拉一个连接酶的“帽子”:pCAF协调二级反式激活因子的泛素化

文摘

二级反式激活因子(CIITA)是至关重要的监管主要组织相容性二类(MHC II)基因转录。“主调节器”的MHC II转录,CIITA监管是必要的,需要各种转译后的修改(天车)为了方便其作用。以前我们认为CIITA各种泛素化事件。Monoubiquitination是重要CIITA transactivity, K63与泛素化与ERK1/2磷酸化参与相声,他们一起调解细胞运动从细胞质核地区。此外,CIITA也被降解K48 polyubiquitination修改。然而,E3连接酶负责这些修改是未知的。我们展示CIITA泛素化和transactivity增强组蛋白乙酰转移酶(HAT), p300 / CBP (pCAF)相关因素和E3连接酶区域内pCAF都是必要的。此外,pCAF介导的泛素化是独立pCAF帽子的领域,和乙酰化不足CIITA K48 polyubiquitinated和退化pCAF的存在。最后,我们确定了组蛋白乙酰转移酶、pCAF E3连接酶负责CIITA的泛素化。

1。介绍

主要组织相容性二类(MHC II)基因是必不可少的适应性免疫反应的起始细胞外的病原体;因此他们的表达和激活是至关重要的,有严格的规定1- - - - - -3]。协调编制完成多个蛋白质转录MHC II;然而,特别是一种蛋白质,称为的“支配性调控因子”MHC II基因,II类反式激活因子,尤其重要4- - - - - -7]。除了CIITA外,其他各种核染质的再塑造所需酶是MHC II启动子的“开放”,从而使转录机器绑定。特别是,两组蛋白乙酰转移酶(帽子),分子的结合蛋白(CBP / p300)和p300 / CBP相关因素(pCAF),被雇来的MHC II启动子,他们协助的染色质重塑发生之前和在CIITA [8,9]。

CIITA 1130氨基酸蛋白质和动态监管通过一系列复杂的转译后的修改(天车)[10]。天车CIITA包括磷酸化、泛素化和乙酰化作用[11- - - - - -18]。这些修改精确调节CIITA的位置、功能、细胞内的稳定,增加CIITA活动在MHC II启动子(8,10,13- - - - - -15,19- - - - - -22]。帽子包括pCAF和CBP负责CIITA在赖氨酸乙酰化(s) (K) 141年和144年(14]。它进一步表明,乙酰化在泛素化CIITA[中扮演重要角色13,14]。位于pCAF氨基端地区,是一个域包含在E3泛素连接酶活性(23]。泛素化需要三个酶:E1激活酶,E2接合酶,和E3连接酶,负责泛素到衬底的结扎与E2 (24]。以前pCAF的内在泛素化领域被确定和扮演一个角色在至关重要的细胞周期蛋白的泛素化和稳定性,人类两分钟2(人类直接同源Mdm2) [23,25),和转录因子,介导Gli1刺猬信号(26]。因此,pCAF不仅是帽子,但也在E3泛素连接酶。目前,pCAF ubiquitinate只有少数基质:显示Hdm2, Gli1,本身23,25,26]。作为pCAF影响许多转录因子和辅因子的活动通过其帽子活动,很可能pCAF也附加在E3泛素连接酶活动的目标。作为CIITA曾被证明是pCAF衬底的帽子活动和观察了CIITA增加的泛素化的pCAF [13),我们试图确定pCAF CIITA潜在E3连接酶。

