早期减少呼吸和解偶联事件独立于细胞色素c释放在PC12细胞发生凋亡

文摘

细胞色素c是一个mitochondria-mediated细胞凋亡的关键分子。它也在细胞呼吸作用中起着举足轻重的作用。这两个函数之间的切换发生在从线粒体释放的时刻。因此,这个过程是极为相关的细胞的命运。因为细胞色素c调节呼吸,我们研究了呼吸链活动的变化在细胞凋亡的早期阶段,以有助于解开细胞色素的机制c释放。我们发现,在staurosporine (STS)诱导PC12细胞凋亡,细胞色素的释放之前呼吸的影响c如图所示,减少内源性非耦合呼吸和一个分开的事件,都独立于细胞色素发生c释放。非耦合呼吸下降也发生在bcl - 2超表达(抑制细胞色素c释放),而解偶联事件被bcl - 2。我们还观察到第一阶段的核凝结在STS-induced凋亡并不依赖于细胞色素的释放c胞质和是一个reversibile事件。这些发现可能有助于理解机制影响线粒体在细胞凋亡的早期阶段和启动apoptogenic因素的释放。

1。介绍

线粒体在细胞凋亡中发挥关键作用引发了各种各样的刺激,因为他们发布重要proapoptotic膜间隙的因素。第一个线粒体apoptogenic分子发现hemoprotein细胞色素(1]。细胞色素涉及两个关键细胞过程。通常,它作为移动电子运营商之间电子穿梭泛醌细胞色素氧化还原酶(复杂III)和细胞色素氧化酶(IV)复杂的呼吸链允许细胞的生活。另一方面,在凋亡诱导细胞色素从线粒体释放细胞溶质,它执行一个proapoptotic函数绑定适配器蛋白质细胞凋亡protease-activating因子- 1 (Apaf1)。因此,它促进ATP / dATP, apoptosome multiproteic的组装复杂,结合并激活caspase-9,从而启动激活半胱天冬酶的级联导致凋亡细胞死亡(2,3]。

线粒体外膜透化作用(MOMP)和细胞色素从线粒体释放细胞凋亡过程中严格监管的蛋白bcl - 2家族。这个家庭的蛋白质包括凋亡成员(例如,bcl - 2和Bcl-XL)抑制MOMP和释放apoptogenic因素从线粒体和促进MOMP pro-apoptotic成员(如伯灵顿和贝克,报价)(4,5]。然而,细胞色素的详细机制释放仍不清楚。

磷脂双磷脂酰甘油(CL)似乎有关键作用的过程中细胞色素释放(6]。只有15%的细胞色素膜间隙是免费的,而大多数是附加到外层膜的线粒体内膜mitochondrion-specific阴离子磷脂CL。最近发现转译后的修改或交互与疏水性阴离子如CL引起细胞色素的激活与选择性催化能力对CL(过氧化物酶7,8]。细胞色素紧密地绑定到CL提出了具有过氧化物酶活性和催化CL过氧化反应,最有可能利用的高生产活性氧(ROS)生成的细胞凋亡的线粒体在第一阶段。细胞色素peroxidized CL亲和力较低,CL的过氧化作用使细胞色素的分离从线粒体内膜允许释放细胞色素从线粒体。氯氧化确实是强制释放细胞色素(6]。然而,细胞色素的最终版本需要额外的步骤,如外膜的透化作用。CL还参与线粒体外膜透化作用,因为它使对接和激活一些pro-apoptotic bcl - 2蛋白(9- - - - - -11]。

这些发现强烈建议一个积极作用调节膜的MOMP迄今被低估了。细胞色素的呼吸链复合体的一部分位于线粒体内膜,和膜完整性会极大地影响细胞的呼吸活动。基于这种考虑,我们分析了呼吸变化在细胞凋亡及其时间和释放细胞色素的关系为了得到一些有用的信息,解开这个hemoprotein从线粒体的释放机制。因此,我们分析了老鼠细胞的呼吸活动的神经元推导(pheochromocytoma-12 PC12细胞)极谱测定耗氧量的完整细胞(12]。PC12行最初从移植克隆鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤。这个细胞株体现sympathicoblasts的许多特征,细胞产生postmitotic交感神经元。事实上,他们对神经生长因子(神经生长因子)通过转向nonproliferating neurite-bearing表型和获得的许多属性交感神经元其中电兴奋性的特征。因此克隆PC12细胞系是广泛用于各种神经细胞分化和功能的研究。staurosporine - (STS)诱导细胞凋亡在天真的PC12细胞中,我们观察到细胞色素的解偶联事件前减少氧化酶(COX)呼吸活动。我们的调查也显示不同的动力学下降2,4-dinitrophenol——(DNP)非耦合和COX-dependent呼吸前显示,在早期阶段,一个动力学下降速度要快于后者。这表明一个STS对呼吸活动的影响,这是独立于细胞色素释放。证实了这个假设是我们发现的bcl - 2保护过度释放细胞色素在呼吸和大量减少,而它没有影响早期减少DNP-uncoupled STS引起的呼吸。

