连接子组蛋白H1.2是t效应细胞中对细胞因子剥夺的凋亡反应的中间体

摘要

组织稳态是一个动态的过程，包括增殖和去除多余或损坏的细胞。在哺乳动物免疫反应中，由细胞外环境中限制性营养因子/细胞因子触发的分化T细胞的协调缺失就是例证。然而，细胞外信号作为凋亡触发器被感知和转导的机制仍不完全清楚。t效应细胞依赖于细胞因子生存，并在细胞因子退出后发生凋亡。在这里，我们报道了一种核输出机制的抑制剂leptomycin B (LMB)，可以保护t效应细胞免受凋亡，这涉及到凋亡通路中的一个核中间体。有证据表明，连接蛋白组蛋白H1.2定位于细胞质，通过对LMB调控敏感的机制，激活凋亡信号，最终导致t效应体的核和线粒体损伤，以应对细胞因子剥夺。H1.2被检测到与促凋亡线粒体生物Bak的复合物及其由jun - n-末端激酶(JNK)调控的亚细胞定位，JNK是t效应细胞凋亡级联反应的中间体。这些数据表明，代谢应激可能会影响H1.2在线粒体中的活性，从而成为t效应细胞凋亡的分子开关。

1.介绍

在多细胞生物中，细胞通过分裂和分化获得不同的细胞命运。然而，分化和增殖是平衡的程序删除过剩或受损的细胞，这对组织稳态至关重要。调节细胞死亡的细胞机制的核心元素在不同的门中被保存[1]哺乳动物细胞中已经描述了至少两个调节细胞凋亡的主要途径。通过TNFR（肿瘤坏死因子受体）的配体接受接合引发的信号传导级联，构成外在途径[2］．内源性通路由代谢和基因毒性应激源激活，并与Bcl-2家族成员整合在线粒体中，其中包括促凋亡和抗凋亡成员，作为这些反应的主要调节者[1，3.，4］．这两种途径之间的相互影响是有据可查的。细胞死亡途径在发育和成年组织中有不同的部署，如在神经、生殖和免疫系统中所见，在这些系统中，细胞过度产生，然后通过凋亡被清除[5- - - - - -9］．在细胞外环境中，限制营养物质的竞争是一种广泛存在的细胞数量调节机制[10- - - - - -12］．然而，细胞感知微环境变化的机制尚不完全清楚。

在本研究中，我们试图在一个具有良好特征的模型系统中解决这个问题，该系统在细胞培养中重现了分化T细胞的缺失。成熟T细胞室的特征是细胞数量在抗原刺激下急剧增加，随后最终消除由此产生的抗原反应性T效应细胞，这是一个贯穿成年生活的循环，对免疫功能来说是必要的[13，14］．在免疫反应中产生的t效应依赖于细胞因子或营养因子的营养吸收和实验体外和在活的有机体内模型系统表明对营养剥夺对营养剥夺的凋亡反应是通过反应性氧（ROS-）所依赖的信号传导介导的，该信号传导在线粒体上会聚[15- - - - - -18］．虽然t细胞对细胞因子和ROS-Bcl-2家族信号轴的依赖性分别已经确定，但感知和整合细胞外环境变化的细胞机制仍未被描述，并成为本研究的重点。

我们的实验表明，核效应器在启动t效应器的凋亡信号中起着关键作用，因为阻断核输出机制可以保护细胞免受凋亡。基于之前描述的连接子组蛋白H1.2在凋亡级联细胞增殖中的作用，我们跟踪了t效应子中连接子组蛋白H1.2亚型的空间动力学。我们的实验表明，核输出机制和JNK活性调节H1.2易位和t效应细胞凋亡的活性。我们提供了H1.2与Bcl-2家族促凋亡蛋白Bak相互作用的证据，并提出H1.2在线粒体整合的凋亡信号级联中聚集。它在细胞凋亡中的作用表明，在H1.2消融t效应细胞后，细胞因子剥夺可以消除细胞凋亡损伤。最后，我们的实验表明，jun - n-末端激酶(JNK)在调控H1.2动态中，这一信号级联在组织稳态中发挥了更广泛的作用。

