分区和胞外分泌的分泌颗粒在PC12细胞的分裂

文摘

的生物起源、成熟和胞外分泌的间期细胞中分泌颗粒良好的文档记录,而这些hormone-storing细胞器的分布和胞外分泌细胞分裂期间没有受到应有的重视。通过结合超微结构分析和延时的显微镜,我们表明,在划分PC12细胞,分泌颗粒的突出的边缘定位是保留在前期但很明显减少在前中期,最终只有少数外围局部中期细胞中分泌颗粒。在后期和末期,分泌颗粒表现出明显的运动细胞midzone,显然,他们的脚步与纺锤体微管。胞质分裂期间,分泌颗粒被排除在中间体和积累的基础细胞间桥。此外,通过测量胞外分泌在单一粒级,我们表明,在细胞分裂的各个阶段,分泌颗粒胜任监管胞外分泌。总之,我们的数据揭示复杂的分子机械的分泌颗粒再分配在细胞分裂,促进其从F-actin-rich皮层和主动运输纺锤体微管。

1。介绍

分泌颗粒(SGs)包含神经内分泌细胞的细胞器的激素和神经肽释放其内容depolarization-induced, Ca^{2 +}端依赖胞外分泌。这些高仿的生物起源和刺激分泌细胞器数量一直在深入研究各种间期细胞模型(1- - - - - -5]。神经内分泌的PC12细胞,实时研究发现的生物起源后不久反式高尔基体网络,SGs进行单向、microtubule-dependent运输到质膜(PM) (3]。研究体内MIN6细胞识别kinesin-1候选人马达蛋白的运输步骤(6]。SGs的PC12 MIN6细胞也发现接受肌凝蛋白Va-dependent F-actin-rich皮层运动和限制,在他们完成他们的成熟7]。在间期细胞,大多数SGs在PC12细胞固定化下面点,称为形态学停靠(3,8,9]。许多研究胞外分泌的停靠SGs透露两个主要的SGs池根据他们对刺激的反应,也就是说,随时可发布的池和储备池10]。对嗜铬细胞,这是表明SGs,哪些不被胞外分泌,最终从细胞皮层中删除,取而代之的是新的5]。

与频繁的SGs在间期细胞的研究,这些细胞器的命运在细胞分裂过程中却没有得到足够关注。一般来说,两个基本的分区策略提出了细胞器继承在细胞分裂(11,12]。继承时观察到的随机模式各自的细胞器出现在高拷贝数(例如,过氧化物酶体13])。在这种情况下,胞质分裂确保一个近似等于分区之间的子细胞。相比之下,下令继承模式假定细胞器较低拷贝数需要分配给子细胞的活性机制涉及细胞骨架元素。后者的范式是有丝分裂过程中,染色体的分离。

据我们所知,只有一项研究[14)解决SGs在细胞分裂的命运。基于电子和固定细胞免疫荧光显微镜,作者提供了证据的microtubule-dependent重组adrenocorticotropin-containing SGs At20细胞分裂时(14]。此外,一些研究调查SGs的常规功能是否受损的细胞分裂。这表明膜泡运输路线从内质网到高尔基体舱以及本构的分泌途径反式高尔基网络在有丝分裂(PM似乎慢下来15- - - - - -17]。此外,监管的分泌组胺和5 -羟色胺在老鼠嗜碱细胞在分裂细胞减少10倍(18,19]。虽然底层机制中观察到的影响有丝分裂仍然难以捉摸,停止分泌过程的一个有利的解释是与目标膜囊泡融合的抑制有丝分裂细胞(15,18]。

在这项研究中,我们调查了继承和SGs的功能在细胞分裂过程中通过应用先进的标签和成像技术。特别是,使用两个绿色荧光蛋白融合蛋白选择性地标签SGs PC12细胞分裂和微管使我们能够遵循这些标记的动态关联SGs的运动和有丝分裂纺锤体的空间和时间的细节。此外,为了解决SGs的功能,我们监控调节分泌腔的标记的SGs在单一粒级和SGs的能力确定监管胞外分泌的不同阶段有丝分裂。

