透明质酸合酶3零小鼠表现出减少肠道炎症和组织损伤的DSS-Induced结肠炎模型

文摘

透明质酸(HA)生产过剩的一个特点是多种炎性疾病,包括炎症性肠病(IBD)。透明质酸可以作为白细胞招聘分子和最常见的肠道炎症的小鼠模型,化学诱导的葡聚糖硫酸钠(DSS)实验性结肠炎模型,我们此前决定,改变在结肠分布的HA发生炎症。因此,我们假设,在病理的挑战,促进炎症。在这项研究中,我们测试了炎症的恶化在老鼠空透明质酸合酶基因(HAS1、HAS3或HAS1和HAS3)在DSS-colitis模型中。我们的数据表明,HAS1 / HAS3双和HAS3零小鼠结肠炎,保护野生型和HAS1 null老鼠相比,由测量体重,疾病活动,血清il - 6水平,组织学评分,免疫组织化学。最引人注目的是大幅增加在黏膜下微脉管系统,透明质酸沉积,白细胞浸润的结肠发炎组织野生型和HAS1零老鼠。我们的数据表明,HAS3起着至关重要的作用在推动肠道炎症。开发一个临时HAS3表达或功能的针对性治疗微循环可能成为一个理想的策略对回火结肠炎的病人接受IBD的耀斑。

1。介绍

哈是一个无处不在的碳水化合物聚合物由多种细胞类型和存在于健康和炎症组织的细胞外基质。这粘多糖的产生是长,直链聚合物的10⁴二糖单位交替n -乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸没有蛋白质核心或任何postsynthesis装饰或化学改性1]。监管透明质酸生产发生在细胞质膜表面由一个或多个透明质酸合成酶(HAS1 HAS2,或HAS3)酶之前被挤压到细胞外基质空间,支持阴离子分子(2]。时间与空间控制生产透明质酸的心里是至关重要的发展支持的观察,HAS2零突变小鼠embryonically致命是因为畸形的心脏组织3)和HAS3零老鼠显示改变神经活动和癫痫发作4]。HAS2生产透明质酸皮肤成纤维细胞对保护皮肤免受环境压力很重要,可以诱导细胞凋亡5,6]。透明质酸在几乎每一个组织和在眼睛的玻璃(尤其丰富7),关节滑液(8),肾脏近端小管(9),结肠的粘膜层(10,11母乳,脊椎动物(12]。HA甚至出现在血小板及其巨核细胞前体;然而,在这些细胞在细胞内积累空间(13]。透明质酸降解和细胞营业额主要由透明质酸酶的酶家族统治,(例如,HYAL 1和HYAL 2)在CD44-dependent [14),或者最近描述KIA1199蛋白依赖,CD44-independent时尚(15]。

我们实验室一直在调查HA在肠道炎症的作用,特别是当它与炎症性肠病有关。炎症性肠病包括人类疾病克罗恩氏结肠炎、溃疡性结肠炎,耀斑期间表现出增强的HA沉积的条件,或者炎症的时期10]。此外,我们表明,病毒感染,ER应激和炎症细胞因子(尤其是IBD相关因素,肿瘤坏死因子)导致形成HA丰富白细胞粘附矩阵肠道平滑肌细胞(10,16)和肠微血管内皮细胞(11]。这个公顷矩阵结合单核白细胞,包括单核细胞和淋巴细胞,并可能导致炎性浸润在结肠炎(招聘17]。

实验DSS-induced小鼠结肠炎模型是一种行之有效的和一致的方法来研究深刻的炎性改变,发生在肠道疾病进展(18]。我们之前证明透明质酸沉积在炎症和免疫细胞受损肠道组织中涌入这个模型(11]。此外,我们发现白细胞粘附,cable-like透明质酸在微脉管结构产生的表面和内腔DSS-treated老鼠。类似HA微脉管系统的结构观察结肠组织部分来源于IBD患者和重要的在体外发展人类肠微血管内皮细胞(HIMECs)隔绝结肠炎性细胞因子处理时,肿瘤坏死因子(13]。有趣的是,我们发现,专门HAS3 mRNA在HIMECs肿瘤坏死因子表达增加曝光,这表明HAS3酶主要负责生成腔的HA在疾病(13]。促炎的白细胞(17)和血小板(13家里这些电缆结构,降解成小的促炎信号分子可能使炎症循环(13]。基于这些观察结果,我们提出了增加产量的HA在病理事件,尤其是微脉管系统由HAS3哈,可能是一个关键球员在推动的无休止的循环炎症IBD患者所经历的(13]。