2.材料和方法

2．1．老鼠

C57BL/6小鼠从Jackson实验室(缅因州，美国)获得，并在印度班加罗尔的国家生物科学中心(NCBS)的动物设施进行维护。涉及动物的操作得到了印度班加罗尔NCBS机构动物伦理委员会的批准，并遵循了印度政府动物实验控制和监督委员会(CPCSEA)规定的规范。

2．2.试剂

抗体按规定的稀释度使用，并从以下来源获得:来自Santa Cruz (Santa Cruz, CA)的H1(1:10 00)和p38MAPK (1:10 00);AIF (1: 500) from Chemicon (Billerica, MA);H1.2(1: 1000)来自Proteintech Europe(曼彻斯特，英国);H3 (1: 500)， H3Ac (1: 500)， HP1α(1: 1000)来自Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY);α-actin(1: 500)和α-tubulin (1:25 0) from Neomarker (Fremont, CA);Cell Signaling Technology (Beverly, MA)的Bak (1:1000)， Cox-IV(1:250)和p-JNK/SAPK(1:500)。H1.2 shRNA质粒和干扰对照均来自Origene Technologies (Rockville, MD)。TMRM(四甲基罗丹明甲酯)取自Sigma (St. Louis);Annexin-V AlexaFluor-488来自Invitrogen公司(美国卡尔斯巴特);无心酸、leptomycin B和SP600125来自Calbiochem (San Diego, CA)。

2.3。T-效果的产生

采用小鼠IgG包被磁珠(GAMT) (NEB, USA)或CD3+ T细胞分离试剂盒(R&D Systems)从6 - 8周龄C57BL/6小鼠脾脏中分离T细胞。t效应器如所述产生[17］．简单地说，t细胞被刺激使用αcd3 /α-CD28结合珠(Invitrogen)在2.0 × 10⁶细胞/mL或可溶性抗cd3 (500 ng/mL，克隆2C11;研发系统)2.5 × 10⁶T细胞/mL添加10⁴脾细胞附着。48小时后产生的t效应器用于检测或在1μg/mL细胞因子白细胞介素-2 (R&D Systems) 24-36小时。活化是通过CD69和CD25的表达以及t细胞形态的改变和大小的增加而建立的[19］．

2.4。细胞凋亡的测定

细胞因子剥夺试验按所述进行[17］．0.4×10⁶/mL t效应剂在过量培养基和磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤三次，以去除结合的细胞因子，然后继续在有或没有IL-7的培养基中培养。实验表明，在细胞因子剥夺后不同时间点测定细胞凋亡。对于亚细胞分离的分析，通常在6小时采集细胞以分析H1.2动力学，并在8小时的延迟时间点检测AIF的转位。在H1.2和AIF易位同时检测的实验中，样品是在较早的6小时采集的。

用Hoechst-33342 (1μg/mL)，使用带有紫外线过滤器的荧光显微镜对每个样品中至少200个细胞的核形态进行评分。Annexin-V染色:0.3 × 10⁶t效应剂与Annexin-V(1:60 /10)孵育⁶PBS洗1次，加入碘化丙啶后立即流式细胞仪分析。为了评估线粒体跨膜电位，将细胞与50 nM线粒体特异性染料TMRM在37°C的培养基中孵育15分钟，然后用PBS温和冲洗两次，立即通过流式细胞仪进行分析。

2．5．逆转录病毒感染

用shRNA质粒包装小鼠逆转录病毒1μg的DNA与1μ包装载体pClEco在HEK293T细胞中的表达。48小时后，浓缩培养上清液，按前面描述的方法感染t细胞[17，20.］．将感染的T细胞维持在含1μg/mL IL-2, 2 ng/mL IL-7, 1μg/mL嘌呤霉素3天。用Ficoll分离活细胞，用IL-2继续培养24小时，然后进行细胞因子剥夺试验。Western blot检测蛋白水平。