2。结果

2.1。测量呼吸的完整STS-Treated PC12细胞早期减少DNP-Uncoupled呼吸

由于细胞色素是呼吸链的一部分作为复杂的电子供体IV,预计其释放线粒体在细胞凋亡会导致细胞的呼吸活动的变化。我们分析这些变化的性质和程度通过测量在天真的PC12细胞耗氧量和天真的PC12细胞发生细胞凋亡的蛋白激酶抑制剂治疗STS (13,14]。

我们测量细胞的耗氧量(内源呼吸)的耗氧量的解偶联剂DNP (DNP-uncoupled呼吸代表细胞内源呼吸率最高可以达到自由控制的质子梯度)和呼吸率测量中存在的复杂三世抑制剂抗霉素A,人工membrane-permeant捐赠者TMPD (N, N, N′, N′-tetramthyl-1, 4-phenylendiamine),和维护的还原剂抗坏血酸盐TMPD减少状态(TMPD-dependent呼吸)12]。由于抗霉素抑制复杂三世和块电子通量的上游考克斯TMPD-dependent呼吸提供了一个测量的考克斯和细胞色素端依赖耗氧量独立呼吸链的上游段(15]。呼吸治疗和STS-treated PC12细胞造成100%抗霉素敏感(数据没有显示)。在STS我们观察到治疗时间减少内生,DNP-uncoupled和TMPD-dependent呼吸率。5人力资源与STS的治疗后,DNP-uncoupled呼吸率下降到~ DNP-uncoupled呼吸率的45%未经处理的细胞和~ 28日,9小时的治疗后8%(数据1(一)和2 (b))。STS的耗氧量相对于长期治疗(9 h和24 h)是高估了,因为很轻,很难收集所有死亡细胞与通常的离心速度;和不明智的使用更高的速度,因为它会影响活细胞的呼吸。

期间考克斯TMPD-dependent呼吸率下降的动力学STS-treatment类似于减少内源性的动力学和DNP-uncoupled呼吸率。但是,非常有趣的是,通过专注于最初几个小时的治疗,我们观察到,DNP-uncoupled呼吸速率明显下降速度比COX-dependent呼吸率降低。事实上,经过1小时的针治疗,TMPD-dependent呼吸速率下降只有4%相对于未经处理的细胞,而DNP-uncoupled呼吸率下降了15%(图1 (b))。这种差异与增加STS-treatment时间保持不变。自从COX-dependent呼吸直接取决于细胞色素并减少小于整体解耦合的呼吸,这意味着非耦合影响呼吸比缺乏细胞色素的其他修改。这个发现表明因此有损伤的线粒体呼吸凋亡诱导后不久,不是由于细胞色素的释放。

2.2。时间相关性呼吸变化,细胞色素释放和核分裂期间STS-Induced细胞凋亡;非耦合呼吸下降先于细胞色素释放

为了更好地理解呼吸和细胞色素减少之间的时间相关在STS-induced凋亡细胞色素进行分析通过共聚焦免疫荧光显微镜定位。2嗯STS-treatment促进PC12细胞的核分裂(图2(一个)STS 3 h;白色箭头)和细胞色素从线粒体释放明确的不同immunolocalization引起线粒体标记Hsp60及细胞色素(图2(一个)STS 3 h;黄色箭头)。细胞死亡是由DAPI染色法检测和细胞核形态分析。图2(一个)(白色箭头)显示了一个示例认为细胞凋亡;缩小和支离破碎的细胞核。通过分析几个字段,我们计算的百分比显示细胞色素细胞释放和核分裂细胞的百分比显示在每个时间点(细胞死亡)为了比较这些动力学与呼吸的变化。因为细胞色素从线粒体释放细胞凋亡在核分裂期间,我们发现细胞的细胞色素从线粒体释放而细胞核还没有支离破碎(图2(一个)STS 3 h;黄色箭头)但从未相反。由于这个原因,我们获得了细胞色素动力学释放动力学的快速略高于核碎片(图2 (b))。值得注意的是,一旦从线粒体释放,细胞色素在细胞的,有时报道(16,17),成核(图2(一个)STS 3 h;黄色箭头)。

