Grammatophyllum speciosum乙醇提取物促进人原代成纤维细胞的伤口愈合

摘要

Grammatophyllum speciosum是兰科植物中的一种，含有多种可能有药用价值的植物化合物。本研究旨在评价假鳞茎的活性g . speciosum提取液(GSE)在人原代成纤维细胞创面愈合过程中的作用在体外GSE的抗氧化活性和总酚含量。划痕愈合实验表明，GSE在治疗6和9小时后能够提高划痕的迁移率。此外，该提取物具有清除DPPH、ABTS和超氧阴离子自由基的能力，表明GSE具有较强的抗氧化能力。本研究提示了假鳞茎提取物的新作用g . speciosum作为伤口愈合的促进剂。本研究结果可能有助于进一步开发用于皮肤创面愈合的新型活性化合物。

1.介绍

伤口愈合过程分为血管收缩和凝固、急性炎症、细胞增殖和伤口重塑四个阶段[1］．简单地说，凝血导致血小板血栓形成，纤维蛋白凝块导致中性粒细胞和巨噬细胞的招募，从而导致炎症反应。然后释放生长因子和促炎细胞因子来激活细胞，这涉及到抗菌过程，如角化细胞、内皮细胞和成纤维细胞。在炎症反应中，活性氧(ROS)产生，以保护细胞免受细菌和微生物的侵袭。组胺和其他导致血管扩张增加的因素也会被释放。细胞增殖阶段开始于细胞外基质(ECM)的积累，包括由成纤维细胞产生的胶原蛋白和纤维连接蛋白。血管促生长因子刺激内皮细胞增殖，导致血管数量增加。最后，再上皮化机制和组织重塑开始。在这个过程中，成纤维细胞被角质形成细胞激活，合成生长因子以调节其增殖。非细胞疤痕和交联胶原基质将替代纤维母细胞丰富的肉芽组织，并提供疤痕的抗拉强度或完整的皮肤。 During the tissue remodeling phase, a decrease in cellularity from the apoptosis of myofibroblasts, endothelial cells, and inflammatory cells will lead to the process of impaired wound healing. This impairment may be caused by uncontrolled inflammatory, infection, and overproduction of ROS. Excessive ROS production could damage ECM protein and cellular function of fibroblasts and keratinocytes, resulting in slow wound healing process [1- - - - - -4］．这种植物提取物具有抗氧化性，有可能保护皮肤，可能有助于加速组织伤口愈合[5］．

Grammatophyllum speciosumBlume是兰科植物，主要分布在东南亚。假鳞茎提取物g . speciosum用于缓解蝎子毒液引起的疼痛(Heterometrus laoticus）.此外,g . speciosum据报道，乙醇提取物(GSE)有可能增加人类角质形成细胞的干细胞表型[6］．此外，该提取物还具有保护细胞免受超氧阴离子诱导的细胞死亡的能力[6］．g . speciosum含有多种植物化学化合物，如葡萄糖氧苄衍生物、革兰茅苷、克罗诺平、vandateroside II、天冬素、香草糖苷、orcinol glucoside和异牡荆[7］．由于它们的好处，这种植物中的这些植物化学物质可以用作药物;然而，影响g . speciosum对组织创面愈合的影响从未被研究过。

本研究检测了GSE在人原代皮肤成纤维细胞中的潜在伤口愈合作用。并对其清除DPPH、ABTS和超氧阴离子自由基的体外抗氧化活性进行了评价。本研究结果可能有助于进一步开发用于组织创面愈合治疗的新型活性化合物。

2.材料和方法

2．1．植物材料收集和提取

新鲜的假鳞茎g . speciosumBlume是在泰国查春骚省考欣索恩皇家发展研究中心采集的。干假鳞茎g . speciosum磨碎后用乙醇(1:9 w/v)在25℃下浸渍3 d，共3次。提取液经过滤，在40℃以下的真空压力下蒸发。

2．2.质量控制g . speciosum灯泡提取

为提高提取物的重现性，测定天麻素的含量g . speciosum采用快速高效液相色谱法从三个不同批次的提取物中提取，在流动相乙腈-水梯度洗脱的条件下，如本课题组之前描述的[8］．

2．3.总酚含量测定

总酚含量采用Folin-Ciocalteu法测定[9］．在96孔板中，将试剂与Na₂有限公司_3.因此补充道。混合物孵育1小时，在765 nm处用紫外分光光度计测定吸光度。总酚含量与表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)比较，表示为每100 g GSE提取物的EGCG当量(gEGCG) g。这个实验重复了三次。