2。结果

2.1。外围地本地化SGs的数量减少中期细胞

早期的研究表明,大多数的SGs相间PC12细胞局部在靠近点(3,8,9]。这证实了一个相间PC12细胞的超微结构分析(图1),SGs没有装饰点均匀但经常出现在离散累积数据1(一)-1(一个₂))。分析是否SGs保留其外围本地化或进行再分配在细胞分裂过程中,我们分析了PC12细胞群同步的双胸苷。在超微结构水平上,有丝分裂细胞区别于间期细胞染色质的凝聚状态(图1(B), CH-label)和缺乏一个完整的核被膜(图1(B),比较图1(A))。有丝分裂细胞似乎包含一个类似数量的猴细胞器间期细胞相比,一致认为SGs保留在有丝分裂期间。在中期细胞,SGs在很大程度上缺席细胞外围(数字1(B),1(B₁))和一些SGs靠近点没有在间期细胞中积累,但单(数字1(B),1(B₁))。没有观察到优惠SG的积累,相反,SGs几乎均匀地分布在细胞质中,除了这些地区被染色体(图1(B), CH-label)。量化的外围SGs报告显示,在间期细胞的比例平均70±3% (±SD)总数的SGs外围地本地化,而只有13±4% (±SD)在中期细胞(图2(C))。这个量化表明形态学停靠SGs的数量显著降低在中期相比相间PC12细胞。

2.2。SGs在前中期从外围中解放出来

为了区分细胞在前期和前中期,我们检查了SGs在有丝分裂早期的分布与免疫荧光共焦显微镜相结合。Secretogranin II (SgII),监管的战车家族成员分泌蛋白质,有效排序在SGs PC12细胞作为一个内生的标志SGs (20.]。SGs的模式分布在间期和前期细胞非常相似。大多数的SGs在这些细胞外围局部积累的数据3(一),3(D),箭头),只有少量的SGs细胞质(数字3(一),3(D),箭头)。有趣的是,外围SGs在前中期细胞频率明显下降(图3(G),箭头),平行的SGs的数量的增加更深层的细胞内(图3(G),箭头)。SGs,留在外围出现单一puncta间断信号,而不是积累在间期和前期(比较数据3(G)3(一)和3(D))。在中期细胞,这些碎片的外围地本地化SGs进一步减少,大多数的SGs几乎是均匀分布在细胞质中,除部分的染色体(数字3(J)和3(左))。后者是与中期PC12细胞的超微结构的分析一致。

调查如果外围的逐步丧失SGs prometa - /中期由于F-actin-rich皮质的解聚,分裂PC12细胞表达γ-actin-EGFP融合蛋白被延时共焦显微镜分析。这显示一个明显的信号皮质肌动蛋白在细胞分裂的各个阶段(图4),这是堪以相间PC12细胞。因此,皮质f -肌动蛋白似乎保持不变在PC12细胞分裂和SGs的释放从这个区域可能造成损失的功能附件f -肌动蛋白而不是f -肌动蛋白本身的解聚。

2.3。SGs积累在细胞Midzone安娜和末期

相似的免疫荧光和共焦分析后期和末期PC12细胞显示,大多数的SGs积累在细胞midzone(数字5(一)-5(C₁)和数字5(D) -5(F₁),职责)。图中所描绘的一样5(B₁)/5(C₁),5(E₁)/5(F₁),在这些阶段频繁colocalisation SGs(箭头)和纺锤体微管(箭头)。这种再分配的SGs细胞midzone也明显在超微结构水平(请见图6)。SGs也经常在靠近观察到微管在超微结构水平(图6(B₂)),链接器结构,让人想起一个马达蛋白(图6(B₂),红色箭头)。

