人类IL-23诱饵受体抑制t细胞通过基因工程生产IL-17间充质干细胞

文摘

人类的免疫调节和self-renewable特性脂肪间充质干细胞(hAD-MSCs)马克他们在再生医学的重要性。23白介素(IL - 23)作为一种促炎细胞因子抑制T调节细胞(Treg)和促进T辅助的反应17 (Th17)和辅助T 1 (Th1细胞)。这种途径开始在几个自身免疫性疾病炎症和免疫抑制。当前的研究生产重组IL - 23诱饵受体(瑞来斯- 23 r)使用hAD-MSCs适合体外细胞减少炎症在自身免疫性疾病基因治疗的目的。从lipoaspirate hAD-MSCs被隔离,然后分化的特征。瑞来斯- 23 r设计和克隆到pcdh - 813 - 1慢病毒载体。执行hAD-MSCs转导的莫伊(感染复数)= 50 pCDH——EFIα瑞来斯- 23 r PGK copGFP。瑞来斯的表情——23 r和octamer-binding转录因子4(10月- 4)是由实时聚合酶链反应(实际time-PCR)。自我更新的属性与10月- 4化验。生物活性的设计瑞来斯- 23 r评估了IL - 17和IL - 10的表达小鼠脾细胞。细胞分化证实从lipoaspirate hAD-MSCs真正的隔离。限制酶消化和测序验证成功的克隆CD813A-1瑞来斯- 23 r的慢病毒载体。绿色荧光蛋白(GFP)积极传导率为90%,和实时PCR显示RIL-23R的表达水平。Oct-4有着相似的表达模式与nontransduced hAD-MSCs和转导hAD-MSCs / RIL-23R表明慢病毒载体并不影响hAD-MSCs特征。Downregulation IL-17和upregulation il - 10的工程hAD-MSCs显示正确的活动。结果表明,转导hAD-MSCs /瑞来斯- 23 r,表达IL-23诱饵受体,可以提供一个有用的方法为基础研究细胞基因治疗自身免疫性疾病。

1。介绍

间充质干细胞(msc)是成人干细胞能够分化成mesoderm-lineage细胞,包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞。他们以附件塑料文化船只和能力来表达CD44, CD73, CD90、和CD105但不是CD45、CD34、CD14细胞表面标记(1]。许多研究发现,msc hypoimmunogenic和免疫调节特性,允许他们通过修复受损组织和发起愈合过程(2- - - - - -4]。这些特征的msc支持的想法创造转基因msc可以结合的最佳选择不同形式的细胞和基因疗法治疗自身免疫性疾病(5- - - - - -10]。

其中,Adipose-MSCs (AD-MSCs)是一个丰富的msc治疗的目的是脂肪组织容易和大量AD-MSCs易得的11- - - - - -13]。目前,AD-MSCs临床申请再生治疗和伤口愈合14,15]。因此,能力的人类骨髓间充质作为车辆脂肪细胞基因治疗是有前途的16- - - - - -19]。

自身免疫性疾病是多因素促发的障碍与复杂的免疫系统失调由免疫细胞因子和免疫细胞(20.]。IL - 23属于家庭白介素扮演着积极的角色记忆1 T辅助细胞增殖。杂的化学IL - 23受体构成特定的(IL12R (IL23A)和普遍β1)单元(21]。转化生长因子β(TGF -β)和il - 6在大多数的自身免疫性疾病可以引起Th17细胞分泌越来越IL-23和IL-17 [22]。IL-23能够抑制Treg细胞并促进Th17和Th1细胞的反应,开始在一些自身免疫性炎症和免疫抑制和炎性疾病23]。基于强有力的证据,IL - 23 / IL - 17轴对慢性炎症的发展很重要24]。最近的研究认为IL-23的抑制,IL-23R或IL-23 / IL-17轴可能是自身免疫性疾病的治疗靶点[25]。然而,没有特定的治疗抑制IL-23促炎反应。

针对IL-23p19,但不是IL-12p40基因敲除研究表明,减少炎症反应和抗不同的自身免疫性疾病是由于缺乏IL-17-producing t细胞(即。,Th17细胞)26]。