2．6．免疫印迹分析

0.3 - -0.5×10⁶用SDS裂解缓冲液(2% SDS，甘油，溴酚蓝)、1 M DTT和1 M Tris-HCl (pH 6.8)中添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒抑肽酶、白细胞介素和胃抑肽酶(2μg / ml各），1 mm PMSF，1 mm NAF和1 mm NA_3.签证官₄在100°C下放置10分钟。使用以前建立的协议[17，20.]，全细胞裂解液用SDS-PAGE溶解，转移到硝化纤维素膜(GE Healthcare)，在4°C下用生产商推荐的一抗浓度孵育过夜。膜用TBS-Tween20冲洗三次，然后用hrp标记的二抗(CST, 1:1000稀释)在rt条件下冲洗1小时。膜是通过使用Amersham Hyperprocessor或ImageQuant LAS 4000生物分子成象仪(GE Healthcare)暴露于x射线胶片中来显影的。

2.7。亚细胞分离

10×10⁶t效应剂用于亚细胞分离方案[21］．使用遵循制造商的指示，使用Ne-un核和细胞质提取套件（Thermo Scientific）获得细胞质和核级分。在SDS裂解缓冲液中煮沸等同的核和细胞质级分，用于蛋白质印迹分析。

2.8。免疫沉淀反应

10×10⁶在没有细胞因子的情况下培养的t效应细胞在4°C下溶解1小时，在含有蛋白酶抑制剂的1% CHAPS裂解缓冲液中溶解(2μG / ml抑肽酶，Leupeptin，胃蛋白酶，1 mm PMSF，1 mm NAF和1 mm NA_3.签证官₄)．10μ用L抗体在4°C下用蛋白G琼脂糖珠(Pierce生物技术)在旋转器上沉淀免疫复合物2小时。用1700 rpm的冰冻PBS洗涤5次，然后在SDS裂解缓冲液中煮沸10分钟进行Western blot分析。当以细胞质部分作为IP输入时，为20 × 10⁶如上所述，对t细胞进行亚细胞分离，获得的细胞质部分用于免疫沉淀。True-blot HRP (Ebioscience)已用于Bak和H1.2的免疫印迹。

2.9。统计方法

所有图表都显示了至少三个独立实验的平均值±SD。统计意义计算使用两个群体的学生-tests，置信区间如下:*99%和**99.9%。

3.结果

3．1.t效应细胞的凋亡是由核事件调控的

t细胞对抗原的反应是增殖和分化，产生谱系归属效应，其中大部分死亡，标志着免疫反应的终止[14］．这一进程的关键要素可以概括一下体外，允许对t细胞凋亡的分子调控进行研究[16- - - - - -18，20.，21］．利用该实验系统，我们发现t效应剂中细胞因子的退出引发了凋亡损伤，其特征是细胞核碎裂和细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)外化(图)1(一)和1 (b))．线粒体完整性的丧失是细胞遭受凋亡胁迫的另一特征，反映在黄酮类蛋白AIF(凋亡诱导因子)的空间再分配中[22］．AIF是一种线粒体膜间空间驻留蛋白，由于线粒体外膜完整性丧失而从线粒体释放，并易位到细胞核介导DNA损伤[21，23］．在在剥夺方案发作之前评估的细胞因子培养的T细胞中，在与线粒体定位一致的细胞质分数中检测到AIF（图1 (c))．细胞因子戒断后T细胞的亚细胞分馏表明，在核分数中检测到AIF的大量信号（图1 (d))．在这些分析中，我们还探讨了核异染色质结合蛋白Hp1的分布α线粒体基质驻留Cox-IV，以确定馏分的纯度(图1 (c)- - - - - -1 (e))．

