igf - 1对和通过PI3K / Akt信号通道在新生儿心脏细胞

文摘

先前的研究表明,心脏肥大sarcolemmal钾电流中扮演重要的角色。通过激活的igf - 1会导致心脏肥大PI3K / Akt信号。然而,igf - 1之间的关系,PI3K / Akt信号和sarcolemmal钾电流仍然未知。因此,我们测试了假设igf - 1和PI3K / Akt信号,独立,减少新生大鼠心肌细胞动作电位sarcolemmal钾电流。我们比较了延迟外向整流()和整流器内()电流密度导致的igf - 1治疗造成模拟的PI3K / Akt信号使用adenoviral(广告)BD110和野生型Akt LY294002抑制PI3K信号造成的。广告。BD110和广告。一种蛋白激酶下降这些被LY 294002减毒的精神性。igf - 1治疗降低了和但只有衰减是LY294002减毒的。这些发现表明,igf - 1可能导致心脏肥大PI3K / Akt信号转导机制在新生大鼠心肌细胞。LY294002未能有效地对抗igf - 1诱导衰减显示一个信号通路兼职PI3K / Akt有助于igf - 1保护arrhythmogenesis在这些细胞。我们的研究结果暗示sarcolemmal外和内向整流钾通道是基质对igf - 1 / PI3K / Akt信号转导分子。

1。介绍

胞内信号分子参与的复杂的相互关联的网络调节电活动,大小和心脏细胞的收缩性1,2]。sarcolemmal钾电流的调节异常是导致心室肥大,arrhythmogenesis,心力衰竭和猝死在成人(3]。胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)是一种antiarrhythmogenic心脏肌细胞肥大和凋亡调制器(4]。igf - 1被认为有助于心脏肌细胞肥大,同时保护从arrhythmogenesis心脏细胞,细胞凋亡,激活磷脂酰inositol-3激酶(PI3K / Akt)细胞存活细胞内信号4,5]。然而,igf - 1的作用和PI3K / Akt信号调解sarcolemmal钾电流密度仍然未知。因此,本研究旨在测试假设igf - 1和PI3K / Akt信号独立调节sarcolemmal我_K和在心脏细胞。

2。材料和方法

2.1。动物的准备

符合性声明:如在以下各个部分所讨论的,所有程序符合指南发表的实验动物保健和使用由美国国立卫生研究院(NIH)出版数量85 - 23日,修订后的1996人。怀孕女性Sprague-Dawley老鼠体重200 - 250克的购买的查尔斯河(MA)。老鼠被允许恢复和熟悉新环境的动物屋到达pre-partum霍华德大学医学院3天。大坝的幼崽被保持在安全、清洁和控制室温(70°F - 74°F)与6 h到18:00 h光周期和母亲喂养的食物和水随意。

2.2。重组运载体

运载体重组准备如前所述[6,7co-transfection]的穿梭载体携带的互补脱氧核糖核酸的兴趣来源基础病毒DNA(垫。跟踪和pAd.EASY1)。

2.3。新生儿的老鼠心脏细胞做准备

新生儿心肌细胞制备后新生儿心肌细胞隔离系统工具包(卫氏生化公司)。新孤立的细胞转移到水套有限公司₂孵化器在使用前至少24小时。细胞被置于倒置显微镜的灌注浴在舞台上和过冷与适当的记录解决方案1 - 2毫升/分钟的速度。分离培养的细胞孵化与igf - 1或PI3K信号的LY294002抑制剂,与正常培养基作为控制。也与腺病毒转染细胞携带本构BD110活化剂的PI3K或携带野生型Akt突变体在使用之前,与adenoviral增强型绿色荧光蛋白(Ad.EGFP)作为控制。

2.4。电生理影响我_K和我_K1

心室细胞被置于培养皿的细胞外缓冲区包含(毫米):5氯化钾,1 MgCl2 140氯化钠,10玫瑰,10 d -葡萄糖,氯化钙,0.2 CdCl2,我们增加了0.1μM igf - 1 (8)和/或3μLY 294002 (8),广告。一种蛋白激酶10¹¹空斑形成单位/毫升(10、11)和/或广告。BD110 10¹¹空斑形成单位/毫升(6,7],pH值为7.4。我的电压依赖性_K激活研究获得各自的电流电压数据的关系。为此,350毫秒之间在10 mV电压增量步−40 mV和30 + mV控股−80 mV的潜力,但与200年前脉冲女士−40 mV。为350女士在10 mV电压增量步之间140 mV和90 mV−−控股−80 mV的潜力。稳态电流,测量结束时每个电流响应,绘制命令的函数的潜力。igf - 1的行为,在本构的存在和没有广告。BD110或野生型广告。一种蛋白激酶活化剂和LY294002抑制剂的存在和缺乏PI3K信号,对电流电压的影响进行了分析的关系。294002,PI3K的抑制剂,是购买的细胞信号技术(MA)。(我Sarcolemmal钾电流_K和在电流密度)表示,pA / pF。广告。EGFP数据作为控制评价转染的影响。

