量子点不改变胰腺癌干细胞的分化潜能和随机分布的子细胞

文摘

增加相关的细胞疗法,对分子标记细胞技术的需求在体外和在活的有机体内研究。的合理的追踪移植干细胞在动物模型中,使用量子点(量子点)敏感细胞成像有很大的进步。量子点可以送到细胞的细胞质提供强烈和稳定的荧光。量子点虽然是bioimaging成为有利的纳米颗粒,大量的调查仍需要考虑为成体干细胞应用。因此,大鼠胰腺干细胞已经被标以不同浓度的CdSe量子点(Qtracker 605纳米晶体)。QD标记已经被显示正常增殖和通常的自发分化潜能在体外。标记细胞的人口依赖浓度,增加细胞负载从5量子点纳米量子点到20海里。延时的显微镜,我们观察到的传播QD粒子在细胞分裂是随机的,出现作为平等或不平等的传播子细胞。量子点在这里我们报告提供了一个高效、无毒的标签胰腺干细胞没有基因改造的方法。总之,QD纳米晶体是一种很有前途的工具,干细胞标记和促进移植细胞在动物模型的跟踪。

1。介绍

成体干细胞来源于胰腺的自我更新和multilineage分化潜力1- - - - - -4]。最近,我们和其他组织已经报道了类似成年干细胞的隔离和传播的数量由唾液腺和汗腺5- - - - - -8]。使用简单的隔离程序、外分泌腺体细胞群作为有前途的来源显示所有多功能干细胞的基本特征在体外。这些腺体干细胞已经被他们的再生潜力在临床前研究分析(9,10]。细胞疗法的好处已经作为模范地显示胰腺干细胞数量在啮齿动物模型。两种小鼠胰腺干细胞(9)和大鼠胰腺干细胞(10加速伤口愈合的全层皮肤缺损和增强血管化当播种到真皮再生胶原蛋白支架。

然而,之前人口干细胞在再生医学中的应用,主要挑战仍有待克服。探索细胞生存、增殖和分化的细胞在动物模型中需要标签跟踪移植细胞在活的有机体内。当前标签成体干细胞方法包括铁粒子(11- - - - - -13),有机荧光染料(14),或荧光蛋白表达的细胞(15]。

近年来纳米技术的发展提供了承诺和高效的再生医学生物医学应用程序和工具。特别是,荧光纳米粒子像量子点(量子点)可以用作操纵和跟踪干细胞。量子点具有窄带发射和宽带激励。他们由于其耐光性优势显著,长期持久的荧光强度,提高细胞标记和意味着先进的性能相比,有机染料和荧光蛋白(16,17]。量子点具有激发和发射光谱不同于身体的自体荧光允许不同的移植细胞和可靠的跟踪(18]。量子点是无机纳米结晶,通常2 - 10纳米尺寸范围。它们由半导体的核心(如CdSe, CdTe)包裹在壳组成的第二半导体材料(如硫化锌)[19]。生成一个量子点生物吸收到细胞表面必须涂有一个变量,可以使外层的生物相容性。在大多数情况下,量子点的内化是通过使用某些肽如霍乱毒素(20.],TAT-peptide [21,22],RGD [23,24)或磷脂(25]。量子点已经用于标签不同种类的细胞在体外包括肿瘤细胞(26),内皮细胞(27),成纤维细胞(28),角化细胞(29日),间充质干细胞(30.,31日和胚胎干细胞32]。有利的性能也提出了很多策略在活的有机体内包括斑马鱼胚胎的标签(33]或[非洲爪蟾蜍胚胎34]。而量子点一些报道认为是无毒的26,34,35)一些组织可能揭示量子点的细胞毒性或异常影响取决于它们的大小,涂层和理化性质29日,36,37]。例如,它已被证明,人类骨髓间充质干细胞成骨分化的影响在体外CdSe /硫化锌量子点的标签(36]。

