抑制的Anandamide 6-Hydroxydopamine-Induced在PC12细胞中细胞死亡

文摘

6-hydroxydopamine (6-OHDA)是一种选择性的神经毒素,被广泛用于研究细胞死亡和帕金森病的保护性策略模型。在这里,我们调查了内源性大麻素的影响,anandamide 6-OHDA-induced毒性在鼠肾上腺phaeochromocytoma PC12细胞。形态分析和caspase-3活动试验显示,叫花生四烯酸乙醇胺抑制6-OHDA-induced细胞凋亡。保护不受大麻素受体拮抗剂(或)或草酸TRPV1受体。与LY294002 Anandamide-dependent保护降低了预处理(抑制剂的磷脂酰肌醇3-kinase, PI3K)和影响U0126 (extracellularly-regulated激酶抑制剂)。有趣的是,c-Jun-NH2-terminal激酶的磷酸化(物)的细胞暴露于6-OHDA强烈减少叫花生四烯酸乙醇胺预处理。此外,6-OHDA诱导c-Jun激活和Bim表达增加,这两个被anandamide抑制。在一起,这些数据表明anandamide凋亡的影响,也表明角色PI3K的激活和抑制物在anandamide-mediated防范6-OHDA信号。

1。介绍

近年来,内源性大麻素系统(神经)已成为一个潜在的治疗目标治疗帕金森病(1- - - - - -5]。这些研究表明,大麻素药物的潜在疗效可能包括黑多巴胺能神经元的神经保护。这是特别感兴趣的,因为神经保护治疗帕金森病明显缺乏,和目前的治疗通常dopamine-enhancing策略,停止和延迟持续的神经退化。叫花生四烯酸乙醇胺(也称为arachidonylethanolamide),是第一个神经被发现,来自花生四烯酸,发现主要在大脑组织6]。Anandamide绑定并激活大麻素受体(和)和草酸受体,TRPV1 [7,8]。

越来越多的证据支持一个角色叫花生四烯酸乙醇胺在细胞命运的调制,包括细胞死亡和生存。叫花生四烯酸乙醇胺可以保护神经元免受有毒等侮辱glutamatergic会,营养不足,缺氧和缺血9- - - - - -12]。这些保护作用的anandamide已报告是由和大麻素受体,而激活TRPV1的建议调解anandamide-induced细胞凋亡在大鼠C6胶质瘤细胞,人类DAUDI白血病细胞,宫颈癌细胞系(13- - - - - -15]。

本研究进行检查的能力叫花生四烯酸乙醇胺保护PC12细胞免受6-hydroxydopamine (6-OHDA)毒性。6-OHDA是多巴胺的羟化模拟中常用的模型系统模拟帕金森病(16,17]。6-OHDA初级中脑多巴胺神经元凋亡[18,19],MN9D [20.和多巴胺能包括PC12细胞系17,21,22]。细胞凋亡是一个高度调控的细胞死亡形式,在生理和病理条件下发生。它是由细胞收缩和形态学特征核凝结。这些变化是由激活半胱天冬酶蛋白酶,这对于6-OHDA发生由于释放细胞色素c从线粒体22]。

我们检查效果的anandamide 6-OHDA-induced在PC12细胞毒性。特别是,对6-OHDA anandamide行动的机制是通过检查测试可能的信号通路的作用,这是众所周知的参与调节细胞的命运,包括phoshpatidylinositol 3-kinase PI3K / Akt,有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK) /细胞外signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2)和c-Jun-NH2-terminal激酶(物)/ c-Jun通路。

2。实验程序

2.1。材料

老鼠phaeochromocytoma PC12细胞从欧洲获得细胞培养(ECACC)的集合。所有化学品都由Sigma-Aldrich除非另有规定。叫花生四烯酸乙醇胺和SB366791 Tocris生物科学。SR141716A SR144528来自NIMH化学合成和药物供应计划。U0126 SP600125 Calbiochem提供的。兔多克隆抗体与Bim StressGen生物技术。对p-JNK鼠单克隆抗体,抗体和兔兔多克隆anti-caspase-3单克隆抗体p-ERK1/2得到从细胞信号技术。鼠单克隆抗体p-c-Jun来自圣克鲁斯生物技术。从Sigma-Aldrich Anti-Actin兔多克隆抗体。山羊二级抗体结合辣根过氧化物酶来自皮尔斯。 Ac-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-methyl-coumaryl-7-amide) (DEVD-MCA) was from the Peptide Institute, Osaka, Japan. Protein molecular weight marker was obtained from New England Biolabs.