SGs的观察再分配向细胞midzone明显colocalisation SGs和纺锤体微管建议SGs可能积极运入细胞midzone通过微管。因此,我们研究了SGs相对于有丝分裂过程中微管细胞骨架动力学live-cell成像。PC12细胞是cotransfected cDNA构造编码hCgB-myc-DsRedExpress (SGs)的荧光标记和EGFP-tubulin和受到分析的同步协议和广角荧光延时显微。有丝分裂细胞表达外源融合蛋白都容易成像,通过有丝分裂的各个阶段(图发展7和补充材料可用http://dx.doi.org/10.1155/2012/805295、电影SM2、记录时间9分58秒)。在中期,SGs几乎是均匀分布在细胞细胞质被染色体(除部分数据7(一个₁),7(一个₂)),这是在协议与数据得到的共焦和超微结构分析(图1(B)和数字3(J),3(左))。后期的开头,SGs暂时积累网站在未来的卵裂沟(数字7(B₁),7(B₂)),而在后期积累的SGs也出现在细胞midzone(数字7(C₁),7(C₂))。年底的末期,大多数SGs发现细胞midzone(数字7(D₁),7(D₂)在胞质分裂,SGs积累底部的细胞间桥(数字7(E₁),7(E₂))。

假定的SGs和纺锤体微管之间的互动也支持这些live-cell成像数据。SGs的轨迹走向在后期和末期细胞midzone经常与纺锤体微管(与数据7(F)7(我))。SGs的平均速度与定向运动在后期是0,23±0,09年μ米/秒(±SD)。这些观察结果一致与纺锤体微管的摆设与SGs由固定的共焦分析记录后期和末期PC12细胞(比较图5)。

2.4。SGs积累在细胞间桥的基地和中间体的缺席

应用PC12细胞胞质分裂是容易区别于其他细胞由于紧束微管在细胞间桥和中间体。SGs在这些细胞积累在细胞间桥的基地,但没有形成中间体(数字8(一)-8(C))。与这些免疫荧光数据一致,SGs经常被发现在细胞间cytokinetic基地的桥和缺席“中体矩阵”地区在超微结构水平(图8(D₁))。后者的观察也证实了live-cell分化PC12细胞的荧光成像技术(补充材料,电影SM1)。因此,获得的证据与所有三种类型的显微镜分析表明,SGs在PC12细胞中积累在细胞间桥的基地,但在很大程度上排除在中间体和细胞间桥本身。延时实验PC12细胞的胞质分裂也显示运动的SGs和远离基地的细胞间桥(补充材料,电影SM3)。这些细胞器运动的平均速度是0,34±0,09年μ米/秒,这是符合SGs见以前的microtubule-dependent运动相间PC12细胞(3]。

2.5。SGs进行调节有丝分裂PC12细胞胞外分泌

处理PC12细胞是否胜任监管胞外分泌细胞分裂期间,刺激分泌的SgII进行了分析。同步PC12细胞受到depolarization-induced刺激通过孵化高K⁺生长培养基,其次是一个表面immunolabelling SgII在4°C(详情见材料和方法)。控制,nonstimulated细胞(中补充了55毫米氯化钠)并行地进行了分析。

在控制条件下,SgII几乎没有可检测间期和分裂PC12细胞的表面(图9(B))。然而,刺激细胞表现出突出的为SgII表面染色(图9(A))。有趣的是,也有丝分裂细胞对刺激和经常显示新胞吐SgII细胞表面(数字9(E),9(G),9(我))。的注意,间期和有丝分裂细胞表面信号强度从细胞到细胞(图的差异很大9(A))。的定量和客观的评估分数surface-stained细胞以及表面污渍的强度间期和中期细胞,我们设计了一个半自动的计算算法surface-staining用户选择细胞的信号强度(详情请见图10材料和方法)。这个量化显示,大约80%的间期和65%的中期细胞显示信号强度高于背景(图9(K))。此外,平均信号强度的污点的中期细胞约60%相比,间期细胞(图9(K))。综上所述,这些数据表明,尽管有大约2倍降低效率,调节胞外分泌细胞分裂是能胜任的。