我们推测pCAF扮演小说角色作为CIITA E3泛素连接酶除了其传统的角色的帽子。我们在这里展示,CIITA transactivity水平和全球泛素化(所有泛素类型)显著下降的缺席pCAF E3连接酶域。进一步,我们展示CIITA泛素化并不依赖于帽子pCAF领域。乙酰化零CIITA突变体缺乏信号成为核捆绑ubiquitinated K48联系方式导致退化。体外泛素化化验证实pCAF的能力促进CIITA泛素化。最后,我们发现CIITA mono、K63 K48连接泛素化是由pCAF体内。这些结果表明pCAF的能力促进各种拓扑的CIITA泛素化。这些结果表明,pCAF,通过其E3连接酶活动,发挥额外CIITA监管活动中一个重要的角色,因此在调节MHC II基因的表达。进一步识别的E3连接酶负责泛素化CIITA至关重要的获得理解CIITA监管通过天车补充道。确定酶负责这些多功能天车的规定允许有价值的见解的适应性免疫反应和识别潜在的治疗靶点。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

猴子因为细胞(成纤维细胞)写明ATCC(马纳萨斯,弗吉尼亚州)维持使用high-glucose杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM) (Mediatech, Inc .,位于弗吉尼亚州赫恩登)补充10%胎牛血清,50个单位/毫升的青霉素、50μ链霉素的g / mL,谷酰胺2毫米。细胞被维持在37°有限公司为5%₂。

2.2。质粒和纯化蛋白质

Flag-K141R、K144R K141/144R, Myc-CIITA请珍妮Ting博士提供的。从Drs Flag-pCAF是慷慨的礼物。利纳雷斯et al。23]。Myc-pCAF subcloned进Myc标记pCMV-3使用EcoR1限制站点。HA-K48乌兰巴托和K63乌兰巴托泰德·道森博士的礼物。两,HA-K48 K63泛素都泛素的内部赖氨酸残基突变除了K48精氨酸或K63,允许polyubiquitination只发生在那些赖氨酸残留物。HLA-DRA荧光素酶记者构造是前面描述的27]。E1激活酶UBE1(学生物化学波士顿,波士顿,MA) E2接合酶UbcH5b学生物化学(波士顿),国旗泛素(波士顿生物化学),Hdm2(波士顿生物化学)和His-pCAF(位于马里兰州Rockville Proteinone,)都获得了商业上。

2.3。GST-Protein生产和净化

恒星BL21 (DE3)主管细胞表达载体,卡尔斯巴德,CA)与pGEX转换结构。选择了殖民地和接种5毫升磅补充与AMP和细菌一夜之间被允许种植37°。一毫升预备加入100毫升新鲜磅补充AMP和细菌被允许种植三个半小时37°OD_600年0.8点。添加IPTG诱导表达。细胞与冷冻离心机和颗粒被PBS,再次离心。细胞颗粒在−冷冻一小时80°;颗粒是允许在冰上融化,resuspended在缓冲区(PBS + 1% Triton-X100 + 0.1 M氯化钠+蛋白酶抑制剂(罗氏))。细胞被用在冰和离心获得可溶性分数。不溶性分数resuspended在缓冲B(缓冲+ 25% (w / v)蔗糖)的混合物在20000转离心20分钟。上层清液被收集作为不溶性分数。增溶和重折叠的包涵体进行8 M尿素+ 5毫米德勤溶解颗粒。在PBS protein-urea混合物然后透析4°了两天。 GST-CIITA protein was added to a Glutathione Resin column and the protein was eluted in 10 mM glutathione elution buffer (0.154 g reduced glutathione dissolved in 50 mL of 50 mM Tris-HCL, pH 8.0). GST-CIITA, flow through, wash, and elutes were analyzed by SDS-PAGE and then stained with Coomassie. Elutes were dialyzed to remove free glutathione.