为了解决以上问题,我们标记大鼠胰腺干细胞与不同浓度的Qdot 605纳米晶体。这些量子点硒镉核心和硫化锌外壳。他们有一个直径5 - 15纳米涂层后他们针对polyarginine肽他们是内源性的细胞(38,39]。我们通过流式细胞仪量化细胞QD总负荷,确定可行性和增殖和分化潜能分析实时PCR和免疫细胞化学。此外,量子点的分布在子细胞由延时显微决定。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

大鼠胰腺干细胞培养后隔离被克鲁斯et al ., 20062]使用DMEM (Gibco英杰公司、德国)和10% (v / v)胎牛血清(FCS) (PAA、奥地利)和青霉素和链霉素(PAA、奥地利)37°C和5%的公司₂。当confluency的细胞培养塑料(瑞士TPP)了,洗后执行subcultivation与PBS (Gibco表达载体,德国)通过孵化0,05%胰蛋白酶(PAA、奥地利)2分钟37°C。媒体的反应是停止双数量紧随其后在180 g离心5分钟。resuspending后颗粒与媒体进行补种的细胞的比率1:3。长期保存细胞在低温冷冻媒体包含90% FCS和10% DMSO(卡尔·罗斯,德国)一个isopropanol-coated框至少24小时后转移到液氮。解冻的细胞是由快速resuspendation媒体和离心5分钟与180克。随后,他们受移植者如上所述相同的增长领域他们之前和培养培养至少一个通道。连续供应营养物质和代谢产物,媒体是完全改变了每隔两天。

2.2。标签程序

标签的QD纳米晶体,即Qtracker 605细胞标记工具(表达载体分子探针、德国),根据制造商的协议执行。简而言之,我们在相同比例混合组件A和B,孵化5分钟在室温和添加足够的培养媒体为每个浓度。这种悬架然后提供给细胞和孵化为1小时37°C和5%的公司₂。我们测试了三种不同concentrations-the推荐10 nM暂停,以及5 nM和20 nM。最后,这些细胞被洗两次与媒体传播,直到与上述描述媒体分析。

2.3。细胞计数和生长曲线

细胞计数进行使用NucleoCounter (Chemometec、丹麦)和相关的试剂。简单地说,在subcultivation整除的50μL的细胞悬液与相同数量的混合裂解和稳定缓冲区(来自Chemometec、丹麦)。暂停然后吸收NucleoCounter的盒式根据用户手册和仪器测量propidium-iodide贴上原子核在样本的数量。

的初步分析量子点对细胞生长的影响,我们测量标记和未标记细胞的细胞计数在一段天1,3,5,7。标签程序在烧瓶中进行量子点与融合性的干细胞和20海里。三个小时后,细胞使胰蛋白酶化和播种密度90在6孔板000个细胞。意味着细胞计数每天计算从三胞胎。

在一个实验中,我们还分析了QD影响长期扩散。的增长曲线,标记和QD标记的数量,是开始的调整细胞计数为每个人口一百万个细胞。在一段16天,细胞被subcultivated比1:3 4次。细胞的数量描述的数量在每个subcultivation决心之前和数学外推的表示扩散作为图。

2.4。流式细胞术

荧光激活细胞分类分析QD标签(5 nM, 10 nM,和20 nM)和未标记细胞作为控制被播种在25厘米²培养瓶。当时的分析(24小时、48小时和96 h后标签),细胞使胰蛋白酶化、计算和颗粒状根据前面描述的培养协议。随后,他们在冰冷的resuspended FACS-buffer含有2% FCS (v / v)在PBS稀释。细胞聚集的测量是通过使用50μm过滤器(Partec,德国)。样本存储在冰和混合之前的分析。的直接测量荧光强度进行MoFlo高性能电池分选机(贝克曼库尔特)。70年MoFlo操作了μ喷嘴在60 Psi。量子点使用一个连贯的兴奋英诺华90 C氩激光调谐MLUV 50 mW。数据分析使用峰会4.3软件。