在免疫荧光染色,大量的晚期凋亡细胞脱离这道菜,失去了这意味着我们运行的风险低估自己的号码。为了解决这个问题我们计算凋亡细胞的比例通过收集所有的他们,也来自上层清液,通过高速离心和DAPI染色所有核。细胞死亡的百分比计算的区别通过免疫荧光的一道菜和一个高速离心获得的被用来纠正低估了细胞色素的比例评估通过释放细胞免疫荧光染色;死细胞分离实验期间的最后阶段的细胞凋亡和细胞色素已经释放(18]。

我们比较这些动力学与呼吸报道在图的变化1为此,我们表示数据如图2 (b)与线粒体的细胞比例本地化细胞色素和活细胞比例(图2 (c))。我们观察到,逐步降低呼吸速率在STS治疗高度与活细胞的数量减少由于凋亡的死亡。有趣的是,与线粒体细胞色素细胞的减少定位高度关联的动力学COX-respiration下降,但这种下降低于观察DNP-respiration(图2 (c))。这样的分析加强结论TMPD-dependent呼吸的减少主要是由于细胞色素释放,减少DNP-uncoupled呼吸先于细胞色素释放和必须是由于另一个呼吸链系统的损伤机制。

2.3。呼吸率、细胞色素本地化和核DNP-Dependent bcl - 2转染细胞呼吸的变化也发生在缺乏细胞色素释放

确认早期呼吸期间观察到细胞凋亡的变化真的是独立于细胞色素释放,我们决定研究PC12细胞的呼吸稳定overexpressing凋亡抑制剂bcl - 2 (PC12-Bcl-2细胞),这是众所周知的,阻止细胞色素的释放从线粒体19,20.]。事实上,PC12-Bcl-2细胞治疗2嗯STS不脱离这道菜,不接受DAPI染色的细胞凋亡如图所示(数字3(一个)和3 (b)核)。此外,细胞色素的释放从线粒体受到抑制。实际上,也经过长时间的暴露在STS,细胞色素和Hsp60保持同样的本地化PC12-Bcl-2细胞(数字3(一个)和3 (b))。

这些细胞的呼吸作用(图的分析4(一)bcl - 2)表明,坚决防止长期呼吸减少。事实上,经过24小时的治疗非耦合内源呼吸速率的降低44.5% ~未经处理的细胞在缺乏bcl - 2,在STS治疗,呼吸~ 16%的未经处理的细胞的速度减少(甚至不认为过高的引用)(图1(一))。COX-dependent呼吸的观察到的差异更大;事实上,治疗24小时后,PC12-Bcl-2细胞呼吸减少~ 70.7%未经处理的细胞率,而COX-dependent天真的PC12细胞耗氧量下降~ 19.8%的控制。呼吸道的保护活动bcl - 2主要是由于这一事实bcl - 2块释放细胞色素从线粒体(数据3(一个)和3 (b))。DNP-dependent呼吸减少早期,我们发现在第一个小时的细胞凋亡也发生在Bcl-2-overexpressing细胞,但细胞色素不是释放。事实上,1 h (STS)治疗后,在PC12-Bcl-2和天真的PC12细胞,DNP-uncoupled呼吸减少~ 84.6%的未经处理的细胞的呼吸率,和COX-dependent呼吸减少~ 96%未经处理的细胞呼吸。经过两个小时的针治疗,非耦合内源呼吸落在~ 72% ~ 74%的控制PC12-Bcl-2和天真的PC12细胞,分别,而TMPD-dependent呼吸达到86%的天真的PC12细胞的控制仍然几乎不变PC12-Bcl-2细胞(92%)(数据1和4)。

因为在PC12-Bcl-2细胞细胞色素不是从线粒体释放,这个实验证实,在第一阶段的细胞凋亡,细胞减少的最大可能的呼吸速率实现的独立呼吸链受损细胞色素的释放吗。

此外,比较天真的PC12和PC12细胞的呼吸overexpressing bcl - 2之间的比率也表明DNP-uncoupled的绝对值和内源呼吸(DNP /结束)后立即在PC12细胞中减少针治疗,同时,在细胞overexpressing bcl - 2保持不变(图5)。这表明早期解偶联呼吸事件由STS bcl - 2所阻止。

