷，不。16，页11993-12002,2000。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
39. M. Chellaiah, N. Kizer, M. Silva, U. Alvarez, D. Kwiatkowski，和K. A. Hruska，GydF4y2Ba在细胞生物学杂志GydF4y2Ba卷。148，没有。4，第665-678，2000。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
40. P、 Collin Osdoby和P.Osdoby，“RANKL介导的小鼠原始264.7细胞破骨细胞形成”GydF4y2Ba分子生物学方法GydF4y2Ba卷。816，第187-202，2012。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
41. M.企业荣誉，I.劳里亚，C. Dabhi，S.康德，R. E. Leube和H.菲舍尔，“上的生物活性玻璃周期微结构表面增强人体间充质基质细胞的成骨分化，促进在体外的破骨细胞，”GydF4y2Ba生物医学材料研究的一个部分GydF4y2Ba，第106卷，no。7、1965-1978年，2018年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
42. R、 Detsch，M.Rübner，P.L.Strissel等人，“纳米生物活性玻璃激活原始264.7细胞的破骨细胞分化”GydF4y2Ba纳米医学GydF4y2Ba卷。11，没有。9，第一○九三年至1105年，2016。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
43. 张，张，Dissanayaka等，“储存介质通过不依赖rankl信号增强人类牙周韧带细胞的破骨细胞潜能，”GydF4y2Ba牙创伤学GydF4y2Ba，第29卷，第1期，第59-65页，2013年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
44. M. J.金，J.-S.公园，S. J. Lee等人，“Notch1的靶向用于治疗类风湿性关节炎治疗的siRNA递送纳米颗粒，”GydF4y2Ba控制释放杂志GydF4y2Ba，第216卷，第140-148页，2015年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
45. W.金，金J.，H Park等人，“铂纳米颗粒通过减少破骨细胞减少卵巢切除引起的骨质流失，”GydF4y2Ba实验与分子医学GydF4y2Ba卷。44，没有。7，第432-439，2012。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
46. A.五Prakapenka，H. A. Bimonte-纳尔逊和R. W. Sirianni，“工程聚（乳酸 - 共 - 乙醇酸）（PLGA）微米和纳米载体为17-β-雌二醇的受控递送，”GydF4y2Ba生物医学工程年报GydF4y2Ba卷。45，没有。7，第1697年至1709年，2017年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
47. G. R.贝克小，S.-W.厦，C. E. Camalier等人，“生物活性基于二氧化硅的纳米颗粒刺激骨形成成骨细胞，抑制骨再吸收的破骨细胞，和在体内增强骨矿物质密度，”GydF4y2Ba纳米医学:纳米技术、生物学和医学GydF4y2Ba，第8卷第1期。2012年第793-803页。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
48. M、 N.Weitzmann，S.-W.Ha，T.Vikulina，S.Roser Page，J.-K.Lee和G.R.Beck，“生物活性二氧化硅纳米颗粒逆转小鼠年龄相关性骨丢失”GydF4y2Ba纳米医学:纳米技术、生物学和医学GydF4y2Ba卷。11，没有。4，第959-967，2015。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
49. I. Takeuchi, S. Kobayashi, Y. Hida，和K. Makino，“装载雌二醇的PLGA纳米颗粒用于改善骨质疏松引起的松质骨的低骨密度:离子透入增强带电纳米颗粒的应用，”GydF4y2Ba胶体和表面B：生物界面GydF4y2Ba，第155卷，第35-40页，2017年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
50. H、 Geng，Y.-N.Chang，X.Bai等人，“富勒烯纳米颗粒通过抑制分化和成熟抑制RANKL诱导的破骨细胞生成，”GydF4y2Ba纳米级GydF4y2Ba，第9卷第1期第34页，12516-12523页，2017。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
51. Ma, M. Chen, S. Kaushal等人，“PLGA纳米颗粒介导的肿瘤抗原肽传递引发有效的免疫反应，”GydF4y2Ba国际纳米医学杂志GydF4y2Ba，第7卷，第1475-1487页，2012年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
52. Y.哈加格，Y.阿卜杜勒瓦哈卜，O.大椎等人，“制备和体内胰岛素加载的可生物降解的纳米颗粒的评价从PLGA和PEG的二嵌段共聚物制备，”GydF4y2Ba国际药物杂志的GydF4y2Ba，第499卷，没有。1-2页，236-246,2016。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
53. O. Sul, J. Kim, T. Kyung等人，“金纳米颗粒作为一种抗氧化剂，抑制核因子-kappab配体(RANKL)诱导的破骨细胞形成的受体激活物，”GydF4y2Ba生物科学、生物技术和生物化学GydF4y2Ba，第74卷，否。11，页2209-2213,2014。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
54. J、 W.Nieves和F.Cosman，“不典型的转子下和股骨干骨折及可能与双膦酸盐的关系，”GydF4y2Ba目前骨质疏松症的报告GydF4y2Ba，第8卷第1期。1，第34-39页，2010。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
55. “PLS3突变引起的骨质疏松症:临床和骨组织特征，”GydF4y2Ba中国骨与矿物质研究的GydF4y2Ba，第29卷，no。8，第一八○五年至1814年，2014。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
56. I.哈姆里克，问：曹D. Agbafe莫斯利和D. M.卡明斯，“绝经后妇女骨质疏松症的医疗差距。”GydF4y2Ba妇女健康杂志GydF4y2Ba卷。21，没有。12，第1232至1236年，2012。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
57. G.苏格兰，N沃，P.罗伊尔，P.麦克纳米R.亨德森和R.霍利克，“诺单抗用于绝经后妇女预防骨质疏松性骨折：一个很好的单一的技术鉴定，”GydF4y2Ba药物经济学GydF4y2Ba，第29卷，no。11，第951-961页，2011。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
58. M. N.魏茨曼和R. Pacifici，“雌激素缺乏和骨损失：炎性故事，”GydF4y2Ba临床研究杂志GydF4y2Ba，第116卷，第5期，第1186-11942006页。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
59. C. Roggia，C. Tamone，S.桑西，R. Pacifici，和G. C. ISAIA，“TNF-α的作用GydF4y2BaαGydF4y2Ba在雌激素缺乏引起的骨质流失中产生t细胞"GydF4y2Ba密涅瓦本草GydF4y2Ba卷。95，没有。2，第125-132页，2004年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
60. N、 Charatcharoenwitthaya，S.Khosla，E.J.Atkinson，L.K.mccread和B.L.Riggs，“阻断肿瘤坏死因子的作用-GydF4y2BaαGydF4y2Ba白介素-1对绝经后早期妇女骨吸收的作用"GydF4y2Ba中国骨与矿物质研究的GydF4y2Ba卷。22，没有。5，第724-729，2007。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
61. J、 -C.Olivier，“靶向纳米粒将药物转运至大脑”GydF4y2Ba神经疗法GydF4y2Ba，第2卷第2期1，第108-119，2005。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
62. Bhadra, S. Bhadra, P. Jain，和N. K. Jain， " Pegnology: PEG-ylated systems综述，"GydF4y2Ba模具PharmazieGydF4y2Ba，第57卷，第1期，第5-29页，2002年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
63. R. Singh和J. W.利拉德小，“基于纳米粒子的靶向给药”GydF4y2Ba实验与分子病理学GydF4y2Ba，第86卷，no。3，页215-223,2009。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

版权GydF4y2Ba

版权所有©2019 Sunipa Majumdar等人。这是下发布的开放式访问文章GydF4y2Ba知识共享署名许可GydF4y2Ba允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，只要正确地引用了原文。GydF4y2Ba