量化细胞Thiol-Disulfide状态的变化在B细胞分化成Antibody-Secreting浆细胞

文摘

浆细胞产生和分泌大量的disulfide-containing抗体。适应这种分泌机器上的负载,休息B细胞分化成antibody-secreting浆细胞伴随着细胞的分泌隔间的优惠扩张和老年病的酶参与氧化还原调控和蛋白质折叠。我们有量化蛋白质硫醇的绝对水平,在整个细胞蛋白质二硫和glutathionylated蛋白质。结果表明,尽管全球thiol-disulfide状态是影响在某种程度上的分化,稳态水平的glutathionylated蛋白质硫醇还不到总数的0.3%半胱氨酸的蛋白质,甚至在完全分化的细胞,和整体蛋白质氧化还原状态不影响直到分化,当大规模IgM生产正在进行。一般ER不影响全球扩张蛋白氧化还原状态,直到一个广泛的蛋白质已经开始生产的货物。

1。介绍

细胞thiol-disulfide硫醇氧化还原环境是由蛋白质(PSH)和二硫化以及低分子量硫醇和二硫化物。在哺乳动物细胞中,迄今为止最丰富的低分子量的含巯基的分子是谷胱甘肽(GSH)。一起二硫(GSSG),这对通常被称为细胞thiol-disulfide氧化还原缓冲区。

真核细胞的胞质中,谷胱甘肽与谷胱甘肽比GSSG高度减少至少3000 (1,2),因此大多数蛋白质的半胱氨酸和PSH发现。PSH的高浓度,谷胱甘肽在这个车厢里是重要的细胞防御硫醇氧化剂(3),在thiol-disulfide压力,形成蛋白质和之间的混合二硫化谷胱甘肽(PSSG)作为一种机制来保护PSH和不可逆氧化谷胱甘肽。与胞质蛋白,分泌蛋白质通常含有二硫键,谷胱甘肽氧化还原池分泌细胞的隔间中发现更多比胞质氧化池(4]。二硫键的形成是一个重要的一步许多分泌蛋白质的正确折叠(5),在真核细胞的折叠和组装发生内质网(ER)。在这个舱,分子伴侣’和酶对二硫键的形成和糖基化蛋白质折叠的支持。适当的ER氧化还原环境的维护对分泌蛋白质的折叠是至关重要的。如果氧化还原环境变得太减少,二硫键的形成是阻碍5]。如果太氧化,折叠中间体与非本地的二硫键可以积累6]。一系列的氧化还原酶,这可能有不同的功能和/或衬底或组织特异性的援助折叠分泌蛋白质,发现ER的哺乳动物细胞(7]。最好的氧化还原酶的特征是蛋白二硫化物异构酶(PDI)介绍,减少,整理二硫键在多种基质蛋白(8]。氧化途径仍然悬而未决,但PDI可能被许多酶包括reoxidized PDI氧化酵素,GPx7和GPx894],酶类,黄素蛋白Ero1(内质网oxidoreductin 1),审查[10,11]。

专业分泌细胞是专业生产分泌蛋白,具有丰富的ER。一个例子是B终末分化细胞,也称为浆细胞,分泌大量的抗体,免疫球蛋白(Ig)。虽然B细胞分泌抗体不休息,他们在细胞表面表达一个膜结合Ig的亚基B细胞受体,在绑定的抗原激活信号级联,可以导致antibody-secreting浆细胞分化。分化是伴随着许多形态变化,以适应生产大量的分泌抗体。这包括一般细胞体积增加的优惠扩张ER (12]。此外,分化伴随着戏剧性的变化在细胞的蛋白质组13,14];正如所料,ER蛋白表达明显上调。

IgM抗体是第一个生产的适应性免疫反应。IgM分泌通常是作为disulfide-linked五聚物或五个一组件组成的两个相同的重链()和两个轻链()。的pentameric holoprotein除了包含J-chain,六聚物不。每个组件都包含16个二硫键和J-chain贡献4个二硫键,近100需要为每个IgM分泌形成二硫键(15]。这种氧化折叠可能产生活性氧(ROS)。ROS生产是在B细胞分化和抵消增加了一个强大的抗氧化剂反应(16]。

我们着手调查这巨大的负载分泌机制如何影响全球thiol-disulfide环境的B细胞。我们应用之前开发的定量测定方法的绝对水平PSH、PS_牛,PSSG在所有细胞蛋白(包括膜蛋白)在培养的哺乳动物细胞中,并结合这些数据量化的谷胱甘肽和GSSG相同的细胞。通过这种方式,我们获得一幅全球thiol-disulfide细胞氧化还原状态的变化在休息B细胞分化成一个antibody-secreting浆细胞。