DNP-dependent呼吸是分道扬镳ATP的合成,因为它发生在有耗散的质子梯度不能用于合成ATP提供能量。在这种情况下,氧气的消耗是最高的,因为它是免费的控制通过质子梯度和ATP的合成。因此DNP-dependent呼吸率高于正常内源呼吸因为它是呼吸链的最大速率可以实现的。因为这个原因觉得中国比DNP-dependent呼吸和内源呼吸(DNP /结束)高于1。如果DNP和结束之间的比率减少,这意味着细胞内源呼吸往往成为非耦合。PC12-Bcl2细胞的比率保持不变这意味着没有分开,而在PC12细胞中这个比例下降,这表明早期解偶联事件(图5)。

2.4。呼吸变化和细胞色素在STS-Treated PC12细胞还存在不依赖于,做只依赖STS的凋亡作用

为了定义是否减少呼吸,在STS的治疗下,半胱天冬酶依赖我们PC12细胞预处理与广谱半胱天冬酶抑制剂z-Val-Ala-Asp ch(当地)₂STS孵化前F (z-VADfmk)。而z-VADfmk块细胞凋亡也经过24小时的STS治疗(图2(一个)zVAD-STS 6 h,核形态),它并不影响呼吸率的降低程度(数字6(一)和6 (b))。事实上,减少内源性DNP-uncoupled COX-dependent呼吸在STS治疗完全比得上呼吸率以PC12幼稚细胞发生细胞凋亡(数字1 (b))。活动还确实是不需要线粒体释放细胞色素在STS-induced细胞死亡21]。事实上,分析细胞色素的本地化通过共聚焦免疫荧光的几个小时后凋亡诱导显示了一个逐步释放细胞色素不受zVADfmk预处理(图2(一个)zVAD-STS 6 h,箭头)。

排除的可能性减少呼吸活动我们发现在早期细胞凋亡的第一阶段是由于STS的仅仅是蛋白激酶抑制活性,与它的凋亡诱导没有任何关系,我们测试了bisindolylmaleimide-I (Bis-I),一个STS-analog没有凋亡功能的蛋白激酶抑制剂(22,23]。PC12细胞的治疗与Bis-I表明这种药物并不诱导细胞凋亡(数据未显示),不抑制呼吸的细胞(图6 (c))。缺乏呼吸变化的细胞治疗Bis-I证实,减少呼吸和呼吸的解偶联由STS与它的凋亡诱导作用。

2.5。细胞色素独立和可逆的核凝结引起的针

正如之前提到的,STS-treated PC12-Bcl-2不要死亡,不要展示典型凋亡细胞的核分裂也长期治疗后(数据3(一个)和3 (b))。然而,尽管没有分裂的情况下,我们可以清楚地观察到一个强大的染色质缩合(图3(一个)),这非常类似于凝结的第一阶段观察到STS-treated PC12细胞和前碎片(图2(一个)STS 3 h,核黄箭头)。STS-treated PC12-Bcl-2细胞轴承这种强大的核凝结(图3(一个)因为他们呼吸(图)是活着4),但不复制(图3 (c));他们不会死但保持静止状态。事实上,当STS通过改变介质,删除所有核恢复正常外观和细胞又开始复制(图3 (d))。我们得出这样的结论:第一阶段核修改STS-induced凋亡并不依赖于细胞色素释放和不是凋亡级联的只能进不能退的地步。

3所示。讨论

整体减少呼吸期间我们发现STS PC12细胞的治疗能明显与细胞色素的释放。然而,我们还发现非耦合的一个障碍呼吸之前发生在第一阶段STS-induced细胞凋亡和细胞色素的释放。这种现象也在143 b细胞(24),而在anti-Fas antibody-treated Jurkat细胞,TMPD-dependent和内源呼吸几乎同时发生和细胞色素从线粒体释放15]。这种差异在一系列事件可能依赖于不同的通路发生在Fas和STS-induced细胞凋亡。