3所示。讨论

3.1。SGs在PC12细胞的遗传

在这项研究中,在细胞分裂的分区和动态SGs神经内分泌PC12细胞的全面分析。本文提供的数据一致的物质吸引结论Tooze和伯克SGs的继承At20细胞(14),但在扩展他们的研究,提供详细的和直接洞察SGs的动态和分布在分裂过程中。这些直接的见解尤其从成像方法获得SGs和微管在细胞分裂的连续阶段。根据我们的研究结果,我们提出以下模型SGs在细胞分裂(图的重新分配11)。在间期,大约70%的所有SGs仅限于F-actin-rich细胞皮层。因此,这部分被称为形态学停靠(图11)。在前中期,形态停靠SGs解放从细胞皮层和传播在整个细胞。在中期,几乎所有SGs分布几乎同质的细胞质中(图11)。在发病后期,SGs与和沿着midzone到达细胞的纺锤体微管。这导致一个初始积累细胞赤道,SGs的新生收缩环并列。随后,他们从那里蔓延在整个细胞midzone占据的空间解放pole-directed运动的染色体(图11)。胞质分裂期间,逐步收缩环的收缩导致排斥的SGs中间体及其随后的积累在细胞间桥的基地。尽管SGs展览双向,大概microtubule-dependent运动基地的细胞间桥,积累在这些网站保留直到胞质分裂(图11)。唯一的显著差异的遗传模式SGs AtT20和PC12细胞的胞质分裂过程中观察到:SGs AtT20细胞积累主要中间体,SGs在PC12细胞在胞质分裂的基地桥积累并被排除在中间体。这最有可能反映了体系结构和生物力学的特异性差异中间体结构本身的收缩。

3.2。再分配的SGs在细胞分裂

两个连续的过程似乎安排SGs在PC12细胞有丝分裂的再分配:释放细胞外围的SGs在前中期的SGs /中期和积累细胞midzone在后期和末期。同意之前的数据显示,细胞皮层的SGs的保留是依赖SGs和f -肌动蛋白皮质之间的交互3),观察到的减少SGs的皮质定位在有丝分裂意味着这种交互是废除。我们发现f -肌动蛋白皮质PC12细胞的有丝分裂的过程中保持(请见图4)表明,SGs的再分配不是皮质f -肌动蛋白的解聚的结果。在先前的研究中,我们报告说,肌凝蛋白Va的显性负突变导致强烈的SGs的外围限制取消相间PC12细胞(7]。因此,它是可能的,在进入有丝分裂,肌凝蛋白Va-assisted捕捉皮层构成的SGs的取消导致几乎完全释放SGs在中期。支持这一假设的研究罗杰斯et al .,这肌凝蛋白Va-dependent能动性的差别表现出对这些黑素体与metaphase-arrested治疗后非洲爪蟾蜍鸡蛋中提取(21]。

发现SGs装修和似乎沿纺锤体微管表明microtubule-dependent细胞器运输发生在有丝分裂。这对比一般教条microtubule-dependent运动性的膜结合细胞器期间抑制有丝分裂(22]。解释这种差异的一个方法是,细胞器的实验cell-cycle-dependent监管与相间,metaphase-arrested能动性进行非洲爪蟾蜍提取,而我们观察到的动态colocalisation增加SGs和纺锤体微管在有丝分裂中期后阶段(即。安娜,末期)。因此,可想而知,microtubule-dependent细胞器交通被阻塞在中期和激活在安娜和末期,可能在一个细胞,和/或organelle-specific方式。

3.3。胞外分泌细胞分裂期间SGs

到目前为止,分泌过程在细胞分裂过程中研究了在几个细胞系统15- - - - - -18]。除了少数例外,似乎普遍接受与他们的目标膜囊泡的融合在有丝分裂严重抑制。在这项研究中,我们重新调查这个问题通过关注SGs特征明显的PC12细胞系统。通过使用一个半自动的算法评估SG胞外分泌显微镜图像(图10),我们发现明显证据SGs胞外分泌的中期PC12细胞,这表明融合机械调节有丝分裂PC12细胞分泌途径的功能。观察到的2倍减少监管胞外分泌与间期细胞可能是由于大脑皮层观察到的损失限制SGs在中期导致不利位置的融合点。

之前的数据监管胞外分泌在有丝分裂期间表示,刺激释放组胺和5 -羟色胺在有丝分裂老鼠嗜碱细胞白血病(家庭成员)至少10倍减少相比,间期细胞(18,19]。尽管这两项研究进行了同样的细胞系,它们导致不同的结论,为什么胞外分泌堵住了。奥利弗等人将分泌块失败在跨膜信号antigen-mediated刺激和预测,分泌囊泡的融合点有丝分裂细胞的功能如果第二信使Ca^{2 +}是在正常范围内(19]。赫斯基等人得出的结论是,SGs的融合点在有丝分裂细胞受损,因为他们并没有发现任何显著性差异^{2 +}水平之间的间期和有丝分裂细胞(18]。我们的数据记录只有2倍减少胞外分泌的SGs分裂和相间PC12细胞表明SGs的融合点的程度并不严重,因此分泌交通可能在有丝分裂功能。支持这一观点的研究本构蛋白分泌,这表明post-Golgi囊泡的融合能力点在有丝分裂中国仓鼠卵巢(CHO)细胞16]。