2。结果

2.1。全球量化Thiol-Disulfide环境的策略

细胞氧化还原状态的定量研究涉及各种技术挑战由于SH组的反应性质。必须非常小心,以避免人工空气氧化和消除大硫醇和二硫化物之间特定的试剂,否则会导致虚假的结论(17]。通过应用之前开发的技术,仔细考虑这些技术缺陷(3),我们可以定量确定细胞水平总巯基等价物的低分子质量硫醇和蛋白质。实验方法的关键特性见图1。为了避免扰动的细胞thiol-disulfide地位在细胞溶菌作用和样品制备,细胞酸化的柠檬酸的终浓度10%,导致蛋白质变性和降水。这种组合的快速捕获和去质子化同时展开氧化还原酶,其中一些低硫醇pK_一个和相当耐酸作用,淬灭通用硫醇的质子化作用。充分利用我们的方法的力量,我们没有FACS-sort细胞分析之前,我们也没有同质化和分离细胞。

用柠檬酸丸是可溶性的适当的缓冲与高浓度的SDS或尿素量化不同的含巯基的物种在所有细胞蛋白包括膜蛋白质。PSH和PS_牛水平与高度敏感的高效液相色谱法测定分析基于硫醇量化代理4-DPS [18]。半胱氨酸的蛋白质的总价值(PS)总被PSH和PS计算_牛和验证方法,这个值也决定实验。对实验进行休息B细胞之间有一个很好的协议实验确定值的计算和实验确定PSH和PS_牛(数据没有显示)。最后,PSSG水平有选择地使用量化的硫醇SBD-F衍生代理。SBD-GS导数是高荧光,可以具体量化由于其独特的保留时间在一个高效液相色谱色谱(3]。除了蛋白质巯基,确定每个样本的总蛋白质含量和用作公分母比较个人样本。这是一个关键的一步,因为它消除了任何可能的偏差从柠檬酸颗粒不均匀分为分数。此外,要求一个公分母在这项研究中尤其重要,因为它也消除了任何偏见由于形态细胞样本之间的差异。总蛋白质含量是基于完整的量化使用方法在盐酸水解后的量化释放氨基酸与茚三酮(3]。这就构成了一个高度可再生的和敏感的方法,用一个合适的标准,它得到的数字,可以校准”氨基酸的蛋白质。“此外,茚三酮测定独立于蛋白溶解度,因此包括可溶性和膜蛋白。因此,下面的所有数据将显示为巯基/氨基酸(SH / aa)。

2.2。量化的Thiol-Disulfide环境休息的B细胞

作为B细胞分化的一个模型,我们使用先前建立系统基于小鼠B细胞淋巴瘤1.29μ⁺可引起脂多糖(LPS)分泌IgM (13,19]。获得一个良好定义的参考点的B细胞分化成浆细胞,我们量化thiol-disulfide uninduced B细胞获得地位分化为浆细胞的参考点。细胞被播种密度细胞/毫升,每天为氧化还原量化采集样本在接下来的四天。虽然在此期间细胞密度大大增加,蛋白质氧化还原状态保持不变在整个实验过程(数据2(一个)和2 (b))。此外,水平PSSG GSSG,谷胱甘肽保持不变(数据未显示),我们得出的结论是,全球thiol-disulfide地位独立的细胞密度。因此,数据的平均值得到的氧化还原物种在四天计算,和相对分布不同的蛋白质和谷胱甘肽巯基等价物在表1。从这些数据,我们得出的结论是,绝大多数的细胞含巯基的等价物中存在降低硫醇形式只有5%和9%的PS和GS等价物从事二硫键的形成,分别。极的一小部分细胞含巯基的等价物和PSSG发现。在一起,这些数据描述的总thiol-disulfide环境休息B细胞,我们使用他们作为研究的参考点antibody-secreting浆细胞分化。在剩下的这部分的研究中,这些数据将被称为天0的分化。有趣的是,硫醇和二硫化物等价物的分布休息B细胞非常相似的HEK人类胚胎肾细胞,发现6%的PS等价物PS_牛和8.5%的GS GSSG等价物被发现。另外,我们观察到细胞PSSG水平极低的支持导致HEK和海拉细胞3]。应该提到,尽管细胞生长在的存在β巯基乙醇,在柠檬酸上层清液,也发现少量的柠檬酸小球,它没有干扰谷胱甘肽或PSSG测量,因为荧光β巯基乙醇衍生品分离有效GS衍生品的高效液相色谱(数据没有显示)。