根据先前的研究,广泛的可变剪接对IL - 23 r基因转录(27]。代的IL - 23 rΔ9形式(基因库AM990318),编码可溶性版本的整个外部域的特定受体链(IL23A),是一个这样的例子拼接28]。绑定后人类IL - 23在溶液中,这种可溶性诱饵受体依赖性抑制STAT3磷酸化和功能成熟的人类Th17细胞体外(29日]。

免疫抑制功能的基础上hAD-MSCs RIL-23R,他们可以合作改善免疫调节,防止启动炎症和自身免疫性疾病。当前报告第一例hAD-MSCs RIL-23R基因转导。本研究成功转导hAD-MSCs重组白介素23 r-harbouring慢病毒颗粒和评估的表达在转导hAD-MSCs RIL-23R time-PCR。还分析了RIL-23R生物活性和这对t细胞细胞因子的影响。

2。材料和方法

2.1。从人类脂肪组织分离间充质干细胞

Lipoaspirate样本用磷酸盐(PBS)包含3 X青霉素、链霉素和两性霉素三次。添加脂肪组织是dispase (50 u /毫升)/胶原酶(250 u /毫升)(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州),其次是摇晃的30分钟37°C,然后在1500转离心。暂停后镀细胞分布于烧瓶αmem(最低基本媒介eagle-alpha修改)含10%胎牛血清(的边后卫)三天。

2.2。克隆瑞来斯- 23 r cDNA慢病毒载体

IL-23可溶性形式,IL-23RΔ9(基因库AM990318),合成一个完整版本的外部域受体连锁(可变剪接产品)的设计和放大pORF质粒(加拿大安大略省Biomatik、剑桥)使用的正向引物5′ACAACAGCTCGGCTTTGGTAT 3′,和反向引物的5′TACTGGCAGCCTTGGAGTTC 3′。

RIL-23R-pORF-For合成GFP-harboring慢病毒粒子的消化(LvGFP) GFP-carrying向量被EcorV消化和Sal1 cDNA subcloned成pCDH813A-1(系统生物科学、山景、钙、美国)向量(pCDH-EF-1重组α瑞来斯- 23 r-pgk-copgfp)。

2.3。生成、浓度和重组慢病毒的滴定

重组慢病毒是根据前一个协议(30.,31日]。总之,质粒的转染1×10⁶hek - 293 t细胞是基于磷酸钙法(21μg(慢病毒涉及pCDH RIL-23R-copGFP, 21岁μ10.5 g的包装质粒psPAX2,μ每10厘米克信封质粒板)。慢病毒颗粒的上层清液中包含HEK - 293 T细胞收集36,48岁,60岁,72小时posttransfection然后通过一个0.45μm过滤器。慢病毒颗粒的浓度过程执行根据降水方法使用50% peg - 8000 (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)达成最终浓度为5%。浓度与生理盐水持续5米(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在一夜之间实现最终浓度为0.15 M, 6×10⁴HEK - 293 t细胞被镀成滴定板,其次是转导和1、4和16μ我的病毒。三天的潜伏期后,细胞分离和流式细胞术分析细胞荧光。

2.4。转导的hAD-MSCs

第二段hAD-MSCs使胰蛋白酶化,被播种在6 -孔板的密度为1×105细胞1毫升DMEM-F12。病毒颗粒(MOI = 50)添加连同6μ克/毫升的聚凝胺(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼),其次是摇晃旋转在5 rpm 18个小时。中被DMEM-F12再次。流式细胞术应用于计算GFP-positive转导hAD-MSCs在72小时后转导和数据分析BD Accuri c6软件。

2.5。Charachterization正常/转导hAD-MSCs分化、流式细胞术和CFU-F化验

在这一步中,2×10⁴细胞/毫升的第三段瑞来斯- 23 r-transduced hAD-MSCs 6-well板和hAD-MSCs倒。孵化了αmem含有10%的边后卫,直到达到融合。中被重新成骨的介质组成的DMEM拥有10 nM的地塞米松(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),50μ抗坏血酸2-phosphate g / ml (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),和10毫米β甘油磷酸(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。行动是完成三周的每周两次。接下来,细胞用10%福尔马林固定10分钟和茜素红染色(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在室温下2分钟。在脂肪生成,第三段RIL-23R-transduced hAD-MSCs和hAD-MSCs细胞被孵化的分化培养基含有DMEM和50μ吲哚美辛的g / ml (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和100 nM地塞米松(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。媒介是三周更新每周两次。与0.5%油红O染色进行细胞(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在甲醇在室温下2分钟。