我们实验测试了扰乱公顷产量是否会影响炎症过程,发生在小鼠DSS-colitis模型,使用HAS1 null, HAS3 null, HAS1 / HAS3双零的老鼠。我们比较了疾病进展和组织学的变化在结肠疾病的十天的时间进程,发现老鼠携带HAS3 null突变有更严重的结肠炎分析的各种方法。减肥、疾病活动,结肠炎评分、循环il - 6的水平,和组织学/免疫染色都是改善HAS3零小鼠结肠炎。我们的数据表明,控制HAS3表情微脉管系统的IBD的患者可能是一个重要的目标站点治疗药物干预。

2。材料和方法

2.1。老鼠

所有实验动物福利协议批准Lerner研究所动物保健和使用委员会制度(IACUC)。所有在成人年龄和c57Bl / 6小鼠背景应变安置和培育在特定无菌(SPF) microisolator笼子标准Teklad辐照食物AALAC认证LRI生物资源单位和酸化水。野生型小鼠(c57Bl / 6 j物料编号000664)用于实验和育种HAS1/3双零老鼠从杰克逊实验室购买,巴尔港,我。HAS1 / HAS3双零老鼠,由穿越单一空鼠(19,20.),是一个慷慨的礼物从生物医学工程学系博士文森特Hascall Lerner研究所(5]。HAS1KO和HAS3KO单零老鼠繁殖产生的双零与野生型小鼠c57Bl / 6 j小鼠,然后杂交所需的零等位基因从一个双因子杂种的十字架。基因型经PCR使用试剂盒(阿拉米达,CA)准备基因组DNA和一个技术中心(麦迪逊,WI) PCR试剂盒在热科学HyBaid PCR表达机器(德威尔明顿)使用以下参数:运行95°C为30秒,30秒65°C, 1分钟和72°C, 35周期。每个引物组所产生的放大PCR产品如下:341个基点HAS1野生型等位基因(mHAS1s: 5′gacgttctggccctggtcctac 3′和mHAS1as: 5′gggctctactgctgcttggagg 3′)和320 bp HAS3野生型等位基因(mHAS3s: 5′ggaagcaggcataggtagccttg 3′和mHAS3as: 5′tgatcggcaccttaccaaccgag 3′)。零特定等位基因反义底漆(PGKpromAS-1: 5′gaggccacttgtgtagcgccaag 3′)是使用上述意义上引物来验证单(HAS1KO 331个基点,HAS3KO 320 bp)和双零老鼠基因型。成年小鼠相同性别的基因型和cohoused组不超过5每SPF小鼠microisolator笼LRI生物资源单位与12小时光/暗周期不断监控温度和湿度条件与畜牧业由LRI BRU员工。

2.2。DSS结肠炎

葡聚糖硫酸钠实验小鼠模型进行了如前所述[11]。短暂,老鼠接受辐照哈伦Teklad标准食物和酸化内部水随意在水瓶或添加2.5%的葡聚糖硫酸钠(160110号)(MP生物医学,梭伦,哦)。小鼠体重和监控日常结肠炎的迹象。老鼠(每个基因型)牺牲后IACUC批准方法天0,3,5,7,10。收集的血清是心脏出血。冒号被移除,测量长度(厘米)从直肠盲肠,然后固定在组织十倍体积的分子生物学年级Histochoice (AMRESCO,梭伦,哦)前处理LRI组织学核心服务部门。

2.3。疾病活动指数得分

在DSS的政府,所有老鼠都观察到的外在迹象结肠炎使用评分系统基于以前的研究(21]。点记录按照以下比例最低为0分,最大的共有11分。体重变化计算(当前天体重−开始体重)/体重×100年开始:(0)0 - 5%,(1)6 - 10%,(2)11 - 15%,(3)15 - 20%,(4)> 20%。姿势是观察到(0)正常,(1)弯腰驼背。观察外套毛皮(0)正常,(1)折边。观察大便纹理和一致性(0)正常,(1)软,(2)软,和(3)液体,血腥。观察直肠脱垂(0)没有,1毫米(1),(2)2毫米。