2.5。时间流逝

观察细胞的行为后细胞内的标签和量子点的转移人口,量子点描述的细胞治疗浓度(5 nM, 10 nM,和20 nM)和培育与孵化室显微镜(德国蔡司缩微成像)在37°C和5%的公司₂在一段时间内的100个小时。未经处理的细胞群是用作控制。一开始每厘米大约5.000细胞²被播种到6-well细胞培养板(瑞士TPP)。标记样本进行24 h后,随后使用延时显微镜监控。照片拍摄于定义的位置在每个示例使用以下设置:每15分钟10倍放大,激发波长:555海里,数值孔径:0.45 / Ph1,他和反射器块:43。最后,图片的时间序列进行了分析。QD转移细胞分裂期间的观察方法(不平等、平等)量化分析时间流逝的四个实验照片。总的来说,我们大约242细胞分裂和练他们QD的平等和不平等的方式传播。

2.6。免疫细胞化学

采用免疫染色,每厘米7.500细胞²QD (20 nM)标记和标记,被播种到2-well文化幻灯片(BD、德国)和培养了2天。前固定为4% (w / v)多聚甲醛(默克公司、德国)和10% (w / v)蔗糖(罗斯,德国)的细胞被洗一次PBS (Gibco表达载体,德国),然后孵化15分钟固定的解决方案。与PBS三次洗涤后,非特定的结合位点被治疗饱和1.7% (v / v)正常山羊血清(PBS向量实验室、美国)在室温下至少20分钟。之后,主要的抗体被稀释TBST缓冲区中含0.1% BSA (PAA、奥地利)和孵化的细胞在一个潮湿的室1 h在37°C。主要的抗血清是针对淀粉酶(鼠标单克隆,1:50,圣克鲁斯,美国);GATA-4(圣克鲁斯兔多克隆,1:100年,美国);Ki67 (Abcam兔多克隆,1:500年,英国);nanog(微孔兔多克隆,1:1000年,美国);巢蛋白(Chemicon鼠标单克隆,1:100年,瑞士),神经纤维细丝,介质重,和重型链(1:1:1的混合物,兔多克隆,1:500年,Serotec,英国);nucleostemin(圣克鲁斯兔多克隆,1:100年,美国); vimentin (mouse monoclonal, 1 : 500, DAKO, Germany), andα光滑的肌肉肌动蛋白(αsma、鼠标单克隆,1:100年,丹麦DAKO)。与PBS冲洗三次后,幻灯片被暴露于FITC-labeled二级抗体,anti-mouse IgG和anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 200年,杰克逊ImmunoResearch欧洲、英国)相同的条件下,在PBS稀释。二次抗体孵育后,PBS的细胞被洗了三次,一次蒸馏水和安装DAPI-containing Vectashield安装介质(向量实验室、美国)。细胞的分化潜能分析使用荧光显微镜Axioskop 2和共焦激光扫描显微镜LSM710(从卡尔蔡司,德国)。消极的控制进行了仅使用二次抗体和只显示非特异性,微弱的染色(数据未显示)。

2.7。聚合酶链反应

总RNA QD标记和未标记细胞生长汇合的在75厘米²培养瓶被隔离使用RNeasy +迷你包(试剂盒、德国)根据制造商的指示。RNA浓度测定吸收使用nanodrop分光光度计测量在260海里(Peqlab,德国)。逆转录包括消化步骤的基因组DNA进行了使用QuantiTect逆转录工具包(试剂盒,德国)。对于每一个样本,1的互补脱氧核糖核酸合成μg总RNA。实时PCR与1执行μL cDNA 25μL反应体积使用QuantiFast SYBR绿色PCR工具包和老鼠QuantiTect引物(试剂盒,德国)在表1在RealPlex2-Mastercycler(埃普多夫,德国)。荧光阈值是确定使用Mastercycler ep realplex CalQplex算法软件(埃普多夫,德国)。相对转录活动是由ΔΔct方法决定β肌动蛋白基因表达作为一种内源性参考。