细胞的胰蛋白酶化后第三通道是由0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA。洗两次继续使用PBS,染色是基于制造商的指令运行流式细胞术。antibody-labeled细胞的抗体(e-Bioscience) (1]:PE-conjugated鼠标反CD11b PE-conjugated鼠标反CD34, PE-conjugated鼠标反CD45 PE-conjugated鼠标反CD105和反CD73 PE-conjugated老鼠。PE-conjugated鼠标IgG1 FITC-conjugated鼠标IgG2, PE-conjugated鼠IgG2被认为是同形像控制。孵化细胞悬浮液与PBS冲洗丢弃任何标记抗体,紧随其后的是悬挂在PBS的标记细胞。分析是由FACScan流式细胞分析仪(圣地亚哥,正欲、钙、美国)。数据分析BD Accuri c6软件。

细胞的自我更新的功能可以通过克隆形成评估unit-fibroblast (CFU-F)测定。1 x10³细胞在第三段被播种在10厘米菜肴。培养2周后,这些细胞被洗PBS和沾0.5%结晶紫(σ- - - - - -奥尔德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)在室温下5分钟。彩色殖民地。

2.6。在正常/转导hAD-MSCs具备干细胞标记表达式

的表达OCT-4 sox2, Nanog,原癌基因在hAD-MSCs和转导hAD-MSCs rt - pcr检查。GAPDH表达式是内生参考基因。

2.7。瑞来斯- 23在正常/转导hAD-MSCs r表达

瑞来斯- 23 r hAD-MSCs和转导hAD-MSCs表达进行了研究。GAPDH表达式是内生参考基因。Qiazol裂解试剂(阿拉米达、钙、美国)用于分离细胞总RNA。标准反转录的反应是通过使用5μ18 g总RNA的低聚糖(dT)作为底漆根据制造商的指示的互补脱氧核糖核酸合成装备(Fermentas)。额外的PCR组件是2.5μl (cDNA、1 X PCR缓冲(AMS), 200μ0.5 M的核苷酸μ每一对引物的M, 1单位每25μL反应混合Taq DNA聚合酶(Fermentas)。上述对引物检测到瑞来斯- 23 r基因的表达。

生成完整的细胞溶解产物的正常/转导hAD-MSC 6-well汇合的细胞层的盘子用裂解缓冲50 mM Tris-Cl, pH值7.4;Na-deoxycholate NP-40 150毫米氯化钠,1%,1%,1毫米EDTA, 0.1% SDS(σ),和迷你完整、EDTA-free蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)。蛋白质12% sds - page分离,涂抹硝化纤维素膜(通用电气医疗集团,德国慕尼黑),阻止了TBS含有5%脱脂奶粉,和分析的RIL-23R anti-RIL-23R抗体抗体(研发系统)其次是合共轭(圣克鲁斯,圣克鲁斯、钙、美国)。

2.8。瑞来斯- 23 r函数通过共培养试验

IL - 23 r分泌和功能进行了生物天真的C57BL / 6小鼠T细胞培养正常/转导hAD-MSCs HT1080细胞。老鼠被杀按照实验动物协议解剖脾的消化100 u /毫升dispase /胶原酶。脾脏细胞通过离心收集1200 rpm和红血球通过红细胞裂解裂解缓冲。然后细胞悬浮在RPMI培养基补充10%胎牛血清的浓度1×10⁶细胞/毫升。产生短期的文化激活T细胞、脾细胞被激活的添加外源凝集素phytohaemagglutinin (PHA)的浓度1毫克/毫升RPMI补充10%胎牛血清的4天(32]。细胞被清洗和维护在白介素2(2)补充媒体2 ng / ml的浓度在使用前至少7天。