2.4。结肠炎得分

那天牺牲(第0天、3、5、7和10),1厘米直肠部分从所有老鼠和固定在Histochoice 24小时25°C。随后,组织处理和减少2.5 um截面与苏木精和伊红染色之前Lerner研究所组织学核心。直肠部分从所有老鼠根据以往的评级系统,最低得分5分,最高20分(22,23]。观察上皮完整性(1)完整的和良好定义的地下室结构,(2)完整的上皮细胞减少地下室结构,(3)在上皮细胞层和地下室结构,减少和(4)上皮和地下室结构的损失。观察白细胞的浸润(1),(2)稀疏,适中的(3),(4)重型。粘膜下水肿粘膜肌层以下是观察(1),(2),(3)温和,和(4)严重。观察消化道粘膜的增生(1),(2),(3)温和,和(4)严重。血管生成的变化都被记录下来,并指出增加数量,大小,和厚度的血管在结肠炎:(1),(2),(3)温和,和(4)严重。

2.5。组织学和免疫组织化学的直肠部分

苏木精和伊红染色直肠部分图像捕获10倍物镜在徕卡数码显微镜使用徕卡相机DFC425C和徕卡应用程序套件软件(徕卡公司,布法罗格罗夫,IL)。变异丰富透明质酸和位置的变化被观察到免疫染色后以前公布的方法(24]。简而言之,直肠部分被重复deparaffinized浸渍在以下解决方案:Clear-Rite 3(2×3分钟),Flex 100(2分钟,1分钟),Flex 95(2分钟,1分钟)(Richard Allan-Thermo科学,卡拉马祖,MI),和自来水。组织包围Pap-Pen(国际研究产品,太前景,IL)之前阻止2%胎牛Serum-Hank 30分钟的缓冲盐水(2% FBS-HBSS)。生物素化的透明质酸结合蛋白(HABP) (Calbiochem-EMD微孔,Billerica, MA)被稀释(1:100)在2% FBS-HBSS和应用在一夜之间在4°C。随后,幻灯片在哈佛商学院申请前洗3次链霉亲和素- 488(1:500)(生活技术,大岛,纽约)2% FBS-HBSS 45分钟在黑暗中在25°C。幻灯片洗3次在哈佛商学院前安装玻璃掩护下Vectashield + DAPI(向量实验室,伯林盖姆,CA)和密封指甲油。染色组织在10倍放大成像用徕卡显微镜使用ImageProPlus和Photoshop软件。比例尺条= 200。半定量的测量黏膜下肿胀的组织学图像和半定量的HA沉积微密度分析的免疫组织化学与ImageProPlus软件进行图像。

2.6。血清il - 6

血清收集来自所有老鼠Microtainer血清分离器管(正迪金森,富兰克林湖,新泽西),离心机在4100 rpm和存储−80°C。20毫升的血清进行了测试在所有时间点重复BioLegend小鼠il - 6 ELISA马克斯平台(BioLegend,圣地亚哥,CA)根据制造商的指示。蛋白质浓度的血清也测量使用Bio-Rad布拉德福德试验系统(Bio-Rad大力神,CA)。试验板都读SpectraMax 340 pc384(分子设备公司,桑尼维尔CA)。il - 6的浓度(ng / uL)当时规范化在血清总蛋白(ug / uL)来确定ng il - 6 / ug总蛋白使用Microsoft Office Excel 2010图形与GraphPad棱镜5软件紧随其后。

2.7。统计数据

所有的数据进行了分析与GraphPad棱镜5软件。收集到的数据从每组的老鼠相同的基因型在同一时间点的绘制与平均误差表示的平均数标准误差(SEM)。单侧未配对的学生以及或Mann-Whitney以及非参数数据在95%信心被应用于比较突变株与野生型菌株显示参数或一个单因素方差分析测试的意义是应用在比较多个组。

3所示。结果

测试我们的假设,哈是一个关键分子,导致肠道炎症在肠道炎症,我们对待老鼠零HAS1或HAS3或HAS1 / HAS3实验DSS-colitis模型。减肥是一个可靠的和接受的疾病活动在这个模型(22,25]。图1说明所有的基因型,除了HAS1零小鼠,获得少量(1 - 3%)的体重在DSS的头三天的治疗。持续暴露在DSS,然而,导致戏剧性的减肥野生型组第五天至第七天但不太严重的三个零组,在这些天。在所有三个零组在各个时间点上均受减肥与野生型小鼠相比,HAS3零组显著(白天)减少体重7(图1 (b))。尽管HAS3之间的平均体重测量和HA1零组显著,它接近但没有完全达到统计学意义在7天时间点。HAS3零老鼠失去了不到5%的平均体重比野生型集团的平均损失11%。我们集中在7天时间点,因为这是最戏剧性的变化的时间点发生疾病进展,尽管动物继续通过第十天减肥,不定地痛苦。