2.5。统计分析

单独治疗的新生儿心肌细胞igf - 1的影响,结合本构广告。BD110或野生型广告。Akt激活向量或LY294002抑制剂的PI3K信号pA / pF值在每个膜电位设定在重复测量方差分析比较的意义。

3所示。结果

3.1。igf - 1对我的影响_K

评估的影响igf - 1 / PI3K / Akt信号_K活动,新生儿心肌细胞是药物治疗的具体PI3K信号传导抑制剂LY294002或与腺病毒转染至少24小时携带本构PI3K激活广告。BD110或野生型Akt激活Ad.Akt。图1表明治疗新生儿心肌细胞培养与igf - 1 (2.6±0.4 pA / pF, 39.53±2%;,),转染与广告。BD110 (2.5±0.5 pA / pF, 47.91±1.5%;,与广告)或转染。一种蛋白激酶(2.4±0.3 pA / pF, 50.00±1.4%;,)降低我_K密度了类似的幅度相比,正常的(4.3±0.8 pA / pF;)和广告。EGFP (4.8±0.7 pA / pF;)控制值。记录当前响应如图的代表2。图3还演示了该应用程序的PI3K抑制剂LY294002减毒的igf - 1,广告。一种蛋白激酶,广告。BD110效果显著(4.5±0.5 pA / pF;4.8±0.4 pA / pF;分别为4.2±0.2 pA / pF,)。录音的代表的当前响应LY294002联合治疗在图所示4。

3.2。igf - 1对我的影响_K1

确定的电生理活动是由igf - 1 / PI3K / Akt通路,igf - 1的心肌细胞治疗或与Ad.Akt转染。图5显示,电流密度与igf - 1治疗后下降了23.46±3.8% (−7.5±0.9 pA / pF;,转染后),或者广告。一种蛋白激酶,通过38.54±1.8% (−5.9±0.9 pA / pF;,),而正常的控制(−9.8±0.9 pA / pF;)和广告。EGFP控制值(−9.7±0.8 pA / pF;)。记录当前响应如图的代表6。图7显示应用程序的PI3K抑制剂LY294002未能改变igf - 1和广告。一种蛋白激酶的影响密度。录音的代表的当前响应LY294002联合治疗在图所示8。

4所示。讨论

在心室肥大,离子通道活动的变化是由细胞内信号转导机制连接到胎儿基因项目的加法或减法(9]。igf - 1能激活PI3K和其下游目标Akt,丝氨酸苏氨酸激酶,也称为蛋白激酶(10- - - - - -12]。igf - 1绑定与下游激活受体PI3K和Akt已经证明(13,14]。众所周知,igf - 1在细胞增殖和分化发挥重要作用[15- - - - - -17]。治疗培养新生大鼠心肌细胞,据报道,igf - 1激活特定基因伴随电生理变化(18)和igf - 1信使rna和蛋白质增加与改变sarcolemmal离子电流(19]。此外,过度Akt似乎诱导的心脏的电生理特性变化转基因小鼠(20.,21]。这些发现说明igf - 1的重要角色,以及重要的知识关于空白的igf - 1 PI3K / Akt sarcolemmal钾离子通道的调节细胞生存信号转导通路。

在目前的研究中,我们为钾通道电流密度(我的改变_K和)与治疗相关的培养新生大鼠心肌细胞独自一人,结合两种活化剂(广告。BD110 Ad.Akt)和PI3K / Akt信号通路抑制剂之一。我们演示了我很大的衰减_K和igf - 1的电流密度。在我igf - 1的影响_K似乎介导,很大程度上,PI3K / Akt信号。虽然被发现对治疗敏感与igf - 1和广告。一种蛋白激酶,LY294002 IGF-1-induced衰减上没有显著的影响密度。这一发现表明,igf - 1可能调节由另一个机制影响肺癌下游PI3K / Akt信号和整流器内通道(吉珥)可能不是一个直接的基质PI3K / Akt信号分子。