关于早期呼吸障碍的原因独立于细胞色素版本中,我们假设一个修改的线粒体内膜的完整性可能会出席磷脂CL的水平。事实上,CL与线粒体生物能量学机械有着密切的联系,也是积极参与细胞色素的释放。它也证明了修改CL和细胞色素之间的绑定以及CL和bcl - 2蛋白之间的绑定之前和' MOMP线粒体和细胞色素释放(8]。CL是至关重要的维持线粒体内膜的完整性和功能的最佳活动所需,大部分的呼吸链复合物。由于这些原因,CL的修改(例如,过氧化ROS和细胞色素过氧化物酶活动或tBid绑定或重新分配内部和之间的膜)立即导致结构性变化的线粒体内膜破坏线粒体和影响嵌入式呼吸链复合物膜的活动(6]。这将影响呼吸作用独立于细胞色素我们发现,释放。CL的过氧化反应发生后各种凋亡刺激也包括针。所有这些原因我们假设早期呼吸观察到的变化可能是由于线粒体膜的扰动CL的水平。

我们的分析还表明,细胞凋亡的第一阶段的特点是早期解偶联事件。事实上,在第一个小时的STS PC12细胞治疗,绝对DNP-uncoupled之间的比例和内生的耗氧量减少(图5),表明内生和DNP-uncoupled呼吸降低率(图之间的区别1)。这个解偶联事件发生1 h (STS)治疗后当TMPD呼吸略受影响,并因此可能独立于细胞色素释放。然而,过度的解偶联被bcl - 2(数据4和5)。因此,bcl - 2不防止早期减少呼吸引起的STS(图4),但可以防止呼吸的解偶联,这可能是一步后的最大呼吸速率的减少,最终导致细胞色素释放。我们建议的解偶联呼吸作用可能与细胞色素的一步发布过程涉及蛋白质的bcl - 2家族。有趣的是,解偶联引起的呼吸也已知CL修改,支持我们的假设的CL早目标线粒体凋亡变化。

我们的实验,此外,显示一个强烈程度的核凝结(从未达到分裂)发生在缺乏细胞色素释放(图3(一个))。这部分可能染色质凝结核的第一步修改最终导致分裂,并据报道涉及DNA双链断裂(25,26]。我们评估,在天真的PC12细胞,早期核凝结发生在Bcl2-overexpressing细胞是可逆的,它不是凋亡通路中的只能进不能退的地步(数字3 (c)和3 (d))。这证实了这一发现,MOMP抑制剂允许细胞preapoptotic修复他们的DNA和染色质凝结回到一个正常的核形态(26]。

最后,我们观察到细胞色素重新核内线粒体定位诱导细胞凋亡后,一旦失去了,长针治疗后,之前报道(27),最后退化(图2(一个)zVAD-STS 6 h,白色箭头)。没有细胞与细胞色素本地化只可检测到细胞溶质。这意味着核细胞色素的本地化快,实际上它不仅发生在细胞核染色质时也支离破碎没有支离破碎或凝结在非常早期的阶段(图2(一个),黄色箭头)。这个核细胞色素积累是zVAD-independent(图2(一个),zVAD-STS 6 h)。

总之,我们发现线粒体生物能学摄动之前,独立于细胞色素的释放在细胞凋亡。这一发现可能揭示的机制导致细胞色素的释放。事实上,考虑到生物能疗法和细胞凋亡之间存在相互依赖关系28),他们的coinvestigation强烈需要全面的方法。

4所示。材料和方法

4.1。细胞系和文化条件

PC12细胞培养在37°C公司5%₂气氛F-12 K L-glutammine (GIBCO)中补充了2毫米,1、5 g / L碳酸氢钠,15%马血清,2.5%胎牛血清的边后卫,和penicillin-streptomycin。细胞凋亡诱导,被播种在2×10⁵涂有20 /毫升为组织培养盘子μg / mL poly-L-lysine (Sigma-Aldrich)。两天中被取代后,经过2小时2μM STS (Sigma-Aldrich)在DMSO补充道。100嗯z-VADfmk (Kamiya生化特性)添加了STS前30分钟。从Calbiochem Bisindolylmaleimide GF 109203 x是购买。

4.2。量化的细胞凋亡

细胞凋亡是评估核形态。在不同的时间点在STS治疗,细胞漂浮在介质和细胞附着这道菜被离心收集,用PBS,固定在4%多聚甲醛(PFA),沾染了1μg / mL的荧光双链dna结合蛋白染料4,6-diamidino-2-2phenylindol (DAPI Sigma-Aldrich) 8分钟。一滴这准备幻灯片通过荧光显微镜进行了分析。包含均匀染色细胞大核染色质被算作活细胞,而细胞含有分散核和/或致密的核算为死细胞。价值观从40 - 50领域获得的1 - 2张幻灯片总数约1000个细胞/实验。每个实验重复6 - 7次,类似的结果。