除了减肥,2.5% DSS-treated c57B背景/ 6株野生型老鼠每天5和7之间通常表现出直肠出血,大便变得柔软,宽松的液体的第十天。在第十天,老鼠的皮毛可以折边出现的老鼠显示减少运动性和采用弯腰驼背的姿势。因此,我们注意到这种疾病活动(戴)通过分配点之前报道后得分指数在方法部分,所述基于减肥,折边的皮毛,弯腰驼背的姿势,直肠出血,血便,直肠脱垂(21]。我们的数据显示,HAS3 null老鼠显示疾病活动得分最低,在所有时间点(图2(一个)相比其他三组。在第七天戴比较,我们发现HAS1小鼠与野生型小鼠相比是更严重的影响(),而HAS3和HAS1 / HAS3 null老鼠更保护(和职责。)(图2 (b))。另一个相关的标志为这个模型结肠缩短结肠炎得分。在疾病的进展,整体结肠长度缩短从-10年的9.5厘米未经处理的小鼠大约5.5 - 6厘米在野生型小鼠DSS了10天。图3说明了冒号的缩短在所有基因型的DSS治疗HAS3零老鼠保留最结肠长度在7天(和第十天)时间点,分别。

水平升高的炎症细胞因子il - 6在IBD患者和记录在实验小鼠接受DSS (26,27]。测试体重的减少戴和保留是否观察到HAS3零老鼠也伴随着循环il - 6水平的变化,我们收集了所有小鼠的血清那天牺牲通过心脏穿刺。血清il - 6水平,以一个总蛋白浓度的ELISA格式和规范化,是呈现在图4。我们观察到HAS3 null老鼠拥有最低数量的循环il - 6在所有时间点我们测试,尤其是在第七天,与野生型小鼠相比()。在第七天,il - 6水平HAS3零难以觉察的老鼠,而野生型、HAS1 null,和HAS1/3双零老鼠都有升高循环il - 6在1.0 -2.5纳克/毫克。有趣的是,HAS1 / HAS3零小鼠il - 6的最高水平,甚至超过水平中发现的野生型小鼠在每个时间点。

组织学分析,利用评分系统前面描述的(22,23),是一个有价值的工具方法评估在结肠组织损伤实验诱导结肠炎的事件,因为它是评估组织损伤的程度在组织从IBD患者手术切除。苏木精和伊红染色(圆))直肠部分(结肠炎的地方开始在这个模型)从老鼠牺牲在每个时间点观察和评分对隐窝上皮侵蚀/损伤,粘膜下肿胀、白细胞浸润,粘膜肌层增生,血管生成增加使用系统所描述的方法。代表组织部分呈现在图6。随着小鼠暴露于DSS的时间增加,所有基因型组的平均得分结肠炎也增加(图5(一个))。然而,一个独特的和戏剧性的分离发生在比较HAS3零组(结肠炎得分10.5)野生型小鼠(结肠炎得分16.5)在第七天(),而没有区别的平均评分比较野生型和HAS1零老鼠在第七天(图5 (b))。HAS1/3 null组得分低于野生型组分数和方法但不完全满足统计学意义这一天7次。在第十天时间点,不同的是更加明显和演示了减少在结肠炎严重HAS3酶缺席,HAS3 null和HAS1/3 null(图组5(一个))。