Leptomycin B (LMB)是一种阻断核出口的Crm1抑制剂，可显著减少t效应体的凋亡损伤(图)1(一)和1 (b))，暗示级联中存在核中间体。LMB通常在0.3 - 10ng /mL浓度范围内使用，但较低浓度也可有效阻止核输出[24］．由于0.3 ng/mL的LMB在培养中对t细胞具有毒性，我们测试了较低浓度的LMB，发现0.03 mg/mL或0.003 ng/mL的LMB对细胞因子培养的t效应细胞具有良好的耐受性。由于两种浓度对细胞凋亡的保护效果相当(未显示)，使用低浓度LMB的实验已被用于当前的研究。AIF在无细胞因子培养但有LMB的细胞中的分布(图)1 (e))恢复到活细胞的模式(图1 (c))，说明LMB可防止线粒体外膜损伤，这是AIF释放的必要步骤。这些观察表明，细胞核内的事件影响凋亡级联的早期、线粒体前步骤。连接子组蛋白H1.2已被证明启动由线粒体整合的凋亡级联反应，首次在未成熟t细胞的DNA损伤反应中报道[25］．H1.2依赖的凋亡信号的激活与其从细胞核的移位有关。因此，在随后的实验中，我们评估了细胞分布和H1.2在t效应细胞凋亡中的可能参与。

３．２．t效应细胞凋亡中H1.2定位的变化

H1.2通常在细胞核中被检测到，这在培养细胞的核和细胞质部分的分析中得到了证实(图)2(一个))．与这种分布相反，亚细胞分裂后的细胞因子撤退(在6小时的剥夺协议)的特点是出现H1.2的胞浆池(图2 (b))．这使得H1.2的易位在凋亡过程中相对较早的时间点，远早于实验条件下明显的核损伤证据。线粒体驻留蛋白Cox-IV和核蛋白HP1的分布α在这些试验中分别建立细胞质和核组分的纯度。与抑制凋亡的核损伤相一致，如果LMB被包括在细胞因子撤退的条件下，H1.2的分布恢复到活细胞的模式，并且只在细胞核中检测到(图)2 (c))．为了评估H1.2定位改变的功能含义，并阐明其在细胞凋亡中的作用(如果有的话)，我们使用RNA干扰方法来消融t效应蛋白中的H1.2功能。

t效应子使用带有shRNA的逆转录病毒转导到H1.2或一个扰乱的对照，并在含嘌呤霉素的培养基中培养，如材料和方法所述，以便为转染细胞富集[17］．在NIH3T3成纤维细胞系(未显示)中建立了shRNA消除H1.2的有效性，如图所示，t效应蛋白的表达明显降低(图)2 (d)插图)。在接下来的实验中，我们评估了被扰乱或H1.2 shRNA处理的t效应蛋白对细胞因子剥夺的反应。与用杂乱shRNA转导的细胞相比，H1.2蛋白水平降低的细胞免受细胞因子剥夺引发的核损伤(图)2 (d))．为了评估H1.2的损失，还保护了线粒体损伤，我们使用了基于流式细胞术的完整细胞分析。线粒体跨膜电位的丧失是对经历细胞凋亡的细胞器的损伤和特征的敏感指标。因此，如果H1.2消融受到细胞因子剥夺触发的线粒体损伤的受保护的T效应，则测试了。在这些实验中，通过对电位染料TMRM的摄取来评估线粒体活性的变化。与表达对照的细胞相反，扰扰ShRNA，TMRM强度在细胞中的存在或不存在细胞中的存在性或不存在H1.2与死亡保护一致（图2（e）)．这强烈表明，减少了H1.2水平的影响，在细胞因子戒断的条件下，在细胞中观察到的线粒体损伤。我们没有观察到H1.2耗竭在T-效应中的有害作用在细胞因子培养中，表明H1.2在对凋亡刺激的反应中的特定作用。这些数据定位了H1.2的易位和活性在步骤控制事件中，其在T-效应器中凋亡级联的受损的线粒体功能和核完整性。