2.2。细胞培养和治疗

大鼠肾上腺phaeochromocytoma PC12细胞在DMEM培养补充10%马血清,5%胎牛血清,50 U /毫升青霉素和50μg / ml链霉素,C调湿的气氛。实验,细胞被播种密度细胞/厘米²板涂有10μ克/毫升poly-L-lysine。细胞被左前一夜之间开始实验治疗。股票的解决方案6-OHDA是新鲜的焦亚硫酸钠在每个实验之前(1米)。除非另有说明,否则PC12细胞孵化与25M anandamide 24小时治疗100紧随其后M 6-OHDA进一步分析前24小时。

2.3。细胞生存和增殖试验

细胞生存肝癌和决心通过比色(3 - (4 5-dimethylthiazolyl-2) 2, 5-diphenyltetrazoliumbromide)四唑盐试验(23]。PC12细胞被镀成96 -孔板细胞/在100l的媒介。麻省理工四唑盐溶解在汉克的平衡盐溶液的浓度5毫克/毫升。实验治疗后,10l MTT添加到文化的3个小时c .停止反应,溶解甲瓒晶体100l 20% SDS 50%二甲基甲酰胺添加和吸光度测量在550 nm Wallac 1420 plate-reader参考波长650 nm。细胞生存能力表示为百分比的控制文化。

2.4。DAPI染色的核

在PBS和3.7%多聚甲醛固定细胞被洗在室温下10分钟。核是沾6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)和放置在安装介质(Vectashield,向量,伯林盖姆,CA)。5l整除的细胞悬浮液应用于玻璃幻灯片。细胞发生细胞凋亡的形态学改变染色质被荧光显微镜分析(励磁350 nm和发射在460海里)。细胞中通过计算从每个样本至少300个细胞。

2.5。DEVDase活动分析

caspase-3-like酶的活性(DEVDases)决心fluorometrically先前报道(24与一些修改()22,25]。简单地说,细胞和旋转刮掉下来在C 5分钟。球洗在冰冷的磷酸盐(PBS)和旋转下去10秒钟。球团矿re-suspended在25l PBS和snap-frozen液氮。50M DEVDase-substrate (DEVD-MCA)反应缓冲区(100毫米N-2-hydroxyethyl-piperazine-N-2-ethanesulphonic酸(玫瑰)pH值7.5,10%蔗糖、0.1% 3 - [(3-cholamidopropyl) -dimethylammonio] 1-propanesulfonate(家伙),5毫米二硫苏糖醇(德勤),% Nonidet-P-40)被添加进溶解产物,释放自由AMC的监控C每隔60秒在30分钟内使用Wallac维克多multilabel计数器(励磁355海里,发射460海里)。荧光被转换为单位公布的AMC nanomoles使用标准曲线生成自由AMC和随后与蛋白质浓度有关。

2.6。整个细胞提取物的制备

实验治疗后细胞从培养瓶和离心机在刮5分钟c .洗后在PBS细胞细胞溶解使用完整的细胞裂解缓冲(20毫米消息灵通的pH值7.5,350毫米氯化钠,1毫米EDTA, 0.5毫米,0.1毫米EGTA, 1%诺乃清洁剂p 40, 0.5毫米德勤,0.1% phenylmethylsulphonyl氟化物(PMSF), 1%抑肽酶,氟化钠5毫米,1毫米)。细胞碎片是在1分钟和上层清液被确定使用布拉德福德试剂的蛋白质含量与牛血清白蛋白(BSA)作为标准。

2.7。西方墨点法

40g蛋白的变性使用Laemmli的样品缓冲(62毫米Tris-HCl, pH值6.8,2%钠十二烷基硫酸盐(SDS), 5%巯基乙醇、4%甘油、1毫米PMSF 0.01%溴酚蓝)和煮熟C 5分钟。蛋白质是由10% - -15% sds - page分离和electrophoretically转移到硝化纤维膜。膜被封锁在PBS 1小时含0.05%渐变20到5% (w / v)脱脂奶粉。探讨了膜抗体(1:1000)在一夜之间并采取适当的辣根C peroxidise-conjugated山羊二级抗体在1:10000(或2000 1:检测caspase-3)在室温下2小时。蛋白质乐队使用Supersignal西pico可视化系统(皮尔斯)。

