细胞氧化还原状态的定量研究涉及各种技术挑战由于SH组的反应性质。必须非常小心,以避免人工空气氧化和消除大硫醇和二硫化物之间特定的试剂,否则会导致虚假的结论( 17]。通过应用之前开发的技术,仔细考虑这些技术缺陷( 3),我们可以定量确定细胞水平总巯基等价物的低分子质量硫醇和蛋白质。实验方法的关键特性见图 1。为了避免扰动的细胞thiol-disulfide地位在细胞溶菌作用和样品制备,细胞酸化的柠檬酸的终浓度10%,导致蛋白质变性和降水。这种组合的快速捕获和去质子化同时展开氧化还原酶,其中一些低硫醇pK_一个和相当耐酸作用,淬灭通用硫醇的质子化作用。充分利用我们的方法的力量,我们没有FACS-sort细胞分析之前,我们也没有同质化和分离细胞。

用柠檬酸丸是可溶性的适当的缓冲与高浓度的SDS或尿素量化不同的含巯基的物种在所有细胞蛋白包括膜蛋白质。PSH和PS_牛水平与高度敏感的高效液相色谱法测定分析基于硫醇量化代理4-DPS [ 18]。半胱氨酸的蛋白质的总价值(PS)总被PSH和PS计算_牛和验证方法,这个值也决定实验。对实验进行休息B细胞之间有一个很好的协议实验确定值的计算和实验确定PSH和PS_牛(数据没有显示)。最后,PSSG水平有选择地使用量化的硫醇SBD-F衍生代理。SBD-GS导数是高荧光,可以具体量化由于其独特的保留时间在一个高效液相色谱色谱( 3]。除了蛋白质巯基,确定每个样本的总蛋白质含量和用作公分母比较个人样本。这是一个关键的一步,因为它消除了任何可能的偏差从柠檬酸颗粒不均匀分为分数。此外,要求一个公分母在这项研究中尤其重要,因为它也消除了任何偏见由于形态细胞样本之间的差异。总蛋白质含量是基于完整的量化使用方法在盐酸水解后的量化释放氨基酸与茚三酮( 3]。这就构成了一个高度可再生的和敏感的方法,用一个合适的标准,它得到的数字,可以校准”氨基酸的蛋白质。“此外,茚三酮测定独立于蛋白溶解度,因此包括可溶性和膜蛋白。因此,下面的所有数据将显示为巯基/氨基酸(SH / aa)。

作为B细胞分化的一个模型,我们使用先前建立系统基于小鼠B细胞淋巴瘤1.29 μ⁺可引起脂多糖(LPS)分泌IgM ( 13, 19]。获得一个良好定义的参考点的B细胞分化成浆细胞,我们量化thiol-disulfide uninduced B细胞获得地位分化为浆细胞的参考点。细胞被播种密度 0 。 2 × 10 6 细胞/毫升,每天为氧化还原量化采集样本在接下来的四天。虽然在此期间细胞密度大大增加,蛋白质氧化还原状态保持不变在整个实验过程(数据 2(一个)和 2 (b))。此外,水平PSSG GSSG,谷胱甘肽保持不变(数据未显示),我们得出的结论是,全球thiol-disulfide地位独立的细胞密度。因此,数据的平均值得到的氧化还原物种在四天计算,和相对分布不同的蛋白质和谷胱甘肽巯基等价物在表 1。从这些数据,我们得出的结论是,绝大多数的细胞含巯基的等价物中存在降低硫醇形式只有5%和9%的PS和GS等价物从事二硫键的形成,分别。极的一小部分细胞含巯基的等价物和PSSG发现。在一起,这些数据描述的总thiol-disulfide环境休息B细胞,我们使用他们作为研究的参考点antibody-secreting浆细胞分化。在剩下的这部分的研究中,这些数据将被称为天0的分化。有趣的是,硫醇和二硫化物等价物的分布休息B细胞非常相似的HEK人类胚胎肾细胞,发现6%的PS等价物PS_牛和8.5%的GS GSSG等价物被发现。另外,我们观察到细胞PSSG水平极低的支持导致HEK和海拉细胞 3]。应该提到,尽管细胞生长在的存在 β巯基乙醇,在柠檬酸上层清液,也发现少量的柠檬酸小球,它没有干扰谷胱甘肽或PSSG测量,因为荧光 β巯基乙醇衍生品分离有效GS衍生品的高效液相色谱(数据没有显示)。