3所示。结果

3.1。标签的胰腺干细胞具有不同QD浓度

在第一次尝试,我们分析了优化量子点标记浓度来实现一个完整的和同质干细胞群中的纳米颗粒分布。因此,胰腺干细胞治疗10 nM的制造商的建议和半(5 nM)和双(20 nM)的浓度。图1显示的荧光显微图像细胞层标签后24小时。显然,细胞将量子点标记强度是浓度依赖性。QD分布在每个细胞不是同质而是聚集。只在10和20 nM量子点标签解决方案是足够的粒子标签每个细胞的细胞层。标签与5 nM QD浓度导致弱荧光标记在只有少数细胞。

3.2。本地化的纳米粒子在细胞内

量子点在细胞内的身体的安排而且详细分析了共焦显微镜。通过免疫染色细胞波形蛋白抗体QD标签后,我们可以看到细胞的细胞骨架和量子点的空间分布可以分析在创建与微观Z-Stacks软件。这个3 d图像(图2)证实了细胞内的胞内积累QD骨料细胞质波形蛋白丝之间的分散。QD聚合通常是局部周围大多数分析细胞的细胞核和这些总量不进入细胞核。

3.3。量子点的流式细胞仪分析细胞负荷和保留

在PSC的扩张在体外文化中,我们分析了细胞的QD负载和标签的保留24小时后,48 h, h和96年通过流式细胞仪分析。三种不同浓度QD的5 nM, 10 nM, 20 nM影响标签的过程的有效性和增殖细胞群内的QD保留。测量荧光每个细胞的分布变化影响一个钟形曲线的流式细胞仪配置文件(图3)。所有的分布曲线转向低荧光强度在时间,以便在荧光强度96 h后的人口是最低的。这种效应与浓度减少初始标签更加突出。定量评价的QD PSC人口中阳性细胞显示标签的消失(图4)。后24 h标记过程,最好的标签成功达到20 nM QD浓度(92年,59%±2 2%),超过90%的细胞被算作荧光标记。这个数量减少到82年,93%±7,4% 96 h后的文化。失去干细胞QD标签是明显的文化标记浓度较低。为5 nM浓度只有一个79,25%±4 5%的干细胞是最初标记,这个数字下降到43岁,78%±1%在体外传播了96 h。基于这些结果,我们决定使用20 nM QD浓度标准和进一步评估细胞参数对纳米颗粒浓度。

3.4。时间流逝QD分布在细胞分裂的分析

为了分析量子点的传递在扩大干细胞文化中,我们观察到时间流逝显微镜的标记的细胞群。在这里我们能够遵循纳米颗粒聚集的分布在细胞分裂。量子点显然是传递给子细胞,但在两种不同的方式。有例子同等转移到下一代(图的两个细胞5)以及条件,使纳米粒子只存在于一个女儿细胞后,细胞分裂(图6)。这个量子点分配不均是不罕见的事件,所以两种可能性通过在量子点的细胞群的扩张发生在平行。为了量化平等和不平等的QD传输的扩展,我们分析了四个时间流逝照片系列和分配242细胞分裂平等或不平等的传播途径。证明了图的统计估计7,没有QD传播的首选方法和双向的发生几乎相同的频率。

3.5。QD标记细胞的增殖特征

研究过程中量子点的影响在体外已经增长,我们执行增长曲线在培养7天的时期。在这短期培养,没有明显影响的扩散能力已经被(图8)。在一个实验中,我们还分析了QD标签长期增殖的影响。在subcultivation已经超过四个段落,我们测量标记和未标记干细胞的细胞计数。量子点的吸收甚至在20 nM的浓度对细胞没有不利影响人口在接下来的16天的培养阶段。QD的增长曲线标记和标记干细胞的数量几乎相同(图9)。

3.6。QD标签对胰腺癌干细胞的分化能力

已知胰腺干细胞是多能干细胞分化的潜能在体外。他们自发地表达不同的mrna和蛋白的一个子集,指示内胚层的分化途径,中胚层和外胚层的细胞谱系。我们调查的影响QD标签上这些干细胞属性转录和转译级别执行定量逆转录PCR以及采用免疫染色。