2.8。统计分析

值表示为±SEM手段3个独立的实验中,除非另有指示。执行统计分析使用重复测量方差分析后跟Bonferroni多重比较事后水平的测试,被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。对6-OHDA Anandamide预处理保护PC12细胞毒性

我们曾表明6-OHDA引起浓度诱导PC12细胞凋亡的22]。为了检查的影响对6-OHDA anandamide, PC12细胞孵化与25M anandamide 24小时接触100紧随其后M 6-OHDA进一步24小时。可视化的核形态DAPI染色表明,预处理anandamide抑制6-OHDA-induced的PC12细胞凋亡(图1(一))。细胞死亡的水平由于6-OHDA和事先叫花生四烯酸乙醇胺治疗量化并表示细胞的总数的比例。Anandamide减轻细胞损伤和减少细胞死亡的形态学表现来(图1 (b))。

下一个叫花生四烯酸乙醇胺的影响半胱天冬酶存在活动(DEVD-MCA乳沟活动)检查。与0-50 PC12细胞治疗M anandamide 24小时之前6-OHDA进一步治疗24小时。叫花生四烯酸乙醇胺浓度的方式有效地抑制DEVD-MCA-cleavage活动,造成约50%抑制10米叫花生四烯酸乙醇胺(图1 (c))。这是伴随着减少处理17 kDa pro-caspase-3进入活跃的形式,为西方墨点法探测到(图1 (d))。这些数据表明,叫花生四烯酸乙醇胺可以防止6-OHDA-induced细胞凋亡水平,或上游caspase-3激活。

3.2。是大麻素和草酸Receptor-Independent Anandamide-Mediated保护

为了确定的影响叫花生四烯酸乙醇胺受体介导,PC12细胞,表达受体([26),和我们自己的数据未显示)与选择性孵化或受体拮抗剂,SR141716A或SR144528分别治疗前25米叫花生四烯酸乙醇胺和6-OHDA。受体拮抗剂不抑制叫花生四烯酸乙醇胺的保护作用,表明没有也不受体参与anandamide保护6-OHDA毒性(数字2(一个)和2 (b))。应用拮抗剂的多余的浓度(25SR141716A M;20M SR144528)也没有反向保护(数字2(一个)和2 (b))。因为anandamide也活动在TRPV1草酸受体(8),因为这在PC12细胞中表达的受体26,27],TRPV1的影响选择性拮抗剂,SB366791, anandamide保护检查。SB366791没有影响的防护能力的anandamide反对6-OHDA-induced半胱天冬酶活动(图2 (c))。此外,所有的对手有任何影响6-OHDA-induced DEVDase活动没有叫花生四烯酸乙醇胺。大麻类,尤其是那些拥有酚醛戒指,已知发挥receptor-independent已经提出对细胞和神经保护效应的影响与大麻类的强有力的抗氧化性能28]。由于6-OHDA-induced细胞死亡可以由氧化应激(17,20.,29日),叫花生四烯酸乙醇胺的影响全身的细胞死亡是检查。Anandamide并没有阻止细胞死亡原因MTT比色作为生存分析(图3)。这表明anandamide-mediated保护6-OHDA不是其抗氧化能力的结果。

3.3。PI3K和ERK1/2信号通路参与Anandamide Prosurvival行动

Cannabinoid-dependent效果与几个相关信号转导途径包括激活磷脂酰肌醇3-kinase PI3K / Akt和增殖蛋白激酶(MAPK)信号通路,这两个都与prosurvival信号(30.- - - - - -32]。来洞察分子机制导致细胞生存,我们研究了这些信号通路的作用叫花生四烯酸乙醇胺的保护。抑制PI3K和40M LY294002发现加剧6-OHDA毒性(图4(一))。预处理与LY294002逆转anandamide-mediated保护,虽然不是没有叫花生四烯酸乙醇胺的水平,可能由于LY294002加强6-OHDA-induced毒性的影响。