2.4。Coimmunoprecipitations

因为细胞被镀在8×10的细胞密度⁵在组织培养板/ 10厘米。细胞转染使用GeneJuice(默克密理博,达姆施塔特,德国)表示,5μ克Myc-CIITA、Flag-pCAF Flag-K141R、K144R K141/144R CIITA, HA-K48乌兰巴托,K63乌兰巴托,HA-mono乌兰巴托,或pCDNA控制。转染24小时后,细胞细胞溶解在1% NP40补充的缓冲区EDTA-free蛋白酶抑制剂(罗氏)冰。蛋白质浓度溶解产物离心机,规范化,事先批准与小鼠免疫球蛋白G (Sigma-Aldrich)和蛋白质(热费希尔)其次是免疫沉淀反应,要么EZ视图anti-c Myc亲和力凝胶珠(Sigma-Aldrich)或anti-Flag M2亲和力凝胶(Sigma-Aldrich)。免疫复合物与Laemmli变性缓冲区,煮,通过sds - page凝胶电泳分离。凝胶被转移到硝基,单独与anti-Myc免疫印迹(Abcam、剑桥、马),anti-Flag (Sigma-Aldrich) antiubiquitin(生活传感器、莫尔文、PA), anti-K48泛素(细胞信号,丹弗斯,MA), anti-K63泛素(微孔),或与anti-GST (Abcam、剑桥、马)。合配合使用HyGlo检测化学发光底物(Denville)。蛋白质标准化和等于加载测定溶菌产物。

2.5。荧光素酶报告分析

因为细胞被镀在5×10⁴confluency细胞/密度(70%)。粘合后,细胞cotransfected与HLA-DRA表示,Renilla, pcDNA Myc-CIITA, Flag-pCAF使用GeneJuice(默克密理博,达姆施塔特,德国)根据制造商的协议。24小时转染后,细胞细胞溶解1 x被动裂解缓冲(Promega,麦迪逊,WI)补充EDTA-free蛋白酶抑制剂(罗氏)。双荧光素酶检测进行使用Lmax II_384年(分子器件、桑尼维尔CA)根据制造商的指示。荧光素酶蛋白质读数、被规范化Renilla正常化。

2.6。体外泛素化分析

的CIITA体外泛素化试验在150年进行μL反应混合物40毫米Tris-HCL (pH值7.5),5毫米MgCl₂磷酸肌酸,2毫米二硫苏糖醇,1毫米,2毫米ATP, 400 ng重组GST-CIITA(基质),400 ng GST-Hdm2学生物化学(波士顿),400 ng重组His-pCAF (E3连接酶候选人)(位于马里兰州Rockville Proteinone), 500 ng国旗泛素(学生物化学波士顿,波士顿,MA), 200 ng E1激活酶,UBE1学生物化学(波士顿),200 ng E2接合酶,UbcH5b(波士顿生物化学)。所有组件被添加和孵化37°C 60分钟,通过sds - page分析。泛素化是由免疫印迹检测使用标记抗体(σ),和CIITA泛素化与GST (Abcam)验证,与单克隆pCAF被验证αpCAF抗体(Santa Cruz)。验证Hdm2发现泛素化使用销售税(Abcam)。

3所示。结果

3.1。CIITA和pCAF Coimmunoprecipitate

CIITA和pCAF先前已被证明关联(14已知,pCAF乙醯化CIITA赖氨酸(K) 141年和144年。这些残留物位于核本地化信号(NLS)地区和乙酰化作用对航天飞机CIITA细胞核是必要的。一旦pCAF乙醯化CIITA, CIITA积累在原子核中,结合MHC II enhanceosome复杂的启动子(14)和驱动MHC II转录。确认之前的发现,我们进行coimmunoprecipitation化验来验证WT CIITA和WT pCAF之间的相互作用。弄一个表明WT Myc-CIITA协会和WT Flag-pCAF通过coimmunoprecipitation分析(图1上面板,车道)。

3.2。pCAF E3连接酶域是必要的CIITA Transactivity

虽然pCAF主要的帽子的作用,pCAF也被认为是一个泛素化因素与内在E3酶功能(23,26]。有趣的是,pCAF没有任何其他已知的E3连接酶的同源性。利纳雷斯et al .,进行了一系列缺失突变和确定一个区域氨基酸(121 - 242),具有E3连接酶能力(23]。之前的报告显示pCAF能够调解乙酰化和泛素化的同一个目标(13,23,26,28]。因此,我们明年想确定pCAF的E3连接酶域transactivity CIITA的增加是必要的。水平的transactivity使用双荧光素酶报告实验测定。与WT pCAF CIITA cotransfected导致增加2倍CIITA transactivity和驱动MHC II转录的能力;然而,删除的E3连接酶域pCAF导致显著降低CIITA transactivity水平(图2)。