2×10⁴细胞/被播种在96孔板。第二天,细胞被洗和preincubated丝裂霉素C(0.4毫克/毫升5分钟)33]。治疗后,这些细胞被立即洗手至少三次和孵化RPMI(σ)生长介质。决定是否转导细胞诱导Th2细胞增殖的结果调节RIL-23R表达式,依赖PHA - 2激活T细胞被添加到培养基的效应:靶细胞比20:1 [34]。cell-adherent T细胞接触抑制在一些实验通过播种T细胞到细胞培养插入(正)。这些插入结合膜是透明的,含有0.4毫米孔允许自由通行的可溶性因子但太小让细胞迁移(32]。上层清液在24或48 h后收获和浓度il - 10和IL-17由rt - pcr (35]。总RNA的提取进行了T细胞与正常/ cocultured转导细胞。的表达glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)被认为是作为一个内生的参考基因。

2.9。道德的考虑

目前研究的建议指导的护理和使用实验动物伦理委员会批准的,Golestan大学的医学科学。人类脂肪组织收集获取知情同意后考虑的声明Golestan医学大学Gorgan,伊朗

2.10。统计分析

统计分析都是由图垫棱镜(版本6)独立使用单向方差分析和t检验,检查统计显著水平的团体之间的差异P < 0.05。

3所示。结果

3.1。hAD-MSCs是孤立和分化成脂肪细胞和成骨细胞

细胞被通过后,脂肪细胞是lipoaspirate组织使用机械分离和酶消化。细胞增殖能力强(图显示1)。细胞的确认multilineage能力完成后分化为脂肪细胞和成骨细胞细胞后三个星期。可视化的脂质空泡在油红染色显示hAD-MSCs脂肪细胞的特性(图1(一))。我们确定了细胞表面标记的存在CD73, CD105和缺乏造血(CD45 CD11b)和内皮(CD34)抗原在孤立的脂肪细胞MSC。我们的数据表明,这种类型的细胞也有类似的表达谱为选定的标记(图1 (b))。

3.2。瑞来斯- 23 r设计并成功地克隆到一个慢病毒载体

设计重组IL - 23 r基因的开放阅读框(瑞来斯- 23 r)使用PCR放大然后subcloned慢病毒载体(图2(一个))。RIL-23R cDNA插入pCDH813A-1矢量证实了消化的穿梭载体EcorV Sal1。1400个基点的片段对应RIL-23R成功分离pCDH813A向量(图- 12 (b))。此外,colony-PCR用来检测RIL-23R cDNA在这个向量。当时的互补dna测序,没有突变被发现的cDNA序列。

3.3。重组病毒粒子是由hek - 293 t

HEK - 293 t细胞confluency 70%(图3(一个))成功cotransfected这种构造和生产瑞来斯- 23 r -慢病毒颗粒(图3 (b))。转染效率超过90%(图3 (c))。

3.4。hAD-MSCs转导与重组慢病毒颗粒

AD-MSCs时约50%汇合的转导与慢病毒颗粒(图4(一))。GFP-positive转导hAD-MSCs转导(图后以72 h4 (b))和被选为2.5μ克嘌呤霉素(图4 (c))。流式细胞仪是用来获得约95%纯转导细胞14天post-transduction(图4 (d))。莫伊的转导hAD-MSCs = 50是做病毒浓度和滴定后进行的。

3.5。正常/转导hAD-MSCs被分化特征,流式细胞术,CFU-F化验

我们确定了细胞表面标记的存在CD73 CD105和缺乏造血(CD45 CD11b)和内皮(CD34)抗原hAD-MSCs和转导hAD-MSCs(图5(一个))。我们的数据表明,这两种类型的细胞有相似的表达谱为选定的标记。但是干细胞标记CD105是那么丰富的转导hAD-MSCs (55.6%±4.39 SEM, hAD-MSCs n = 5, SEM和27.1%±2.3%,n = 5 transduced-hAD-MSCs)。