标记细胞的基因表达谱与QD的标记细胞通过规范化数据对未标记细胞样本。各种记录的基因表达分析显示只有微小的变化,分析了干细胞相关和differentiation-associated基因(图10)。相对所有分析基因的mRNA表达左右波动。向上或向下的诱导转录调节,人会估计至少一个双重的变化(相对表达式2 >或< 0,5)。比较标记与未标记细胞的数量,我们不能观察表达这种规模的变化,表明没有QD标签的严重影响。有趣的是,即使是细胞凋亡标记caspase-3显示没有upregulation QD标记的干细胞数量。

这些数据经分析细胞蛋白质表达谱。我们采用免疫染色的QD标记干细胞数量和分析特定蛋白的表达与干细胞(Ki67 nanog,巢蛋白,nucleostemin)和分化细胞(内胚层:GATA4,淀粉酶;中胚层:αsma;外胚层:神经纤维细丝)。分析蛋白质,我们检测双重标记特定的蛋白质和荧光纳米颗粒(图11)。因此,multilineage分化期间PSC的潜力在体外文化似乎不受QD标签方面分析标记。

4所示。讨论

QD纳米晶体是一个简单和有效的方法标记细胞有强烈的荧光标签。特别是用干细胞移植研究将利润从这个工具,使跟踪单个细胞的实验动物。我们曾表明,移植大鼠胰腺干细胞提高再生全厚皮肤缺损的小鼠模型(10]。这种定性的好处到目前为止没有关于交付的命运和功能,详细分析了干细胞由于没有标签跟踪。在目前的研究中,我们探索QD纳米晶体的应用程序标记大鼠胰腺干细胞在体外。根据QD浓度,我们取得了进步在标签增加浓度的荧光强度和标签解决方案。制造商的推荐的最佳浓度量子点10 nM正确标签的细胞,甚至翻倍QD浓度由已经被耐受性良好。共焦显微镜证实纳米晶体聚集在细胞内细胞质的本地化。显然,QD纳米晶体不还是略微进入细胞核。Lovrićet al。40)展示了量子点毒性的影响取决于它们的大小和亚细胞定位内部或外部相关核与这些影响。有趣的是,红色发光量子点在细胞质和细胞毒性低于小绿色发光的,积累的核(40]。符合这些观测,我们监控的亚细胞分布QDot 605纳米晶体聚集在大鼠胰腺干细胞的细胞溶质和早些时候证实从而观察纳米晶体在老鼠和人类间充质干细胞(31日,37]。我们假设用于细胞跟踪红色量子点发光总之优于绿色发光的,因为它们是更好的区分组织自体荧光。

通过分析品牌文化时间的稳定性,我们观察到荧光强度递减,当细胞增殖。定量流式细胞仪分析显示,干细胞标记细胞的人口比例下降。这种效应并不突出的人口在细胞标记QD浓度高、保留的荧光标记细胞48 h后约为80%。这些观察以前也在其他实验小鼠胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞被贴上QD 655纳米晶体32]。也对老鼠和人类间充质干细胞的荧光标签的损失随着时间的推移和进步的细胞分裂被观察和讨论(31日,37]。为了确定这种效果的原因,我们不断监控QD标记由延时显微细胞群。遵循QD骨料的传递子细胞在细胞分裂过程中,我们发现两种方式QD传输:(I)平等QD骨料的传播子细胞和(2)在细胞分裂不平等QD的传播。第二个事件导致了两个子细胞,没有荧光标签和发生在50%的细胞分裂。这种现象似乎是进步的原因失去干细胞群内的荧光标签。也符合这些观察干细胞的不对称分裂以及非等值的分布nanoparticle-loaded核内体之间的子细胞可能是一个原因38,41]。在一项由πet al。32),一个快速丧失QD标签观察胚胎干细胞已建议是由于膜转运蛋白的量子点活跃的排泄。如果已经有能力积极量子点排泄目前未知,必须进行进一步的分析。对这些方面我们然而假设轻微损失的荧光标记的细胞自我更新条件下培养的细胞群在体外可能会出现一个较小的扩展当这些细胞被移植到组织在活的有机体内。