4.3。转染

bcl - 2人α互补脱氧核糖核酸(19从SFFV-Bcl-2 n1)是subcloned到新霉素抗性marker-containing质粒pcDEF3 [29日]EF-1a启动子的控制下,然后用于通过电穿孔转染PC12细胞。指数增长的PC12细胞(10⁷)resuspended在0.8毫升的PBS,混合着18毫克的Bcl-2-pcDEF3 pGL1 5毫克,在冰上和孵化了10分钟。电穿孔是执行BioRad基因脉冲发生器通过设置960 mF和300 V。细胞然后孵化冰上10分钟和镀F12-K介质与15%马血清和2.5%的边后卫补充胶原蛋白涂层菜(BIOCOAT)。48 h后稳定转染子overexpressing bcl - 2 (PC12-Bcl-2细胞)选择使用0.3毫克毫升G418 (Geneticin;英杰公司)为2周。

4.4。测量完整细胞的呼吸率

PC12细胞悬浮在TD缓冲区(137毫米氯化钠,氯化钾5毫米,0.7毫米Na₂HPO₄25毫米Tris-HCl pH值7.4,25°C)在3×10⁶细胞/毫升,呼吸速率测定的oxygraph(黄色Spring仪器、模型5300)。相同的测量评估后的40岁μM DNP或者DNP和20 nM抗霉素A (Sigma-Aldrich)或DNP,抗霉素A, 400年μM TMPD(丙烯酰胺)和10毫米抗坏血酸盐(Sigma-Aldrich)所描述的12]。耗氧率表达nanomoles每分钟消耗的氧和细胞蛋白(nmolO毫克₂/分钟/毫克)由布拉德福德过程(BioRad)和未经处理的PC12细胞呼吸的百分比。耗氧速率测量细胞的存在,DNP,抗霉素A,抗坏血酸盐,TMPD纠正了减法的耗氧速率的自氧化抗坏血酸盐/ TMPD缺乏细胞(15]。

4.5。免疫荧光共聚焦显微镜

细胞培养在collagen-coated菜肴的浓度为5×10⁵细胞/毫升。2天后细胞处理STS,然后用PBS,固定在4% PFA在RT PBS 10分钟,水洗,permeabilized PBS包含0,4% Triton x - 100 5分钟,洗再次与PBS。与PBS阻断细胞后含有2%马血清(HS-PBS) 30分钟,与鼠标anticytochrome他们孵化单克隆抗体6 h2。B4 (BD Pharmingen)稀释1:300年HS-PBS和兔anti-Hsp60抗血清(StressGene)稀释1:200 1 h在37°C调湿室。3洗后HS-PBS(5分钟),这些细胞被孵化与FITC共轭山羊anti-mouse免疫球蛋白(杰克逊ImmunoResearch实验室)稀释1:200年,丽丝胺若丹明共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(杰克逊ImmunoResearch实验室)稀释1:200 1小时在室温下。标本被洗3分钟HS-PBS和孵化SYTOX绿色(分子探针)25 nM在室温下15分钟。细胞被洗3次(每5分钟)在PBS,安装在Fluoroguard不变色试剂(BioRad),并分析了蔡司510激光扫描显微镜。

4.6。免疫印迹分析

分析了相同数量的细胞溶解产物15% sds - page。蛋白质被转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜(BioRad)和膜治疗1 h和屏蔽解决方案(NaN3渐变20 0.02%,0.02%,5%脱脂牛奶在PBS)在室温下。膜培养4 h在4°C鼠标anti-Bcl-2单克隆抗体(sc - 7382)(圣克鲁斯生物技术)稀释1:1000年屏蔽解决方案。当时在PBS洗3次(10分钟)和1时间和清洗解决方案(150毫米氯化钠,50毫米Tris-HCl pH值7.5),然后孵化1 h RT与羊anti-mouse免疫球蛋白peroxidase-linked (Amersham)稀释1:2000年清洗解决方案包含5%的脱脂奶粉。最后膜洗5次洗涤溶液中(10分钟)和特定的蛋白复合物被确定使用超级信号西方PICO化学发光试剂(皮尔斯生物技术)通过放射自显影法。

确认

作者感谢朱塞佩•Attardi教授的实验室完成这项工作。他们也感谢段Shili博士和安妮Chomyn bcl - 2克隆和乔迪Asin-Cayuela博士和博士的人讨论希腊的帮助。本文是由美国国立卫生研究院的资助支持通用汽车- 11726 (Giuseppe Attardi)和Levi-Montalcini基金会奖学金(e·费拉罗)。

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