3.3。E3连接酶域pCAF不足无法Ubiquitinate CIITA

我们下一个调查如果CIITA泛素化将受损或改变没有pCAF的E3连接酶域。pCAF包含一个autoubiquitination域能够调解self-ubiquitination但尚未被证明是参与泛素化的其他基板23]。确定所需的E3连接酶域促进CIITA泛素化,我们执行一个体内泛素化试验。WT-Myc-CIITA, WT-Flag-pCAF或ΔE3 pCAF cotransfected成因为细胞突变。泛素化水平的WT CIITA cotransfected与WT pCAF显示显著增加的WT CIITA转染(图3,比较通道1和2)。然而,CIITA的泛素化水平与ΔE3 cotransfected pCAF变异显示水平相比明显下降的泛素化的CIITA cotransfected WT pCAF(图3,比较通道2和3)。这些数据支持pCAF的E3连接酶域是重要CIITA泛素化和参与调停CIITA泛素化。

3.4。pCAF促进CIITA泛素化独立于它的帽子域

pCAF是一个著名的帽子和参与的许多方面CIITA和MHC II规定14,29日,30.]。pCAF协助重建的染色质结构MHC II启动子,乙醯化组蛋白H3和H4 (30.)以及调节CIITA核搬迁的乙酰化CIITA K141 K144,导致增加激活CIITA和增加表达MHC II (14]。来确定pCAF CIITA的泛素化作用是独立pCAF帽子的活动,我们进行了体内泛素化化验使用WT CIITA和帽子pCAF缺失突变体。在这个分析,表达WT CIITA仅表明低水平泛素化(图4(一)、巷1)和泛素化水平显著增加(图中当WT pCAF是过表达的4(一),莱茵3)。然而,在缺乏pCAF帽子领域,没有重大区别CIITA泛素化水平当CIITA泛素化相比,在WT pCAF的存在(图生成4(一),比较车道3和4)。因此,我们认为pCAF的能力ubiquitinate CIITA pCAF帽子领域无关。

3.5。pCAF同事与CIITA乙酰化零突变体

pCAF行为双重方式如帽子和泛素连接酶和乙酰化驱动CIITA核进口,我们下一个决定如果CIITA乙酰化是必要CIITA pCAF泛素化介导的。开始调查CIITA乙酰化和泛素化之间的关系,我们首先要确定如果乙酰化空CIITA突变体和pCAF能够联系起来。Coimmunoprecipitation分析表明CIITA乙酰化突变体在K141R不足,K144R单独或K141/144R双突变体网站所有仍与pCAF互动(图的能力5)。

3.6。pCAF介导K48与泛素化的乙酰化零CIITA突变体

乙酰化作用在K141 K144 CIITA至关重要的信号从细胞质CIITA原子核的运动(14]。调查pCAF在调解乙酰化作用的独立的泛素化,我们利用乙酰化零CIITA的突变体。这些CIITA突变体不能在K141乙酰化和K144因此可能目标K48 polyubiquitination和退化有关。我们的研究结果表明K141R和K144R K141/144R CIITA突变体显示低水平的泛素化和添加pCAF收益率显著降低探测泛素化(图6(一)WT CIITA污点)相比,与pCAF coexpressed(比较车道3、6、9、12)。进一步溶解产物墨迹显示CIITA转染并显示一种减少CIITA蛋白表达(图6(一),中间污点)。这些数据表明赖氨酸缺乏CIITA正在退化的速度更大的超表达pCAF(图6(一),比较车道5和6)。蛋白酶体抑制了MG132表明的积累ubiquitinated CIITA pCAF存在(图6(一)列7),表明缺乏6巷的泛素化涂片可能是因为CIITA退化。此外,K144R突变和双K141 / K144R突变体表明类似的趋势,分别(图6(一)车道8 - 10和11 - 13)。进一步确定pCAF介导CIITA K48泛素化有关,我们花了15 uL相同的免疫沉淀反应样本和免疫印迹K48泛素化使用特定抗体识别K48泛素化(图6 (b))。类似的趋势观察见图6(一),CIITA乙酰化突变体ubiquitinated;然而,当pCAF介绍我们又观察到泛素化减少了样品处理蛋白酶体抑制剂显示积累ubiquitinated CIITA。微密度分析表明在全球泛素化和泛素化水平显著差异K48特定的泛素化(数字6 (c)和6 (d))。