总之,我们的研究提供了直接洞察SGs的再分配在细胞分裂和启示了底层复杂的分子机制促进释放的SGs F-actin-rich皮层和纺锤体微管一起运输。因此,尽管SGs代表高复制细胞器,我们的研究结果支持有序继承模型涉及主动运输。此外,我们的数据表明,在有丝分裂的各个阶段exocytosis-competent SGs。

4所示。材料和方法

4.1。培养和同步PC12细胞的数量

PC12细胞(大鼠嗜铬细胞瘤细胞,克隆251,(23])种植所描述(24]。为了增加有丝分裂细胞的数量,一天后镀的细胞群被孵化prewarmed生长培养基补充4毫米胸苷(西格玛奥德里奇化学GmbH,慕尼黑,德国)24小时(块中细胞分裂s阶段)。的细胞被洗prewarmed生长培养基一次,随后孵化在生长介质(胸苷块)的释放。18个小时之后我们分析各种类型的显微镜的细胞群。后者同步协议导致了大约10%的细胞有丝分裂。

4.2。免疫荧光

间接免疫荧光法的微管和SGs以及染色的DNA进行描述(3]除了Moviol解决办法是补充了1 1 5%,4-diazabicyclo[2.2.2]辛烷(DABCO)(西格玛奥德里奇化学GmbH,慕尼黑,德国)。以下主要使用抗体:单克隆抗体antitubulin(克隆DM1A,西格玛奥德里奇化学GmbH,慕尼黑,德国);718多克隆抗体对大鼠secretogranin II描述(20.]。二次抗体购自杰克逊免疫研究实验室,Inc .)、西树林,宾夕法尼亚州,美国:驴anti-mouse FITC(1: 200)和山羊anti-rabbit TRITC (1: 500)。DNA与赫斯特染色染料33258(分子探针,Inc .,尤金,或者美国)。

4.3。克隆pcDNA3-hCgB-myc-DsRedExpress和转染PC12细胞

荧光标记微管和SGs, PC12细胞与pEGFP-tubulin double-transfected(帕洛阿尔托Clontech实验室、钙、美国)和pcDNA3 / hCgB-myc-DsRedExpress。后者cDNA构造是由放大的myc-DsRedExpress cDNA pCMV-DsRedExpress(帕洛阿尔托Clontech实验室、钙、美国)与(3′5′)益生元序列“ggc ggg ggt acc aga aca aaa猫ctc aga aga gga tct手枪ggc ctc ctc cga cg”和“ccc ccc棉酚ttc cta cag棉酚cag gtg g”正向和反向引物,分别。放大DNA序列的结扎KpnI和EcoRI-digested pcDNA / hCgB-EGFP [3通过标准的技术)。Actin-GFP DNA描述其他地方(25]。PC12细胞群被电穿孔转染如前所述[1]。

4.4。荧光显微镜

广角延时显微进行一个奥林巴斯IX70配有PCO CCD相机和彩色II光源(TillVision、Martinsried、德国)和适当的滤波器组。共焦荧光显微镜的固定样本进行莱卡SP2(徕卡微系统,曼海姆,德国)。共焦荧光的延时显微actin-EGFP-transfected有丝分裂PC12细胞(图4)进行莱卡SP5(徕卡微系统,曼海姆,德国)。显微镜进行100 x / 1.4 NA的目标。成像系统的空间分辨率是200 - 250 nm,根据成像模式,用来激发波长各自的荧光团。