2．4．抗氧化活性评估

2.4.1。DPPH实验

采用DPPH自由基法测定GSE对DPPH自由基的清除能力。将样品加入0.15 mM DPPH乙醇溶液中，置于96孔板中。将混合物在室温黑暗中孵育30分钟。在517 nm处用紫外分光光度计测定吸光度。结果以DPPH %抑制率表示。以带有载具的DPPH溶液作为阴性对照，以未带有载具的DPPH溶液作为空白进行背景减影。

2.4.2。ABTS自由基清除活性

在加入ABTS之前，将20微米的样品加入到96孔板中^•+解决方案180μl.用摇床将溶液混合，室温黑暗孵育5分钟。ABTS•⁺用紫外分光光度计在750 nm处测量。结果以抑制ABTS•%表达⁺通过GSE与ABTS•⁺以车辆作为负控制的溶液。ABTS•减少50%⁺，并以IC50值表示。

2.4.3。超氧阴离子自由基清除(SOSA)的测定

将20微米的样品加入96孔板，然后再加入20微米μL磷酸缓冲液，80μl NADH, 80μl NBT和20μl PMS的解决方案。溶液在室温黑暗中培养15分钟。用紫外分光光度计在560nm处测量混合物的吸光度。与ABTS•相比，GSE对SOSA的抑制率为%⁺以车辆作为负控制的溶液。计算超氧阴离子自由基减少50%，并给出IC50值。

2．5．细胞生存能力分析

人原代皮肤成纤维细胞(ATCC®CRL 2097，美国)在96孔板中培养约5 × 10^3.细胞/孔密度使用10% fbs补充的DMEM培养基，并在37°C、5%湿度和CO中培养₂一夜之间条件。孵育后，用含5-100的10%胎牛血清DMEM替代DMEMμg/mL GSE，对照组除外。细胞在37°C中培养，5%的湿度和CO₂分别在空气中浸泡24 h。100年之后,μ用L的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)溶液(PBS中5 mg/mL)替换每孔的培养基，然后在37℃、黑暗、5%湿度和CO中孵育₂条件3小时。去除MTT溶液后，100μ在每孔中加入L的DMSO，然后用酶标仪读取540 nm波长处的吸光度。细胞活力计算成百分比，并与对照样品进行比较。

2．6．划痕愈合试验

用划痕创面愈合实验测定GSE对人原代成纤维细胞迁移的促进作用。细胞以3 × 10的密度播种⁴细胞/孔在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，96孔板孵育过夜。孵育后，完全去除DMEM，用无菌的黄色吸管尖划伤附着的细胞层。用PBS漂洗去除细胞碎片。然后加入含或不含GSE的完整培养基，细胞孵育9 h。0、6、9 h时，在亮场显微镜(10×)下记录划痕区域图像。采用奥林巴斯DP控制器软件测量创面面积。用gse处理后的细胞在6和9 h相对于0 h的空间变化百分比来表示相对细胞迁移。

2.7。统计分析

独立实验数据以均数±标准差表示。多组间的统计差异采用方差分析(ANOVA)进行分析，个体比较采用Scheffe的事后检验。统计学意义在p< 0.05。

3.结果

3．1.产率和外观g . speciosum提取

粗提物g . speciosum与初始干重相比，蓝假鳞茎产量为194.6 g，占产量的6.49%。原油的草g . speciosum按提取工艺进行研磨提取，得到草本提取物比(HER)为1:9。的g . speciosum提取液粘稠，颜色深棕色。的外观g . speciosum提取如图所示1．

３．２．高效液相色谱法测定天麻素含量

天麻素是一种主要化合物，测定其含量g . speciosum采用快速高效液相色谱法，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱。的保留时间g . speciosum样品和标准溶液分别在6.483和6.494 min洗脱(图2）.

分析了3批不同药材中天麻素的含量。结果显示，第1批、第2批、第3批天麻素含量分别为63.62±0.2、54.96±0.2、56.65±0.3 mg/g(表1)1)，被认为彼此之间并无显著差异(p> 0.05)。结果表明，不同批次天麻素含量差异不显著，表明不同采收期不同批次天麻素含量具有一致性。

3．3．GSE总酚含量及抗氧化活性的研究

酚类化合物可能直接起到抗氧化作用。采用福林- ciocalteu法测定GSE的总酚含量，并与标准化合物EGCG进行比较。GSE总酚含量为48.2±0.4 mg EGCG当量/g。