3．3．H1.2与t效应器中的Bak相关联

据报道，H1.2定位于线粒体，并参与涉及线粒体驻留蛋白Bak的凋亡级联反应[25，26］．前述部分中描述的实验表明H1.2活性会聚在线粒体功能上。因此，我们接下来在细胞因子剥夺下的T-效应器中的BAK和H1.2之间的相互作用。这些蛋白质的免疫沉淀（IP）作为复杂的是物理协会的证据（图3(一个))，通过识别H1蛋白家族的抗体或针对H1.2的抗体证实了这一点(图)3(一个)和3（b）)．尽管作为IP分析输入物的裂解液是核后上清，我们确认在免疫沉淀复合物(IP)中未检测到核心组蛋白H3，这表明在免疫印迹中不太可能检测到H1.2的核池(图)3(一个))．注意Bcl-2家族蛋白对洗涤剂的敏感性[27，这些实验使用较温和的洗涤剂CHAPS生成细胞裂解液来评估这些相互作用。反向免疫沉淀也证实了t细胞中Bak和H1.2之间的关联(图)3（c）)．为了排除免疫沉淀复合物被核蛋白污染的可能，剥夺t效应子的细胞质部分(纯度由排除核蛋白HP1确定α)免疫沉淀Bak。当细胞质片段作为输入时，H1.2在Bak复合物中免疫沉淀，证实了这种关联发生在细胞核外(图)3（d）)．到目前为止，实验表明H1.2是t效应细胞凋亡反应的关键中间体。在以前的工作中[17，涉及jun - n末端激酶(JNK)的分级相互作用已被证明可调节t效应细胞凋亡。因此，在接下来的实验中，我们试图将H1.2的活性定位于t效应细胞凋亡级联反应中已知的线粒体前中间体。

3．4．JNK活性调节t -效应器的H1.2动态

ros依赖JNK的激活调节剥夺诱导的t效应细胞凋亡和其他细胞类型的凋亡级联[17，28］．因此，我们提出JNK是否抑制t效应体中H1.2的易位。为了调节JNK活性，我们使用了SP610025抑制剂，该抑制剂在早期的实验中被证明可以调节t效应细胞中的JNK活性[17］．在核和细胞质部分分析中，在剥夺协议开始时添加SP610025的培养中，H1.2的分布与对照细胞相当，并且只在核部分检测到(图)4（a）)．证实了早期的报道，并与其对H1.2亚细胞定位、阻断JNK的作用相一致(图)4 (b))也能保护t细胞免受凋亡损伤(图4 (c))．越来越多的证据表明，信号转导途径与细胞代谢状态之间存在交叉，其中代谢应激触发乙酰化的变化，从而导致线粒体功能的变化[29- - - - - -31，促使我们评估细胞乙酰化机制可能对t效应细胞凋亡的调控。

3．5.t效应细胞凋亡的乙酰化依赖性

越来越多的证据表明，在常规染色质靶点之外的乙酰化修饰的蛋白质表明，受这种修饰调控的细胞过程的范围和范围更广[32- - - - - -34］．作为初步估计，乙酰化可能在H1.2介导的t效应细胞凋亡级联反应的激活中发挥作用。腺苷酸(AA)是一种广谱赖氨酸乙酰转移酶抑制剂，可以保护t细胞免受凋亡损伤，这在核形态学检测中可见(图)5(一个))．为了评估AA是否延迟而不是抑制细胞死亡，在这些条件下也测量了碘化丙啶(PI)的摄取。在无细胞因子培养18小时后，PI和Annexin-V的一致染色表明膜损伤的发生，这与细胞因子培养的细胞相反(图)5 (b))．在用AA培养的细胞中，PI和annexin-V染色相当（和低），表明AA阻止膜完整性的损失（图5 (b))．此外，与没有细胞因子培养的细胞相比，AA处理的细胞中H1.2(和AIF)的易位被抑制(图)5 (c))，支持乙酰化状态的变化作为t效应细胞凋亡反应的调控步骤可能发挥的作用。这种修饰的分子靶标尚待确定。H1.2置换可能是对乙酰化依赖的染色质组织变化的反应，对组蛋白的影响或对非组蛋白的调节，区分这两种可能性的实验将为这一调节提供更多的见解。