2.3。细胞Thiol-Disulfide状态改变诱导分化

1.29休息μ⁺细胞治疗与LPS诱导分化成antibody-secreting浆细胞。样本准备全球硫醇量化后,1,2,3,4天的有限合伙人的待遇。总PS等价物(SH / aa的人物3(一个)),我们发现半胱氨酸残基在蛋白质是相当恒定的频率(~ 2%)在分化。这是在良好的协议与实验测定值其他哺乳动物细胞系以及真核生物计算值一般汉森(3,20.]。总PS的SH / aa将很大程度上影响在分化为IgM单体的半胱氨酸频率为2.5% (IgM有1540个氨基酸,其中38半胱氨酸(21])。虽然总PS等价物保持不变的绝对值在整个实验过程中,蛋白质的分布硫醇和二硫化物LPS-induced细胞分化的影响。蛋白质的比例硫醇从事二硫键的形成仍很大程度上影响了LPS诱导两天后,但在第三天PS_牛值翻了一倍,共增加3.3倍被发现在第四天(图3 (b))。同样,后两天的滞后时间,第三天PSSG已经增加了2.2倍,但与PS_牛,PSSG值没有进一步增加四天(图3 (c))。有趣的是,PSSG比PS_牛在整个实验过程(图基本上保持不变3 (d))。量化的绝对浓度的可溶性谷胱甘肽等价物透露GSSG仍很大程度上不受影响(图4(一)的分数),但氧化GS等价物(GSSG GS)相对于总GS等价物(GS)从8.8%上升到14.5%(图4 (b))。这是由一个渐进的减少谷胱甘肽(图4(一))导致整体下降56% (GS)每天4比0。PSSG GS等价物没有恢复,整个研究保持一分钟总GS等价物(图的分数4 (c))。排除,减少细胞内GS是由死细胞,增加凋亡和坏死细胞用流式细胞仪测量并与cell-impermeable染料染色propidium碘(π)。尽管可行的分数(PI-negative)细胞分化过程中降低了1.5倍(补充材料图1网上http://dx.doi.org/10.1155/2013/898563),它不能占据我们观察到减少细胞内谷胱甘肽(见补充材料文本)。作为减少细胞内GS不是解释为增加细胞死亡,我们测量GS等价物是否由细胞分泌的。没有可检测谷胱甘肽在空白中样本(数据未显示);媒体uninduced细胞,然而,包含了可测量的大量的谷胱甘肽,和值显著增加感应(图后3至4天4 (d))。应该注意的是,这些数字只是粗略估计,由于细胞外GS值很可能低估了降解催化谷酰基转移酶。从数据中显示数据4(一)和4 (d),增加细胞外GS / aa等价物相对于第0天第四天计算()而减少细胞内GS / aa计算()。的两个数字是相同的尺寸范围,有可能是区分细胞分泌谷胱甘肽(细节给出了辅料的文本)。

3所示。讨论

休息的变换B细胞成antibody-secreting浆细胞ER(包括一个广泛的扩张12]呃居民蛋白质和蛋白质参与氧化还原平衡时向上调节线性微分(13]。细胞如何应对突然增加分泌活动一直是许多研究的主题(22,23]。这项研究中,首次提供了一个定量的概述细胞thiol-disulfide地位在休息B细胞分化成antibody-secreting浆细胞。我们之前开发的方法应用于量化可溶性谷胱甘肽和GSSG以及细胞内蛋白质硫醇和二硫化物(3]。重要的是,包括可溶性和膜蛋白的方法,这就排除了偏见由于形态变化在B细胞分化。我们发现分化过程影响全球蛋白质thiol-disulfide状态增加3.3倍的分数硫醇氧化蛋白质在第四天的区别,而天0。对谷胱甘肽氧化还原状态的影响不太显著增加1.6倍的比例氧化GS等价物。谷胱甘肽氧化还原状态的变化是由于一般的GS等价物从区分B细胞耗竭。