胞内信号转导分子的刺激器的广告。BD110,持续活跃PI3K和广告。一种蛋白激酶,野生型Akt,减少了我_K密度。野生型的广告。一种蛋白激酶也减少了密度。一种蛋白激酶模拟器广告。一种蛋白激酶也减少了密度。然而,PI3K抑制剂LY294002有效与igf - 1的影响,广告。BD110和广告。一种蛋白激酶在我_K密度,但未能对抗igf - 1和广告的影响。一种蛋白激酶,密度。本研究的一个限制是,广告的影响。BD110上密度并不确定。然而,这些结果暗示PI3K和一种蛋白激酶信号通路的分子在我扮演角色在递减_K密度与igf - 1,影响心脏肌细胞动作电位的持续时间增加。然而,尽管Akt衰减的信号似乎发挥了作用密度与igf - 1,这种效应似乎是独立于PI3K的活动。

igf - 1 / PI3K / Akt信号通路是最好的特点是胞内信号转导的例子导致生理和病理心脏肥大。据报道,igf - 1 / PI3K / Akt信号分子对运动性心肌肥大的[至关重要5,13),与活化激酶(22]。igf - 1 / PI3K / Akt信号的影响我_K和在exercise-hypertrophied心肌细胞并没有被证实。人们很容易推测,igf - 1 / PI3K / Akt信号调节生理成长和肥大和对抗病理性肥大(13]。然而,病理性肥大的机制似乎更加复杂。我们已经表明,igf - 1 / PI3K / Akt信号中也扮演了重要的角色在反常地过度增大的成年大鼠心肌细胞,减少我的电流密度_K和(8,23]。igf - 1似乎移植瞬时外向钾电流与第1阶段的早期复极化的心室肌细胞动作电位在正常新生大鼠心肌细胞(24]。尽管Ito启动复极化,延迟完成复极化去极化和延长主要阶段3整流电流的函数,我_K。我们之前报道的差别,对这些ATP-sensitive钾通道电流volume-overloaded特点,反常地过度增大的成年大鼠心肌细胞被认为增加心室动作电位的持续时间和增加inotropy的细胞25]。我的igf - 1诱导衰减_K本研究中描述也可能有助于延长心室动作电位。这在我igf - 1诱导衰减_K模拟通过激活PI3K / Akt通路使用广告。BD110和广告。一种蛋白激酶和已被证明是敏感的抑制PI3K抑制剂LY294002。这些发现表明,PI3K / Akt信号分子可以作为底物抑制心肌细胞肥大的新生儿心脏细胞。内心整流钾电流负责恢复静止膜电位和心室细胞的兴奋性。Upregulation的据报道,是一个重要的贡献者与心律失常有关心脏肥大细胞(26,27]。IGF-1-induced递减的,模拟通过激活PI3K / Akt信号通路使用广告。Akt和PI3K抑制剂LY294002不敏感,是,因此,可能会依赖于信号分子与一个替代或辅助信号通路如活化激酶扮演一个角色在心脏肌细胞肥大(22]。IGF-1-induced递减的由于的作用静止膜兴奋性,有可能防止arrhythmogenesis与心脏肌细胞肥大(5]。减少内向钾静态电位稳定当前的可能,因此,增加心室arrhythmogenesis的门槛,和吉珥渠道新生儿心脏细胞,因此,函数作为治疗抑制基质可预测,潜在的致命性室性心律失常与成人心脏肥大(28- - - - - -31日)和肥大与新生儿心肌病(32]。

我们没有寻找或遵守任何重大变化在新生儿心脏细胞的大小进行了研究。这些正常的新生儿心脏细胞作为模型来确定我的衰减_K和密度,我们以前观察到反常地过度增大的成年大鼠心肌细胞,而不是在正常成年大鼠心肌细胞暴露于igf - 1 (8,23等)是影响固有的或特定于过度增大的心脏细胞。本研究的结果,展示我下降_K和密度在正常新生儿心脏细胞,表明类似的效果可以从不仅引起反常地hypertophied成年大鼠心肌细胞,但也从正常新生大鼠心肌细胞治疗,或暴露,igf - 1。

5。结论

目前的研究表明刺激的igf - 1 / PI3K / Akt细胞生存信号通路的sarcolemmal减少活动_K向外,新生儿心脏细胞内向整流电流。这些结果在正常新生大鼠心肌细胞在volume-overloaded同意我们之前的报道,反常地过度增大的成年老鼠心脏细胞。我们的研究结果暗示sarcolemmal外和内向整流钾通道是基质对igf - 1 / PI3K / Akt信号转导分子。比较正常的细胞信号转导分子的影响和肥大心肌细胞可能是有用的实验模型阐明sarcolemmal离子通道基质和监管机制新生儿和成人心脏原发性心肌病。

利益冲突

作者没有利益冲突的报告。

承认

这项研究的部分支持由拨款1 R15 AA019816-01 NIH /研究所,GM08016-38美国/ NIH,和2 g12 RR003048 RCMI,研究基础设施,NCRR / NIH g·e·哈达德。

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