评估可能的角色MEK / ERK信号anandamide-mediated保护,我们用免疫印迹检查anandamide ERK1/2的磷酸化状态的影响。处理PC12细胞25M anandamide导致瞬态增加ERK1/2磷酸化6小时,回到了基底的水平(图24小时4 (b))。药物抑制ERK激活10M U0126部分逆转的anandamide DEVDase活动的影响,但没有统计学意义(图4 (c))。这表明ERK1/2磷酸化的增加不作出重大贡献anandamide-mediated保护。

3.4。叫花生四烯酸乙醇胺抑制物激活6-OHDA引起的

压力激酶物据报道调解6-OHDA-induced细胞死亡(20.,33]。因此,我们研究了影响的anandamide物激活通过检查的磷酸化状态JNK1 JNK2。与100年PC12细胞的治疗M 6-OHDA诱发时间增加JNK1磷酸化与最大激活后6小时(图5(一个))。有一个小的增加在随后JNK2磷酸化过程。前治疗anandamide导致显著抑制JNK1磷酸化(图5(一个))。这些发现表明,抑制物激活可能发挥重要作用在anandamide-dependent防止6-OHDA和协议与其他研究表明,抑制物活性对6-OHDA-induced保护PC12细胞凋亡(20.,33- - - - - -37]。

许多目标物与细胞死亡,包括c-Jun和BH3-only蛋白质Bim [38]。因此,叫花生四烯酸乙醇胺的影响在这些物目标是检查。6-OHDA造成c-Jun磷酸化的增加减少了叫花生四烯酸乙醇胺预处理(图5 (b))。pro-apoptotic bcl - 2家族的成员,也是一个目标物。细胞治疗与6-OHDA显著增加引起的12小时(图表达5 (b))。三个乐队观察与高分子量形式可能反映磷酸化物种,因为这种蛋白质是由磷酸化(39,40]。事实上,我们先前已经表明,这些上乐队代表磷酸化,因为他们消失在治疗与磷酸酶(完整的细胞溶解产物32]。预处理细胞的anandamide似乎没有影响的时间进程或水平的感应(图5 (b))。然而,有一个减少高分子量区间和增加强度的低分子量的乐队在24小时6-OHDA AEA治疗(图5 (b))。这些数据表明,有一个anandamide-induced减少的磷酸化,可能是由于物抑制。

为了证实一个角色6-OHDA毒性物活化,细胞预处理物抑制剂SP600125 (4M)。这抑制剂减少磷酸化的c-Jun 6-OHDA也造成了延迟和减少乳沟的caspase-3活跃p17片段(图5 (c))。在同样的实验中,25M anandamide造成完全抑制caspase-3解理而抑制c-Jun磷酸化,比SP600125但程度不一样。

4所示。讨论

这里我们提供的第一个证据直接保护作用的anandamide 6-OHDA毒性。Anandamide块6-OHDA-induced凋亡浓度的方式。这种保护是上游caspase-3激活自DEVDase活动有抑制和减少pro-caspase-3的处理。我们无法证明的作用,或TRPV1 anandamide保护。也没有涉及ERK1/2 prosurvival信号。然而,部分角色PI3K的激活和抑制物信号了。大麻类已被证明诱导和抑制诱导细胞死亡(看过的41])。据报道Anandamide本身有毒的(26)或无毒(42)对PC12细胞。在我们的研究中,叫花生四烯酸乙醇胺的浓度,并不是有毒甚至多达48小时的潜伏期(数据没有显示)。被其他人大麻素药物已被证明是保护在各种神经退化模型(9,41,43),包括神经细胞死亡在帕金森病模型28]。例如,非选择性合成大麻素受体激动剂HU210发现保护小脑颗粒神经元免受6-hydroxydopamine毒性(28]。此外,一个体内研究表明,植物的大麻类thc和大麻二酚保护老鼠黑多巴胺能通路从内侧前脑束注入儿茶酚胺类神经毒素6-hydroxydopamine [28]。虽然在活体内研究没有包括神经保护的直接评估,的能力thc或大麻二酚改善6-OHDA病变的影响对纹状体多巴胺浓度和酪氨酸羟化酶的活动。我们目前的数据与anandamide支持这些早期的发现。

可能代谢物的作用的anandamide监管PC12细胞命运的可能性不能排除。Anandamide保持酶的水解氨基乙醇和花生四烯酸(44]。事实上,这种退化已被证明是必要的prosurvival效应在小鼠神经母细胞瘤细胞的anandamide保护性活动对血清剥夺并不是通过介导的或TRPV1受体和需要一个细分的anandamide乙醇胺(9]。