4.5。透射电子显微镜法

TEM分析,细胞准备根据标准协议。简而言之,同步PC12细胞群被固定在2,5%戊二醛,后缀OsO在1%₄/ 1,5% K₄铁(CN₆),在一系列的脱水乙醇/氧化丙烯治疗和安装在环氧树脂。超薄切片(80 - 100 nm)准备,与柠檬酸铅和分析一个EM 10 CR蔡司电镜的加速电压80 kV。统计分析(图2),片中间的三种不同的细胞在间期和中期,来自三个独立实验中,分别被评估。

4.6。刺激PC12细胞和Surface-SgII染色

为了分析胞外分泌的SGs的PC12细胞分裂时我们使用了一个建立协议所述Pimplikar和Huttner [26]。Nontransfected细胞群被镀在PLL-coated(0, 1毫克/毫升)盖玻片和同步。17日,5个小时后胸苷脱产进修盖玻片被转移到增长中补充了55毫米氯化钾氯化钠或55毫米。细胞培养10分钟37°C和10%的公司₂然后放在冰。生长培养基是立即用0,取而代之的是冰冷的PBS补充MgCl 5毫米₂和1毫米CaCl₂(PBS-Mg-Ca)。5分钟后的孵化,PBS-Mg-Ca取代新鲜PBS-Mg-Ca补充0.2%明胶和anti-SgII抗体71820.]。在0°C 30分钟的孵化后,细胞被洗两次与冰冷的PBS-Mg-Ca /明胶0.2%和固定PFA冰冷的4% / 4%蔗糖在室温下15分钟。从这里进一步措施都是在室温下进行。50 mM NH的固定剂就熄了₄Cl,细胞在PBS-Mg-Ca /明胶0.2%洗一次,然后在PBS-Mg-Ca孵化20分钟/明胶0.2%补充二次抗体(goat-anti-rabbit-TRITC)和赫斯特染料,安装在Moviol紧随其后。

4.7。量化的Surface-Exposed SgII信号

比较胞外分泌的速率之间的间期和中期细胞,我们应用一个自动化应用程序用MATLAB编写的。同步层的PC12细胞immunolabeled SgII和赫斯特如上所述。并联一个麦胚凝集素(WGA)表面染色进行(WGA-Alexa萤石488,500 ng / mL)。中期细胞,赫斯特发现的污点,是随机抽取的,三个渠道SgII(励磁555海里),美国(励磁488 nm)和赫斯特(励磁400海里),分别记录在单元midzone使用宽视野成像设置。间期细胞中可见同一光学平面被用作内部控制对于每个中期细胞(见下文)。作为第一步在量化协议统一WGA的表面染色用于自动化的细胞分割(27)(图10(一),10(C))。所确定的细胞边界以外的细胞集群延长3像素每一方和由此产生的面具与SgII通道(图叠加10(F))。面罩内的总强度SgII信号除以面具的像素面积计算。由于强烈的可变性SgII信号的细胞边界位于细胞内集群,他们不考虑量化。获得的平均像素值的SgII刺激条件下的平均像素值确定的同样如果细胞是减去背景。

背景减法后的平均像素值≤0分为刺激细胞,没有回应。细胞的比例和强度值≥0除以总数量的细胞显示细胞的比例对刺激作出了回应。

作者的贡献

n v B。,a。R。,和h。g .设计研究;n v b进行实验;e·h·写数学算法评估SgII exocytotsis;t·w·e·克隆的互补编码hCgB-DsRedExpress;p . e .执行最初的实验有丝分裂细胞的细胞周期同步和共焦成像。h。g, a . r .构思项目和写的纸一起n v B。

确认

作者感谢Andrea Hellwig和西格丽德Riese优秀的技术援助与电子显微镜和细胞培养,分别Hilmar坏空间和基础设施。n . v . b .支持通过从卑尔根大学的助学金,助学金的e·h·挪威研究委员会。h。g是一个接受者的赠款德意志Forschungsgemeinschaft (Ge 550/3),挪威研究理事会和Meltzer基金会。他们想把现在的地址:喷嘴速度B目前在跨学科纳米物理学中心工作,物理系,渥太华大学,加拿大,p . e .在Medizinische Klinik毛皮Infektiologie Pneumologie,夏洛蒂柏林,德国,和a。r .生物物理化学、海德堡大学德国智能系统和MPI,强新材料和生物系统公司、德国斯图加特。

补充材料

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