尽管间充质基质细胞已经定义的积极CD105的表达(36),几组也观察到相当大的内表型漂移在体外对asc扩张(37- - - - - -39]。我们发现CD105表情hMSCs是异构与之前的研究结果相一致36,40- - - - - -42]。中观察到的差异CD105的表达会导致别人的培养条件(通道数量、文化时间、细胞融合43,44)、氧气压力、TNF -α(45),干扰素-γ(4无血清培养系统],[46)和MSC源(47]。也没有或低表达Endoline (CD105)与子群与成骨的增加脂肪细胞基因表达的36,48),而选择CD105积极(CD105 +) msc有利于软骨形成(49]。这些结果还表明,msc并非来源于内皮或造血细胞。

正常/转导hAD-MSCs显示较强的增殖能力。细胞multilineage能力完成后分化为脂肪细胞和成骨细胞细胞(图5 (b))。可视化大规模钙口供的分化细胞后茜素红染色证实成骨细胞在hAD-MSCs和转导hAD-MSCs的存在。此外,观察许多脂质空泡油红染色显示后的脂肪细胞特性hAD-MSCs和转导hAD-MSCs。因此,慢病毒颗粒包含RIL-23R保持hAD-MSCs的中胚层的性质。

执行CFU-F化验检查细胞的自我更新的属性。没有明显差异的数量CFU-Fs播种后细胞在2周后(图10厘米盘子5 (c))。正常和转导hAD-MSCs显示更高的增长率,自我更新功能无论虽然没有显著的差异。

3.6。rt - pcr hAD-MSCs自我更新的特性进行了分析

我们检查了分子标记的表达hAD-MSCs和转导hAD-MSCs(图6)。SOX2 OCT4、原癌基因,检测到了NANOG hAD-MSCs和转导hAD-MSCs。的表达细胞系SOX2很低。这些结果表明hAD-MSCs和转导hAD-MSCs最高的自我更新能力和分化潜能。引物组用于rt - pcr表所示1。

3.7。瑞来斯- 23 r表达进行了分析通过rt - pcr和免疫印迹

RIL-23R表达,总RNA nontransduced和转导hAD-MSCs孤立,和RT - PCR显示表达式的RIL-23R转导hAD-MSCs而不是控制hAD-MSCs(数字7(一)和7 (b))。随后,RIL-23R决心在蛋白质的表达水平。通过免疫印迹分析,RIL-23R几乎是完整的细胞溶解产物的检测转导hAD-MSCs(图7 (c))。

3.8。瑞来斯- 23 r函数被培养CD4 + T化验

证明hMSCs在小鼠T细胞的抑制作用是特定于转导h-ADMSCs,我们还使用了一个不同的附着人体细胞线在我们的实验中,ht - 1080(人类纤维肉瘤细胞系)50]。hMSCs这些细胞形态学特征相似,没有任何已知的MSC-like属性(多能能够分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞);的成纤维细胞对T细胞的抑制作用没有任何[50),因此,他们被用作控制在我们的实验。我们使用这些细胞系相同的比率hAD-MSCs和相同的实验设置。

4所示。讨论

自身免疫性疾病发生在身体器官是由自体免疫细胞攻击的结果是一位不称职的免疫反应针对自身抗原(51]。最具免疫抑制药物治疗自身免疫性疾病的家庭属于糖皮质激素(52]。许多医学研究者正在寻求新的免疫治疗策略用更少的副作用。这些策略包括基因或重组蛋白(53)治疗影响特定的免疫细胞(54)和分子如细胞因子(55),趋化因子(56[],costimulatory分子57]。

间充质干细胞(msc)是已知的免疫调节,自我更新和multilineage微分属性(58]。这些特点导致承认MSC-based细胞疗法的真正能力。由于msc的效率可以与不同的基因转导(59),这些细胞的基因修改进行了增强MSC功效在组织修复和再生9]。

msc发现的大量脂肪组织和相对宽松的它们可以孤立使得msc的良好来源成体干细胞在再生医学(19]。一些研究[12,13)表明,明显更多的干细胞可以从脂肪组织而获得同样体积的骨髓(60]。

在目前的研究中,从lipoaspirate hAD-MSCs被成功分离的组织样本和流式细胞术的特征。,其成骨的和脂肪形成的差异进行了分析。所有转导和non-transduced文化可以分化成脂肪形成的成骨的血统,表达干细胞标记,如10月- 4 SOX2, NANOG和原癌基因保留hAD-MSCs的本质。没有明显的增殖能力的变化或细胞表面标记表达式之间的传导和non-transduced文化。有减少CD105, MSC-specific标记。转导和non-transduced细胞显示相同的形态和分化61年]。