据报道,诱导氧化应激参与6-OHDA-induced毒性和抗氧化剂可以防止过氧化氢和过氧化物anion-mediated细胞死亡(20.,33- - - - - -37,45- - - - - -47]。据我们所知,还没有被报道具有抗氧化活性。我们没有观察到anandamide-mediated保护PC12细胞的反对全身的死亡,这表明anandamide由于6-OHDA并不抑制氧化应激。然而,H₂O₂不是唯一的产物6-OHDA自动氧化。此外,超氧化物阴离子p醌,可能导致活性氧(ROS)的生产(48- - - - - -50),可以抑制叫花生四烯酸乙醇胺,从而阻塞物激活和磷酸化的下游目标。

大麻类已被证明PI3K / Akt激活和MEK / ERK信号通路(51,52]。虽然我们与药理抑制剂的结果并不支持MEK / ERK信号的作用叫花生四烯酸乙醇胺6-hydroxydopamine防护,他们支持一个参与PI3K / Akt prosurvival信号、自PI3K选择性抑制剂LY294002逆转anandamide 6-OHDA防护。此外,目前的数据也支持一个可能的作用抑制物激活anandamide保护,因为anandamide减少6-OHDA-induced物磷酸化和JNK-dependent pro-apoptotic信号,即磷酸化c-Jun和可能的。

物的增殖激活的蛋白激酶(MAPK)途径应对许多细胞外刺激和不同形式的环境压力(53]。我们的研究结果与最近的报告显示,一般协议6-OHDA诱导物(磷酸化36,54),物6-OHDA激活介导细胞凋亡诱导的PC12细胞(45,47,54]。此外,大量的研究表明保护通过各个代理商对6-OHDA神经毒性也显示相应抑制物激活(20.,33- - - - - -37]。我们观察到一个大6-OHDA-induced JNK1磷酸化,增加和轻微增加水平的磷酸化JNK2在3 - 6小时,伴随着phospho-c-Jun伴随增加和延迟增加的水平。此外,物抑制剂SP600125造成部分减少由于6-OHDA caspase-3乳沟。这是与anandamide完成抑制。这些发现与以前的报告显示,SP600125协议部分防止6-OHDA PC12细胞毒性(47]。综上所述,这些数据显示部分的贡献6-OHDA毒性物的信号,这叫花生四烯酸乙醇胺可能通过抑制调解一些保护作用的途径。

物在许多方面促进细胞凋亡。通过磷酸化和激活c-Jun刺激c-Jun目标基因的转录,包括荡妇(38]。此外,物磷酸化bcl - 2蛋白家族的某些成员,与线粒体凋亡通路相关,包括、Bmf和bcl - 2 (38,53]。例如,水平和功能受磷酸化ERK,物,可能是一种蛋白激酶(40,55]。的磷酸化在Ser65活性物强化pro-apoptotic活动(56]。这些数据支持一个有吸引力的假设anandamide防止6-OHDA水平,或上游物激活。这种抑制物的anandamide从而防止下游的激活凋亡通路,包括c-Jun激活和可能的磷酸化。然而,由于水平cytoprotection的anandamide远远大于由于SP600125,尽管类似物抑制,它强烈表明,anandamide利用额外的机制来抑制6-OHDA毒性。

它应该考虑与数据支持endocannabinoid-mediated物抑制,有其他报道的数据57- - - - - -59]表明大麻类诱导物活化,产生影响之前凋亡事件包括caspase-3激活和DNA碎片。因此,神经保护和神经毒性效应的大麻类可能取决于各种因素,包括有毒侮辱、大麻类剂量和性质(例如,内源性大麻素对phytocannabinoids),暴露和细胞类型(60,61年]。

这里,我们第一次证明叫花生四烯酸乙醇胺对6-OHDA-induced保护PC12细胞凋亡。这些数据和其他研究可能表明潜在的提升疗效anandamide甚至其他内源性大麻素在预防黑多巴胺能神经元的变性在帕金森病。

确认

作者感谢教授肯•麦基能提供我们受体抗体。这项工作是财务在爱尔兰科学研究委员会的支持下,工程和技术(一种开始奖学金公里)和爱尔兰科学基金会。

引用

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