3.7。体外泛素化分析表明CIITA pCAF调解泛素化的能力

阐明如果CIITA pCAF为E3连接酶底物,我们进行了体外泛素化试验使用人类重组蛋白纯化。作为一个积极的控制中,我们使用GST-Hdm2,曾被视为ubiquitinated pCAF [23)(图7 (c))。净化人类重组蛋白E1 (UbA-1) E2 (UbCH5B),国旗泛素,GST-WT CIITA,和His-WT pCAF (E3)都在反应混合物的存在(见材料与方法)。如数据所示7(一)和7 (b),当所有泛素化组件(E1, E2、pCAF (E3)和泛素)在场的衬底,CIITA发生泛素化(数字7(一)和7 (b)巷5);然而这些组件,没有任何的泛素化并没有发生。我们免疫印迹anti-Flag泛素和抗GST-CIITA。这些数据表明,CIITA是E3泛素连接酶的底物pCAF。

3.8。CIITA Mono、K63 K48与泛素化与pCAF增加体内表达

我们之前确定CIITA包括mono的泛素化状态,K63, K48泛素化10,11]。Bhat等人显示的三个网站monoubiquitination CIITA CIITA所需稳定和增加CIITA transactivity。此外,我们先前证明CIITA修改K63与泛素化作用CIITA运动从细胞质到细胞核。知道几种类型的泛素化联系修改CIITA,我们想确定pCAF是否能够促进所有三种类型的CIITA泛素化。以前,我们证明pCAF能够调解K48联系CIITA泛素化在缺乏CIITA乙酰化作用。调查如果pCAF能够调解各种泛素在CIITA联系,我们体内泛素化进行化验。我们将演示CIITA monoubiquitination、K63 K48泛素化相关所有增加的WT pCAF相比化验WT CIITA表达独处时执行(数字8(一个),8 (b),8 (c),比较通道1和2)。当蛋白酶体抑制剂MG132抑制26 s蛋白酶体,所有三种形式的ubiquitinated CIITA累计指示最大泛素化水平(数字8(一个),8 (b),8 (c),莱茵3)。这些数据表明pCAF调解的能力CIITA的多种形式的泛素化。

4所示。讨论

我们这里寻求识别在E3泛素连接酶调节CIITA泛素化。CIITA被称为MHC II基因的“支配性调控因子”。MHC II是至关重要的适当的CD4细胞外的病原体⁺T细胞的适应性免疫反应。同时MHC II在转录水平的调节,CIITA是严格监管的转译后的修改。CIITA严重修改通过一系列复杂的多功能天车动态调节其位置、功能、稳定性、和活动。

先前的报道识别CIITA修改mono, K63, K48泛素化(10,11]。泛素化的CIITA已经证明是一个重要的转译后的修改。Monoubiquitinated CIITA更加稳定和活跃的MHC II启动子(11,13,31日]。K63与泛素化也重要,因为这个特殊的泛素连接显示增强的相声和磷酸化和在一起这些修改对运动很重要的CIITA细胞质细胞核(10]。此外,CIITA修改K48泛素化,导致识别和蛋白酶体降解的11]。

pCAF是一个著名的组蛋白乙酰转移酶或帽子32),此前被认为是招募和通过pCAF MHC II启动子的转录激活的帽子活动(2,22]。pCAF必须本地化的MHC II发起人pCAF合作与CIITA MHC II转录。pCAF之间的相互作用和CIITA独立于pCAF的帽子域(2,8,32]。我们这里确认添加pCAF驱动器增加CIITA transactivation水平MHC II启动子(图2)。