B细胞的分化为浆细胞详细研究了在蛋白质组水平(13,14]。全IgM生产直到两天后才开始激活。在那之前,细胞代谢能力和准备,确保分泌机械能够应付抗体分子的大规模生产。我们没有发现任何改变蛋白质thiol-disulfide激活状态,直到第三天,当PS的分数_牛增加了2.2倍。蛋白质氧化还原状态的变化的动力学与动力学IgM生产相同。我们的研究结果表明,一般的扩张ER不影响蛋白质的氧化还原状态,直到一个广泛的蛋白质是启动生产的货物。IgM生产的增长在第三天可能是抢占这一过程称为“主动”展开的蛋白质反应(主动UPR) [24]。的UPR是一个压力信号的过程开始时的多肽积聚在ER (25]。这个过程导致了老年病的ER陪伴和折叠酶防止ER应激。而展开的蛋白质压力(或ER应激)没有参与的初始扩张ER在专业分泌细胞(13,14为B细胞分化[],它是至关重要的26,27]。诸如Ero1 UPR-induced氧化酶类β可能会促进蛋白质氧化还原状态的改变在第三天的分化启动disulfide-dependent IgM聚合及其随后的分泌。ER的谷胱甘肽的作用一直是一个激烈争论的话题。最初GSSG被认为提供等价的氧化二硫键的形成,但在识别Ero1蛋白质这一假说的丢弃。相反,现在被认为是参与谷胱甘肽的异构化非本地的二硫键(28- - - - - -30.]消费过度氧化等价物Ero1产生的蛋白质(31日)和激活Ero1通过减少其监管二硫(32]。因此,大量的ER GSSG是完全认为是至少部分由Ero1活动引起的。ER的机制维持其谷胱甘肽(GSSG氧化还原平衡是未知的。过剩GSSG可以减少一个ER居民谷胱甘肽还原酶,它可以运输到胞质细胞(分泌减少或28]。在B细胞分化Ero1α上调因素3和4的3.0和2.4天,分别是(14),因此我们预期GSSG水平增加。令人惊讶的是,在分化GSSG水平保持不变,但是整个细胞谷胱甘肽氧化还原状态逐渐变得更加氧化(图4(一))。这是损耗的结果总GS的等价物的谷胱甘肽(图4 (b))。总共有三种可能的解释为减少细胞内GS, (1) B细胞的分化导致分泌的GS等价物,(2)谷胱甘肽是不可逆氧化sulfinic或磺酸酸,这不是被量化的方法,和(3)GS等价物是π阳性细胞的公布的分数。我们发现增加细胞外GS在天3和4的分化差不多大小的细胞内减少(图4 (d))。这个结果支持模型(1),表明谷胱甘肽转换为GSSG Ero1老年病的蛋白质和导出到媒体。这个出口可以作为一种机制来减轻细胞从任何氧化负载由老年病Ero1蛋白质引起的。然而,我们可以不做任何特定结论关于细胞内GS损耗的原因,作为细胞外的水平GS原则上可以解释为分数PI-positive细胞释放出胞内GS媒体内容文本(见补充材料)。

由于极度减少细胞溶质的谷胱甘肽氧化还原电位,绝大多数PSSG有望被发现在细胞的氧化隔间3]。在肝微粒体的一项研究中,50%的GS等价物PSSG(被发现33),这表明ER的谷胱甘肽的主要部分与蛋白质有关。然而,这一部分后来估计显著降低(即。,less than 2% PSSG) based on whole-cell quantification with the assumption that no PSSG is found in the cytosol [3]。在同样的假设;即所有PSSG等价物中发现ER和GS等价物的浓度是相同的在所有细胞车厢,我们可以估计的最大分数PSSG是相对于总GS等价物,在完全分化的B细胞。据报道,ER体积占至少10%的细胞总量在antibody-secreting B细胞(12),因此,最大限度7%(0.7% / 10%)的GS等价物ER PSSG被发现。因此,即使在高度活跃分泌细胞,PSSG只构成一个小的一部分总GS ER的等价物。这些结果支持了这样的观点,即ER谷胱甘肽氧化还原环境比之前减少(34]。一般认为GSSG水平对大量PSSG形成至关重要(35]。有趣的是,我们发现PSSG比PS_牛是独立的区别(图3 (d)),这表明细胞的氧化隔间PSSG维持一个恒定的水平,因此,ER谷胱甘肽氧化还原状态是在分化严格监管。这可能解释了氧化应激激活的B细胞分化的早期阶段,紧随其后的是一个强大的抗氧化剂反应(16,36]。维护适当的ER谷胱甘肽氧化还原环境可以是一个关键因素在确保IgM的正确折叠。在这项研究中,我们首次thiol-disulfide状态的变化特征在B细胞的分化。一般来说,分化的细胞不会引起大规模thiol-disulfide压力。稳态PSSG水平维持在非常低的水平,即使在完全分化的细胞,和整体蛋白质氧化还原状态不受影响直到分化,当大规模IgM生产已经开始和ER应激反应被激活。