4.讨论

细胞外环境中限制营养物质的竞争是细胞数量调节的普遍机制，细胞感知微环境中这些变化的机制仍在积极研究中。减少细胞外源性生长因子的可用性，经常是在发育或分化过程中过度产生的细胞的协调删除的基础。我们在一个模型系统中解决了这个问题，该系统再现了细胞培养中分化的t细胞的缺失(由细胞因子的退出引起)。我们提供的证据表明，细胞核作为整合细胞外营养线索的一个位点，对t细胞的存活具有重要的影响。这在LMB抑制t效应细胞凋亡损伤的实验中得到了证实，这表明在信号级联过程中存在一个核中间体。在实验中证实了核事件的参与，在细胞因子退出后，我们观察到H1.2从细胞核转移到线粒体，引发级联反应，最终导致细胞死亡。H1.2核转位在未成熟胸腺细胞和慢性淋巴细胞白血病细胞中对基因毒性和非基因毒性药物治疗的反应已有报道[25，26，35］．为了支持这一观点，我们提供了H1.2与线粒体外膜居住者、促凋亡蛋白Bak相互作用的证据，以及它在t效应细胞凋亡过程中对线粒体和细胞核后续损伤的调控。这些数据开启了H1.2相关分子调控凋亡结果的可能性(并非相互排斥)，或者对H1.2本身的修饰可能是其在线粒体中的活动所必需的。

涉及Bcl-2家族蛋白(Bax和Bak等)和活性氧物种的相互作用层级涉及t细胞凋亡缺失[3.，13- - - - - -15，17，18］．目前对凋亡信号的理解将具有明确功能的分子定位于线粒体，作为t细胞凋亡的关键中间体。由于在培养过程中，H1.2的消融保护了细胞的凋亡，数据提示了一个有趣的可能性，即H1.2介导的放大或加强环路，它聚集在线粒体上，传播凋亡级联。我们推测，如果由H1.2和ROS激活产生的信号汇聚在单个事件/细胞器上，可能会出现共同的调控过程。实验室的早期工作表明，在t效应细胞凋亡反应中，jun - n-末端激酶(JNK)被nadph介导的ROS产生激活，并调节线粒体损伤[17］．JNK活性控制了H1.2的亚细胞分布，也就是说，在生长因子被剥夺后，它从细胞核中释放出来，这支持了相互作用的层级的可能性。H1.2与Bak关联的潜在分子特征和后果尚待阐明。基于本研究的观察，我们推测染色质可能对JNK活性执行非转录反应，从而启动H1.2的非核功能。这一结果可能与JNK活性对表观遗传状态的调节有关，JNK活性在其他系统中具有优先权[36- - - - - -38］．

AA的保护作用与乙酰化在调控H1.2定位和随后凋亡中的作用是一致的。然而，根据这些观察，赖氨酸乙酰转移酶在凋亡的h2依赖级联反应中可能形成一个指导元素，还需要更详细的分析。我们试图追踪注射了AA的小鼠在抗原激发后t细胞收缩，但没有成功，因为AA抑制了t细胞活化反应在活的有机体内(没有显示)。T细胞群体中H1.2水平的基因操作正在进行中，直接设想H1.2途径在促进T效应细胞生存中的作用在活的有机体内．

综上所述，这些实验表明，t效应体中营养吸收和生存所必需的细胞因子输入是整合在细胞核中的。这些观察将H1.2定位在基因组完整性和线粒体功能的分子耦合中，这里展示的是t效应子的程序性缺失。这是诱人的推测，由于细胞对代谢应激源的反应是保守的跨细胞类型，在这里描述的途径很可能在其他细胞环境中激活，包括分化细胞的稳态。

5.结论

在细胞外环境中，限制营养物质的竞争是调节细胞数量的普遍机制。构成细胞对这些变化的反应的细胞内信号网络仍然是一个活跃的研究领域。在这项研究中，我们提供的证据表明，在t效应群体中，细胞核中的事件整合了细胞外营养线索，这些事件与营养剥夺引发的凋亡反应密切相关。具体来说，在细胞因子撤离时，连接蛋白组蛋白H1.2从细胞核转移到线粒体，并与线粒体驻留蛋白Bak结合，触发t效应细胞凋亡。最后，H1.2的动态是由JNK信号调节的，并对t细胞乙酰化状态的变化作出响应。

利益冲突

作者没有利益冲突声明。

致谢

作者感谢中央成像和流式细胞术设施(CIFF)和NCBS的小动物设施。我们感谢Nithyakala博士对论文的帮助。Megha Garg和Lakshmi R. Perumalsamy分别得到了印度政府生物技术部和科学和工业研究理事会的研究金的支持。

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