报告的几组pCAF充当E3泛素连接酶的能力,促进泛素化等目标Hdm2 / Mdm2和Gli1 [23,26]pCAF也被证明作为帽子,提高的可能性pCAF可能对CIITA双酶活性。我们下一个试图确定pCAF参与是E3连接酶,能够调解CIITA泛素化。水平的CIITA泛素化在WT pCAF的存在显著增加,而在缺乏pCAF E3连接酶区域的情况下,泛素化是废除(图3)。区域pCAF包含E3连接酶域不符合任何已知的E3连接酶结构;许多问题仍然是如何pCAF可能作为E3连接酶。可能的机制是许多E3连接通过autoubiquitination[监管33]。pCAF autoubiquitination域曾被证明不参与底物泛素化但促进self-ubiquitination [23]。E3连接也可以由磷酸化,激活或失活(34,35]。pCAF是磷酸化酪氨酸(Y) 729年和731年苏氨酸(T)和磷酸化的作用尚未确定(36];然而,在这些残基磷酸化可能参与pCAF E3连接酶的功能。

我们进一步展示CIITA泛素化pCAF pCAF是独立的域(图的帽子4(一))。当CIITA乙酰化作用受阻,CIITA由K48 ubiquitinated polyubiquitination随后退化有关。这些数据符合先前的报道表明治疗Trichostatin (TSA)和HDAC1显示减少的水平CIITA泛素化(13]。通过阻断蛋白酶体,我们能够想象积累水平的泛素化(数字6(一)和6 (b))。这些数据表明pCAF ubiquitinate独立于它的帽子功能的能力。

体外分析证实pCAF CIITA的泛素化作用,所有必要的可用和pCAF E3泛素组件;泛素化CIITA发生(数字7(一)和7 (b))。此外,体内泛素化化验显示pCAF调解能力的多种类型的CIITA泛素化,包括mono K63, K48 polyubiquitination(数字8(一个),8 (b),8 (c))。pCAF利用E2接合酶UbcH5b,能够合成泛素链包含所有可能的七连杆(33 27转K6, 11日,29日,48岁,和63年)的泛素(37]。

增加我们的学习了解二级反式激活因子的调控,从而导致直接的分子事件,导致MHC II基因的调控。泛素化已被证明是许多重要和必要的天车之一,以调节CIITA。我们之前识别mono和K63与泛素化提供了宝贵的洞察力,泛素化调节稳定、位置和活动CIITA [10,11]。我们确定的E3连接酶功能的新型基质pCAF和识别pCAF CIITA调解各种泛素化根的能力。未来的工作将集中在理解的规定pCAF E3连接酶。pCAF不包含其他已知的同源域E3连接,现在仍不知道如何与“双重”帽子和E3酶酶活动的监管。理解的机制控制这些函数和它们是如何同时监管很重要,进一步理解CIITA和适应性免疫反应的调节(38]。

缩写

CIITA:	二级反式激活因子
MHC II:	主要组织相容性二类
铝:	转译后的修改
pCAF:	p300 / CBP相关因素
帽子:	组蛋白乙酰转移酶
乌兰巴托:	泛素。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

朱莉·e·摩根执行中的所有实验论文。手稿是准备和朱莉·e·摩根的指导下写的苏珊娜·格里尔。

确认

作者要感谢黄雅疏博士协助蛋白质纯化GST-CIITA和罗纳德·l·Shanderson协助乙酰化零CIITA实验。乔治亚州立大学提供的资金是,疾病的分子基础的重点领域奖学金朱莉·e·摩根。

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