中发生的深刻变化鼠标10天以上的远端结肠DSS-induced结肠炎可以看到在图6。远端结肠(直肠)部分被选为特定分析因为这个模型是细菌驱动和直肠区微生物最高负担。一旦上皮细胞层被抹去,地穴损坏就会由于连续化学接触,直接微生物与宿主免疫细胞发生的交互。类似病变通常观察到人类IBD患者肠道组织炎症反复耀斑。在粘膜下水肿和上皮损伤开始第三天在野生型和HAS1零组,这种效果是显著推迟或减少HAS1/3和HAS3零鼠标团体甚至在10天的治疗(图6)。此外,白细胞浸润,粘膜肌层增生,血管生成在第七天都明显增加,第十天在野生型和HAS1零组而不是HAS1/3或HAS3零老鼠。确定在纵向直肠黏膜下扩张的程度折叠在每个组织的实验性结肠炎在图6(一)使用成像软件,我们测量的面积肿胀(图6 (b))。粘膜下代表地区测量表明在未经处理的野生型老鼠。)图像和测量显示扩张的巨大变化黏膜下地区的野生型和HAS1零老鼠,尤其是在第七天,第十天,相比HAS3零和HAS1/3零老鼠。这些相邻的组织化学染色与直肠部分为透明质酸沉积和间隙在为期10天的时间当然也揭示了截然不同的HA染色模式缺乏完整HAS3基因的老鼠。图7表明在所有组的沉积增加透明质酸在第三天在黏膜下层和结肠的粘膜固有层/地区。到第五天,野生型和HAS1零组、粘膜下水肿非常明显,而这种肿胀并没有发生在动物HAS3删除。在7 - 10天,老鼠拥有HAS3(野生型和HAS1零组)表现出非常明显的持久性和透明质酸沉积增加周围的粘膜受损以及在黏膜下层血管高度的区域。半定量的光密度分析HA染色纵向折叠的固有层和粘膜下区域进行跟踪的变化在每个基因型透明质酸在隔间的结肠炎(图7 (b))。每个小班的区域测量直肠折了的黄色蒙面地区未经处理的野生型老鼠的形象。在动物的挑战,自我平衡的HA水平远端结肠组织的固有层细胞外基质通常是减少与删除酶HAS1(~ 50%),尤其是HAS3(~ 75%)与野生型相比。黏膜下层,整体生产低水平的HA /区域,但减少的关系水平的HA和删除HAS1 HAS3也观察到。HAS3空组织的意外,HA水平低于HAS1 / HAS3双删除肠道组织。

类似的HA分析部分从老鼠经历DSS获得治疗。与DSS的挑战,野生型固有层中HA含量保持相对稳定,直到第五天当HA含量下降,对应的时间白细胞浸润和地下室的破坏明显。矛盾的是,最高水平的HA HAS1空鼠第三天(1.8倍比野生型老鼠)和更高的HA水平维持在整个病程中,达到5倍野生型水平第七天当疾病病理达到高峰期。相比之下,HAS3零附近的动物保持野生型老鼠中HA含量的固有层在整个时间进程,和HAS1 / HAS3双零动物显示中间表达式相比HAS1零和HAS3空组织。HA含量的粘膜下组织也在改变在DSS结肠炎,野生动物显示一个伟大的增加远端结肠结缔组织HA在7天,黏膜下炎性浸润时的时间点(图最明显6(一))。类似于固有层,HAS1老鼠显示更高的黏膜下表达整个DSS时间进程,和HAS3老鼠表现出正常的低表达。值得注意的是,突变基因型和双零达到7天或表现出野生型小鼠结肠的粘膜炎症。这些数据提供了快照的HA的存在肠和它如何改变由于酶突变。然而,因果关系表达和HA沉积从这个数据不可能评估炎症模型中自细胞组成的组织变化大大在疾病。独立的表情,失去上皮细胞导致公顷失去固有层(特别是明显10天,图6(一))和浸润白细胞和血小板有能力降低哈。另外,在炎症过程中活性氧生成可以调解HA的解聚。

放大的图像从7天DSS治疗野生型和HAS3零老鼠呈现在图8他们显示截然不同的组织结构。首先,从肠道流明向下观察,固有层(Lp)野生动物失去了所有上皮细胞(E)以及地下室建筑,和浸润白细胞这个组织区域(图中十分普遍8(a))。在HAS3零部分(图8(c))上皮和固有层地下室结构在很大程度上维护,和很少的浸润白细胞的人口增长。其次,而肌粘膜(毫米)略有扩大HAS3 null的动物,它没有达到总厚度观察野生型组。第三,黏膜下层(Sm)的野生型小鼠结肠相比大大扩大HAS3零组织和包含更多的和厚壁血管(V)。引人注目的是,还有一个更大的存在浸润白细胞(左)在野生型小鼠结肠的粘膜下层的空间比HAS3零组织(图8(a)和图8(c))。HA沉积在血管发炎和高度的黏膜下层区域的野生型部分也极大的增加而第七天治疗HAS3零部分(图8(b)和图8(d))或未经处理的野生型控制(图7)。缺乏大量的血管扩张和降低透明质酸沉积在HAS3零黏膜下层可以解释为什么这些小鼠的白细胞渗透是小7天。