1.29休息 μ⁺细胞治疗与LPS诱导分化成antibody-secreting浆细胞。样本准备全球硫醇量化后,1,2,3,4天的有限合伙人的待遇。总PS等价物(SH / aa的人物 3(一个)),我们发现半胱氨酸残基在蛋白质是相当恒定的频率(~ 2%)在分化。这是在良好的协议与实验测定值其他哺乳动物细胞系以及真核生物计算值一般汉森( 3, 20.]。总PS的SH / aa将很大程度上影响在分化为IgM单体的半胱氨酸频率为2.5% (IgM有1540个氨基酸,其中38半胱氨酸( 21])。虽然总PS等价物保持不变的绝对值在整个实验过程中,蛋白质的分布硫醇和二硫化物LPS-induced细胞分化的影响。蛋白质的比例硫醇从事二硫键的形成仍很大程度上影响了LPS诱导两天后,但在第三天PS_牛值翻了一倍,共增加3.3倍被发现在第四天(图 3 (b))。同样,后两天的滞后时间,第三天PSSG已经增加了2.2倍,但与PS_牛,PSSG值没有进一步增加四天(图 3 (c))。有趣的是,PSSG比PS_牛在整个实验过程(图基本上保持不变 3 (d))。量化的绝对浓度的可溶性谷胱甘肽等价物透露GSSG仍很大程度上不受影响(图 4(一)的分数),但氧化GS等价物(GSSG GS)相对于总GS等价物(GS)从8.8%上升到14.5%(图 4 (b))。这是由一个渐进的减少谷胱甘肽(图 4(一))导致整体下降56% (GS)每天4比0。PSSG GS等价物没有恢复,整个研究保持一分钟总GS等价物(图的分数 4 (c))。排除,减少细胞内GS是由死细胞,增加凋亡和坏死细胞用流式细胞仪测量并与cell-impermeable染料染色propidium碘(π)。尽管可行的分数(PI-negative)细胞分化过程中降低了1.5倍(补充材料图1网上 http://dx.doi.org/10.1155/2013/898563),它不能占据我们观察到减少细胞内谷胱甘肽(见补充材料文本)。作为减少细胞内GS不是解释为增加细胞死亡,我们测量GS等价物是否由细胞分泌的。没有可检测谷胱甘肽在空白中样本(数据未显示);媒体uninduced细胞,然而,包含了可测量的大量的谷胱甘肽,和值显著增加感应(图后3至4天 4 (d))。应该注意的是,这些数字只是粗略估计,由于细胞外GS值很可能低估了降解催化 γ 谷酰基转移酶。从数据中显示数据 4(一)和 4 (d),增加细胞外GS / aa等价物相对于第0天第四天计算( 0.23 ± 0.1 ) × 10 - - - - - - 2 而减少细胞内GS / aa计算( 0.46 ± 0.05 ) × 10 - - - - - - 2 。的两个数字是相同的尺寸范围,有可能是区分细胞分泌谷胱甘肽(细节给出了辅料的文本)。

1.29 μ⁺细胞被维护在悬架中描述( 13),2天后,细胞培养基被新鲜培养基所取代。分化,细胞培养的20倍 μg / mL有限合伙人(σ)。三个独立的文化与LPS诱导和采集标本后1、2、3或4天的分化。作为一个控制样本收集3个独立的培养没有有限合伙人。每天LPS激活后,采集样本进行流仪分析。细胞被沾染了π(σ)和流式细胞仪数据得到FACScalibur (BD生物科学)和分析使用Cellquest软件(BD生物科学)。

细胞被离心收获之后洗步骤10毫升杜尔贝科的1 x PBS (PAA)实验室消除蛋白质从媒体的痕迹。细胞被resuspended 1毫升冰冷的10% (w / v)柠檬酸和孵化冰上30分钟离心紧随其后。上层清液,用于量化的谷胱甘肽和GSSG,立即被冻结在N₂并将其保持在−80°C到以后使用。柠檬酸颗粒,用于蛋白质硫醇量化,在10%柠檬酸清洗四个周期的声波降解法和离心。最后离心步骤之前,暂停是分为四个量化PSH、PS_牛PSSG,总PS, PSH PSSG,总PS样本立即冻结在N₂并将其保持在−80°C到以后使用。PS_牛用样本直接可溶性和烷基化的颗粒在500年 μL 5% SDS, 1毫米EDTA, 20毫米NEM(σ)0.5米Tris-Cl pH值8.3。烷基化是任至少20分钟前样品被转移到−80°C。硫醇和二硫化物物种在柠檬酸上层清液和柠檬酸颗粒分数量化描述的( 3]。短暂、PSH样本5% SDS可溶性,1毫米EDTA在0.4 M柠檬酸钠,pH值4.5和蛋白质硫醇被添加4-DPS量化(σ)的最终浓度0.5毫米其次是高效液相色谱分析。PS的量化_牛、样品与NEM烷基化是减少的黑洞(σ)的终浓度3.3% (w / v)。量化与4-DPS之前,黑洞被盐酸的加入,如[ 18]。总量化了PS增溶的颗粒在5% SDS, EDTA 1毫米,0.5米Tris-Cl pH值8.3,减少所有硫醇BH,其次是硫醇与4-DPS量化。PSSG样品中可溶性6 M尿素,EDTA 8毫米和200毫米n -二甘氨酸pH值9.2。二硫化减少2.1毫米THP (Calbiochem)和硫醇被添加6.4毫米derivatized SBD-F(丙烯酰胺)1小时60°C。比较样本,总蛋白质含量由使用一个基于茚三酮的测定[ 3]。

一个基于巯基衍生化高效液相色谱法测定N - (1-pyrenyl)马来酰亚胺(丙烯酰胺)是用来量化GSSG和总GS(谷胱甘肽+ GSSG)从所述上层清液 1]。谷胱甘肽被减去总谷胱甘肽氧化谷胱甘肽从量化。量化的分泌谷胱甘肽、蛋白质在媒体从收获细胞沉淀添加柠檬酸10% (v / w)和孵化冰上30分钟离心紧随其后。总谷胱甘肽是量化的柠檬酸上层的如上所述。