4所示。材料和方法

4.1。细胞培养和B细胞的活化

1.29μ⁺细胞被维护在悬架中描述(13),2天后,细胞培养基被新鲜培养基所取代。分化,细胞培养的20倍μg / mL有限合伙人(σ)。三个独立的文化与LPS诱导和采集标本后1、2、3或4天的分化。作为一个控制样本收集3个独立的培养没有有限合伙人。每天LPS激活后,采集样本进行流仪分析。细胞被沾染了π(σ)和流式细胞仪数据得到FACScalibur (BD生物科学)和分析使用Cellquest软件(BD生物科学)。

4.2。量化细胞内氧化还原物种

细胞被离心收获之后洗步骤10毫升杜尔贝科的1 x PBS (PAA)实验室消除蛋白质从媒体的痕迹。细胞被resuspended 1毫升冰冷的10% (w / v)柠檬酸和孵化冰上30分钟离心紧随其后。上层清液,用于量化的谷胱甘肽和GSSG,立即被冻结在N₂并将其保持在−80°C到以后使用。柠檬酸颗粒,用于蛋白质硫醇量化,在10%柠檬酸清洗四个周期的声波降解法和离心。最后离心步骤之前,暂停是分为四个量化PSH、PS_牛PSSG,总PS, PSH PSSG,总PS样本立即冻结在N₂并将其保持在−80°C到以后使用。PS_牛用样本直接可溶性和烷基化的颗粒在500年μL 5% SDS, 1毫米EDTA, 20毫米NEM(σ)0.5米Tris-Cl pH值8.3。烷基化是任至少20分钟前样品被转移到−80°C。硫醇和二硫化物物种在柠檬酸上层清液和柠檬酸颗粒分数量化描述的(3]。短暂、PSH样本5% SDS可溶性,1毫米EDTA在0.4 M柠檬酸钠,pH值4.5和蛋白质硫醇被添加4-DPS量化(σ)的最终浓度0.5毫米其次是高效液相色谱分析。PS的量化_牛、样品与NEM烷基化是减少的黑洞(σ)的终浓度3.3% (w / v)。量化与4-DPS之前,黑洞被盐酸的加入,如[18]。总量化了PS增溶的颗粒在5% SDS, EDTA 1毫米,0.5米Tris-Cl pH值8.3,减少所有硫醇BH,其次是硫醇与4-DPS量化。PSSG样品中可溶性6 M尿素,EDTA 8毫米和200毫米n -二甘氨酸pH值9.2。二硫化减少2.1毫米THP (Calbiochem)和硫醇被添加6.4毫米derivatized SBD-F(丙烯酰胺)1小时60°C。比较样本,总蛋白质含量由使用一个基于茚三酮的测定[3]。

4.3。量化细胞内谷胱甘肽分泌

一个基于巯基衍生化高效液相色谱法测定N - (1-pyrenyl)马来酰亚胺(丙烯酰胺)是用来量化GSSG和总GS(谷胱甘肽+ GSSG)从所述上层清液1]。谷胱甘肽被减去总谷胱甘肽氧化谷胱甘肽从量化。量化的分泌谷胱甘肽、蛋白质在媒体从收获细胞沉淀添加柠檬酸10% (v / w)和孵化冰上30分钟离心紧随其后。总谷胱甘肽是量化的柠檬酸上层的如上所述。

缩写

谷胱甘肽:	谷胱甘肽
GSSG:	二硫化谷胱甘肽
PSH:	蛋白质硫醇
PS牛:	蛋白质二硫
PSSG:	混合蛋白质和之间的二硫化谷胱甘肽
呃:	内质网
PDI:	蛋白二硫化物异构酶
Ero1:	内质网oxidoreductin 1
搞笑:	免疫球蛋白
柠檬酸:	三氯乙酸
SBD-F:	7-fluorobenzo-2-oxa-1, 3-diazole-4-sulfonate
经过:	三(羟丙基)膦
NEM:	N-ethylmaleimide
BH:	硼氢化钠
4-DPS:	4,4′-dithiodipyridine
有限合伙人:	脂多糖
ROS:	活性氧物种。

利益冲突

作者宣称他们没有经济利益冲突。

确认

多丽丝·罗斯是感谢批判性阅读。这项工作是由丹麦的资助自然科学研究理事会JRW和顶部和回声资助来自荷兰科学研究、组织化学委员会IB (NWO-CW)。

补充材料

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