4所示。讨论

透明质酸可以在几乎所有的脊椎动物体内组织的位置。一个成年人移交每天估计有15克的HA通过平衡的组织特定的合成透明质酸合酶酶(HAS1、HAS2 HAS3)和控制透明质酸酶降解酶(HYAL1 HYAL2) [28]。Misregulated HA代谢在人类患者和严重的生理后果可以一再基因敲除小鼠模型中。改变具有酶功能已与多发性骨髓瘤(HAS1) [29日],renal-controlled液体平衡,心脏形成,长骨/脊柱发展,伤口愈合(HAS2) [3,6,9,30.- - - - - -33),癫痫(HAS3) [4]。消融的透明质酸酶酶功能导致黏多糖病溶酶体储存障碍(HYAL1) [34,35),颅面骨疾病,心脏瓣膜缺陷和血小板减少症(HYAL2) [36,37),而肺癌(HYAL3) [38]。我们因此惊讶,HAS1 null, HAS3 null,和HAS1 / HAS3双零小鼠没有明显的身体、发育、生殖缺陷。这一发现,连同HAS2空动物胚胎致命的数据,表明HAS2 HA发电机在体内是至关重要的。HAS2被认为是主要的诱导间充质细胞合酶包括成纤维细胞和平滑肌细胞39,40]。这里给出的数据显示结肠的HA染色(图7)支持这一想法。HA含量挑战HAS1 / HAS3 null(只有HAS2表达)冒号比野生型老鼠不是截然不同的组织表达所有三个同功酶。问题出来了:为什么有三个酶同样的产品当HAS2似乎是足够的。我们假设HAS1 HAS3可能扮演一个角色时的压力和测试这个概念在化学诱导,细菌炎症模型驱动的。

在我们先前的实验DSS-induced结肠炎的研究和研究报告,有直接向外相关性疾病和病理变化的迹象发生在肠道组织(11,21]。有趣的是,郑等人曾报道,HAS2和HAS3信使rna调节在DSS结肠炎小鼠结肠组织(41]。组织学染色直肠部分野生型小鼠肠道损伤的揭示了一个非常一致的模式包括上皮细胞和地下室损失;地区的粘膜下水肿含有透明质酸沉积增加;增加血管化;和炎性细胞浸润破坏网站。确定扰动公顷产量可能会改变结肠炎,我们远HAS1/3双零与野生型小鼠,背景匹配c57B / 6小鼠生成单个HAS1或HAS3零菌株用于当前DSS-colitis模型研究。测试所有四个基因型显示HAS1零小鼠和野生型小鼠,这两个保留HAS3基因,也同样不利影响DSS政府对所有点的分析。HAS3零组,类似于HAS1/3双空队列,DSS-induced影响远不及结肠炎。事实上,我们的数据表明,HAS3老鼠更耐HAS1/3集团。HAS3 null老鼠戴最低,结肠炎得分最低,最低的循环促炎细胞因子il - 6的水平,与野生型相比,HAS1 null, HAS1/3零组。 Il-6 is cytokine that drives inflammation and is an accepted marker of inflammatory changes, especially in gastrointestinal disorders [42,43]。先前的报道被其他人表示强烈的损失补偿HAS1和HAS3的更大的感应HAS2 [6]。也许这小差异占更高水平的保护中观察到HAS3零组相比HAS1/3 null。

总体而言,我们实验室专注于研究HA的角色在启动及延续的炎症循环炎症性肠病的患者中观察到。因为我们以前认识:(1)上级HA存在在IBD结肠发炎组织相比non-inflamed IBD组织以及non-IBD控制(10];(2)哈可以作为白细胞粘附分子激活人类肠道平滑肌细胞(17)和微血管内皮细胞(11]在体外;和(3)变化哈改造前炎症发生在活的有机体内在结肠炎模型,我们问是否中断正常的HA产量在活的有机体内会改变引起的肠道炎症。在当前的工作我们发现删除HA合成的酶,特别是HAS3,但不是HAS1,显著降低小鼠结肠炎。白细胞浸润,上皮下降,血管扩张和组织损伤都没有HAS3减少。这表明HA由HAS3表达细胞产生越来越多的炎症反应是至关重要的,而HAS3基因是重要的应对挑战。接下来的问题是如何HAS3实现这个功能?至少有三个可能的解释是合理的:HA产品不同,表达的位置是不同的,或调节HAS3基因表达的因素是不同的,尤其是HAS2相比。