本研究证明了GSE对DPPH自由基的抗氧化能力，其中DPPH是一种自由基化合物，通常用于筛选其清除自由基的作用。表格2结果表明，GSE的清除活性范围为24.8 ~ 55.7%，IC50为0.1 mg/mL。标准化合物抗坏血酸的清除活性为21.7 ~ 76.3%，IC50为2.3 mg/mL。GSE的IC50低于抗坏血酸，表明GSE比抗坏血酸具有更高的抗氧化能力。

通过对ABTS•的脱色计算总抗氧化活性⁺．Trolox被用作标准化合物。结果以抑制ABTS•%表达⁺激进。GSE(图3(一个))或trolox(图3 (b))抑制ABTS•的吸光度⁺具有剂量依赖性。抑制ABTS•的IC50为%⁺GSE为0.12±0.01 mg/mL, trolox为0.06±0.01 mg/mL。此外，通过测定SOSA，进一步研究了GSE对超氧阴离子的抗氧化能力。GSE对SOSA抑制的IC50为1.37 mg/mL(图)3 (c)）.但GSE的IC50高于抗坏血酸(IC50为0.36 mg/mL)，如图所示3 (d)．

3．4．GSE对人原代成纤维细胞活力的影响

采用MTT法检测GSE对人原代成纤维细胞24 h后不同浓度的细胞活力的影响。GSE 5-100浓度μg/mL对原代成纤维细胞无细胞毒性，细胞活力高于80%(图4）.选择无毒浓度进行划痕愈合试验。

3．5.GSE在促进人原代成纤维细胞创面愈合中的作用

通过创面愈合实验检测人原代成纤维细胞在GSE处理后的迁移能力。在GSE暴露后6和9 h检测细胞迁移。GSE浓度为5-25μ与0 h相比，g/mL增加了6和9 h的细胞迁移率(图5(一个)）.人原代成纤维细胞的相对迁移水平见图5 (b)，支持GSE处理6和9 h后显著提高迁移率。

4.讨论

天然植物提取物如果其植物化学成分具有抗氧化活性和清除自由基的能力，如许多以前的研究所报道的那样，可以有利于伤口愈合[5］．石莲子mimosoides提取物中含有酚类物质，具有显著的抗氧化活性，可增强伤口愈合能力[10］．为此，我们将GSE作用于人原代成纤维细胞，分析其对创面愈合的作用。

细胞迁移是创面愈合组织形成阶段的一个重要过程[1- - - - - -3.］．伤口愈合试验是在体外模拟伤口并研究细胞迁移率的方法。当单层细胞被划伤后，细胞间的相互作用就会消失，导致细胞迁移和增殖。在本研究中，GSE能够增加细胞迁移率，表明伤口愈合增强。

活性氧的形成，包括过氧化氢(H₂O₂在UVA和UVB(波长分别为290 ~ 320 nm和320 ~ 400 nm)照射下，皮肤细胞发生超氧阴离子(·O2−)、羟基自由基(·OH)、脂质过氧化物(LOOH)及其自由基(LOO·)并积累。这些ROS可以破坏细胞膜，引起皮肤炎症、衰老和光毒性。过量的ROS可能会损害皮肤伤口的愈合过程。从这个意义上说，具有抗氧化活性的植物提取物可能有助于促进伤口愈合过程[11，12］．本研究发现，GSE具有清除DPPH、ABTS和超氧阴离子自由基的能力，具有抗氧化活性。

天麻素，一种酚苷[对羟基甲基苯基β- d -吡喃葡萄糖苷]，是一种主要的活性成分g . Speciosum．本研究选择天麻素作为控制GSE质量的活性标记物，因为天麻素含量高，便于检测和分析。同时，它也被用作定量评价的分析标记天麻(天麻)提取物采用高效液相色谱法[13，14］．天麻素是一种有效的抗氧化剂，可以保护骨质疏松症，减少ROS [15］．GSE的抗氧化作用可能与天麻素清除ROS的能力有关。

Bhat et al.和Pitz et al.发现了增强创面愈合的作用石莲子mimosoides，可能是由于其酚类成分的含量[10，16］．同样，GSE的伤口愈合性能可能来自其酚类化合物。

5.结论

GSE具有增强人原代成纤维细胞创面愈合的潜力。此外，该提取物具有清除DPPH、ABTS、超氧阴离子自由基的能力，与伤口愈合性能的提高有关。因此，这项研究首次提供了GSE对组织创面愈合增强的有趣作用，值得进一步研究，并可能为进一步的治疗应用提供有用的信息。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者声明本论文发表不存在竞争或利益冲突。

致谢

本研究由药学院药妆研究、发展及测试中心资助(批准号:(cdrt - 1600-01-01 -2017);24/2560),兰实大学。

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