除了QD转移的机制或排泄,其细胞毒性和异常的可能性对基因表达的影响仍然是一个重大关切。在当前的工作中,量子点的cytocompatibility在短期和长期的扩散比较与量子点,没有干细胞。两个细胞群的增长曲线几乎是相等的,没有明显有害的影响可以发现标记的细胞群。量子点整体似乎能很好地耐受,不干扰细胞分裂增殖细胞,也可以体现为红色量子点发射其它工作组(24,32,35,37]。由于干细胞数量的特殊属性,它是主要的重要的保证不受影响的基因和蛋白质表达和描述他们的多功能分化潜力对QD诱导变化。胰腺干细胞表现出multilineage分化潜力,形成内胚层的细胞,外胚层和中胚层起源自发在体外(2,42,43]。通过分析某些一致表达了成绩单,我们分析了QD标记和nonlabeled细胞的基因表达谱。周围的归一化相对表达水平振动分析基因的一个,没有一个上涨或下调超过两倍。这种大小的改变小腺干细胞可以向上或向下调节基因表达,例如,由于定向分化的方法十倍以上44]。因此,对于分析记录,我们观察到量子点没有明显的负面影响干细胞的基因表达,甚至apoptosis-related caspase3成绩单没有监管。为了验证这些结果也在蛋白质水平,我们采用免疫染色特点特定蛋白的表达。获得的结果,我们强调cytofriendly量子点的特性作为胰腺癌干细胞完成适当的自发分化向特定细胞类型时也包含量子点。分析标记的范围内,没有一个三分化途径(neurofilament-positive)外胚层的细胞,内皮细胞(amylase-positive GATA4-positive)或中胚层细胞(α-SMA-positive)受损后QD标签和所有扩散,抑制细胞相关的表达标记蛋白质(Ki67, nanog、巢蛋白和nucleostemin)是不变的。量子点的影响对干细胞分化已经评估不同的干细胞类型有不同的结果。最近,Rak-Raszewska et al。35)表明,小鼠胚胎干细胞以及肾脏干细胞并不影响他们的行为red-emitting QD标签而谢长廷et al。36显示一个量子点green-emitting对人类骨髓干细胞的成骨分化能力。这不同的结果证实了cyto-friendly特性较大的有害影响的红色量子点发射和细胞与小green-emitting的标签。这里应用QDot 605纳米晶体分析胰腺干细胞导致改变为研究转录和蛋白质表达谱表明期间自发分化的影响在体外传播。如果会有一个量子点的影响这些细胞群进行时,一个诱导分化对特定细胞类型未确定,将受到进一步的调查。

量子点与几个方法估计的影响在体外增殖和分化,一般来说我们不能透露任何实质性的影响已经被标记。可能使用量子点的细胞友好标签但是应该进一步估计在动物实验中,因为有额外的参数需要考虑(例如,新陈代谢,毒理学,排泄)。

5。结论

本研究探讨量子点标记胰腺癌干细胞的可行性,促进细胞追踪移植细胞在动物实验中。我们已经表明,量子点可以有效地标记已经没有对细胞生存能力或扩散的影响。关于分析的基因和蛋白质,而且能保证没有明显有害的影响细胞自发分化潜能在体外。当自我更新条件下培养在体外,有一个温和的荧光QD标签由于多次细胞分裂。QD粒子在细胞分裂的传播可以平等或不平等导致QD损耗在某些子细胞。然而,随着移植细胞在活的有机体内应该停止增殖,开始分化,我们假设division-caused QD标签损失将不重要的关于细胞跟踪目的在活的有机体内。总之,这里使用red-emitting量子点成为容易处理,细胞友好标签鼠胰腺干细胞。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

美国丹纳和h挥发油同样对本文亦有贡献。

确认

这项工作是由欧盟、欧洲区域发展基金(ERDF)。作者要感谢丹尼尔·h·拉波波特和蒂姆·贝克尔博士支持我们的延时分析和数据处理。

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