数据支持这个想法,三公顷合成酶使不同大小的产品已经提出;HAS1和HAS2膜制剂合成非常大的HA链(平均分子质量2×10⁵~ 2×10⁶Da)而HAS3会产生较小的HA尺寸范围(1×10⁵~ 1×10⁶Da) [44]。一个可能的原因HAS3似乎贡献所以明显炎症可能是由于日常的生产小尺寸的HA已知信号促炎、pro-angiogenic反应通过toll样受体4和245- - - - - -47]。然而,Brinck日显示,使用全细胞表达不同的单一酶,公顷大小没有显著不同(48]。这个微分大小区别理论,在任何情况下,有点难以接受在组织设置透明质酸降解酶和细胞间隙机制是有效的和可能改变所有进一步公顷大小。

我们之前的数据提供支持这两个位置的表达和煽动刺激可能是重要的特定HAS3(与HAS2)参与炎症。我们已经表明,HAS3是重要的提高微血管内皮细胞在炎症条件下(即哈。肿瘤坏死因子的存在),HA产生白细胞粘附[11]。相比之下,肠道平滑肌细胞产生增加哈,主要是通过调节HAS2(未发表)和不产生白细胞粘附矩阵对TNF的回应α(17]。此外,我们已经确定,人类血小板被激活时,有能力使用酶片段HA内皮表面HYAL2 [13,49]。因此,我们的新和之前报道的数据显示一个场景的microvesssels肠部分解释DSS结肠炎的病理变化和人类炎症性肠病;HAS3既是一种白细胞产生的HA招聘分子艾滋病外渗到肠组织,而且是血小板的衬底来创建HA碎片驱动细胞激活和血管生成。进一步的实验使用血管的具体删除HAS3可能是有用的在决定如果这个场景是正确的。

除了概念,疾病进展是由于基因表达,HA淀积的大小和位置,一个不能排除可能的角色有酶的活动的功能聚合HA电缆。先前的研究已经表明,HAS1和HAS2酶可以独处变成一个复杂的HA生成分子机器(50,51]。不活跃HAS2突变蛋白被证明与野生型二聚HAS2因此阻塞公顷生产。我们的数据表明HAS1可能作为负调节的HA合成HAS2因为HAS1 null和HAS1/3双零突变体显示更高水平的HA沉积在结肠炎。最终确认的角色HAS1破坏者将需要适当的标记酶的生成在体外分析或生成新的转基因老鼠。

目前方案利用抗击炎症结肠炎包括anti-TNF [52]和anti-IL-6 [26)疗法。然而,一些病人停止回应这些疗法。最近,几组报道使用RNAi治疗脂质体(53概述了纳米颗粒分子[]或54)有选择地击倒基因血管生成在肿瘤血管在活的有机体内,没有导致其他不相干的沉默更大的血管。由于HAS3微脉管系统中表达,也许有一天可以有选择性地针对RNAi HAS3表达,特别是在这些患者,不再积极回应传统药物疗法。

5。结论

我们的数据表明HAS3起着至关重要的作用在推动肠道炎症而HAS1可能采取行动抑制透明质酸合成的酶。HAS3零老鼠表现出减少肠道炎症和组织损伤DSS-induced结肠炎模型与野生型相比,HAS1 null, HAS1/3双零老鼠,老鼠缺乏HAS1展览提高HA沉积在固有层和黏膜下层诱导结肠炎。我们建议未来的研究旨在控制HAS3表达式在肠道微脉管系统可能揭示新的治疗策略对病人患有炎症性肠病。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者欣然承认研究该项目资金从尤尼斯•肯尼迪•施莱佛国立儿童健康和人类发展研究所NIH / NICHD格兰特5 r01 HD061918-03卡罗尔de la丛林和资金支持的项目卓越Glycoscience NIH / NHLBI格兰特1 p01 HL107147-01卡罗尔de la丛林。他们也感谢LRI形象核心和组织学员工,埃里克·迪斯卡桑德拉罗杰斯,黛安娜Maholovic成像技术援助和组织处理。他们感谢整个LRI生物资源员工优越的动物在这个研究。他们感谢de la丛林实验室的成员有益的讨论。

引用

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