Endoline CD105, TGF-b受体三世,msc(通常被认为是一个重要的里程碑62年]。我们有报道说,干细胞标记CD105在转导hAD-MSCs那么丰富。一些报告显示,其表达变化取决于MSC来源,文化时间体外和分化状态(40,63年]。

安德森et al。40)表明,CD105和CD105 + mASCs有着相似的增殖能力,克隆形成unitfibroblast (CFU-F)潜力,differentiation-related基因的表达和共享所有其他MSC标记分析。CD105-mASCs能力分化成脂肪细胞和骨细胞更大也更有效地抑制T细胞增殖比CD105 + mASCs体外。例如文化达到confluency时,膜1型基质金属蛋白酶,这是一个membrane-tethered MMP可以打通CD105从细胞表面64年]。李维et al。36发现CD105的表达模式是与对asc的成骨潜能密切相关。虽然他们不一定预测这些差异的本质,对CD105作为TGF - coreceptor及其作用β1,他们会期望CD105低细胞将显示减少TGF -β1信号。

的自然形式IL-23R由至少12个外显子编码。这里,我们设计重组IL-23R (RIL-23R),可以产生一种分泌受体的拮抗作用对IL-23 [29日]。一些研究表明,IL-12Rβ2链或IL-23R展出肿瘤抑制功能(65年]。此外,证据表明,可溶性受体发挥作用受体激动剂和拮抗剂在疾病和正常的体内平衡(66年]。因此,我们提出这一代的可溶性受体可能会给自身免疫性疾病的免疫方法维护。

msc可以用作基因输送系统,因为他们很容易改变的能力和家庭在受伤组织和缺乏免疫原性属性。此外,他们一直相互不同的向量优化转基因表达(9]。在某些情况下,如长寿命的疾病的治疗,可能需要永久转导msc,可以达到利用逆转录病毒改变msc与高效长期表达(67年]。

我们获得了超过95%的慢病毒转导效率AD-MSCs根据选择嘌呤霉素作为理想的有益剂治疗的目的(68年]。

瑞来斯的rt - pcr验证表达式——23 r。目前的发现和其他的类似的研究没有发现负面影响转基因表达的慢病毒转导后multipotency属性(30.]。

IL-23有效Th17细胞的功能,但不能诱导这些细胞的分化在体外。IL-23R可溶性同种型的抑制能力IL-23信号(69年]我们假设RIL-23R领导担任IL-23抑制剂,可以绑定p19 IL-23链和抑制的功能成熟Th17细胞,导致T细胞生产导致大量分泌il - 10的转向Th2细胞类型(70年]。然后,我们预计超表达il - 10和抑制IL-17。rt - pcr能够表现出目标基因的表达水平;然而,生物完全证实了基因表达的能力。癌症细胞的干细胞有一些特性包括长寿命,相对细胞凋亡抵抗,和复制能力长时间(71年]。此外,类似的生长调节剂和控制机制参与癌症和干细胞维护(72年]。STS细胞系分化能力类似msc (73年]。最近的证据强烈表明,肉瘤来源于间充质干细胞(74年- - - - - -77年],它代表了plastic-adherent频谱不同骨骨髓来源的细胞直到最近。相同对待文化的高转移性纤维肉瘤细胞系HT1080包括积极控制。我们从脾细胞分离出小鼠CD4 + t细胞和cocultured他们三天的转导hAD-MSCs HT1080细胞和hAD-MSCs HT1080细胞控制细胞。我们重组RIL-23R也是评估的能力来表达IL-17 rt - pcr和il - 10。我们RIL-23R诱导il - 10的Th2细胞增殖和改善其功能超表达(74年]。

5。结论

这是第一个报告RIL-23R转导hAD-MSCs,这可能是一种有效的方法使用等细胞细胞基因治疗自身免疫性疾病的一个很好的工具。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究是由研究和技术支持的Golestan大学医学科学委员会(批准号940805182)。

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