BMP-4及其信号通路的作用在人类黑色素细胞培养

文摘

骨形态形成蛋白(BMP-4)被证明抑制杀菌作用,在某种程度上,通过减少酪氨酸酶的水平(Yaar节et al。(2006) JBC: 281]。这里给出的结果表明,BMP-4理气TRP-1的蛋白质含量,PKC -,MCI-R。当成对文化人类黑色素细胞处理车辆或BMP-4 (25 ng / ml), MAPK / ERK的磷酸化在一小时内BMP-4治疗。然后激活MAPK / ERK急性磷酸化MITF引起的,其次是proteosome-mediated MITF退化,melanogenic蛋白质的关键转录因子(吴et al。(2000)基因和发展:14)。然而,长期接触的黑色素细胞BMP-4(48小时)MITF-M转录水平下降引起的。此外,BMP-4降低细胞内的营地,的关键调节器MITF表达式。这些结果说明BMP-4暂时激活MAPK / ERK信号通路激活MITF;然而,慢性治疗BMP-4黑色素细胞引起MITF的表达下调,可能cAMP-dependent通路。

1。介绍

是骨形成蛋白(bmp) disulfide-linked二聚的蛋白质,产生大前体蛋白(综述(1])。每个位置可以进一步分为几个子组的氨基酸相似性。BMP-2和BMP-4 83%氨基酸序列的身份,是研究BMP的家人(了1])。BMP-2和4引起他们的生物行为首先绑定特定的细胞表面受体,称为二型受体(BMPR-II)和I型受体(BMPR I) (2- - - - - -6]。两种不同类型的BMPR-I,称为BMP IA型(BMPR-IA)和IB型(BMPR-IB),已确定(7- - - - - -9]。绑定BMP-2和BMP-4 BMPR-II促进了I型受体(4,6];和绑定BMP-2或4,BMPR-II随后激活I型受体(10]。激活BMPR-I磷酸化Smad-1 5或8 [11),然后新兵Smad-4,整个复杂的把原子核(12- - - - - -14)和与特定DNA序列共识激活或抑制靶基因的转录。激活BMPR-I还可以使磷酸化(激活)extracellular-signal调节激酶(ERK)通过有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和这个途径还可以与Smads-dependent相声通路(15,16]。

最近,据报道,BMP-4, TGF -的成员总科(了17]),负调节杀菌作用在一定程度上减少人工培养的黑色素细胞的酪氨酸酶的表达水平(18]。治疗与BMP-4鹌鹑神经嵴的文化导致黑素原生成一个戏剧性的减少(19]。此外,在转基因小鼠模型,过表达‘诺金’,已知的BMP-4生理抑制剂(20.),microphthalmia-associated转录因子的水平(MITF)和绑定促黑素细胞激素(-MSH)肾上腺皮质receptor-1 (MC1-R)增加,导致变黑外套的颜色(21]。

表皮黑色素的合成和分散在很大程度上是负责肤色以及保护免受日光引起的伤害。杀菌作用时发起氨基酸酪氨酸氧化二羟基苯丙氨酸和多巴奎宁的酶酪氨酸酶,杀菌作用的关键和病原反应酶(了22])。激活酪氨酸酶作为一种活性形式存在,当蛋白质kinace c -(PKC -)磷酸化酶的丝氨酸残基在胞质域(23]。酪氨酸酶的激活PKC -是黑素原生成所需的证明是体内(24和体外23,25- - - - - -27),而相反的活动和/或PKC的表达增加会导致色素沉着增加两种体外(28和体内29日]。

人类的杀菌作用是深受旁分泌和自分泌等因素-MSH [30.],endothelin-1 [31日],interleukin-1 [32],TNF -(32]。在这些因素中,-MSH和endothelin-1引起色素部分通过增加表达式和酪氨酸酶的活性30.,31日,33]。的表达式-MSH和endothelin-1检测表皮角化细胞和诱导角质细胞暴露于紫外线照射时(紫外线)31日,34]。Endothelin-1显示诱导黑素原生成通过激活多种信号通路,包括PKC-dependent通路(35]。色素细胞,-MSH首次绑定到其细胞表面受体MC1-R [36,37),一个heptahelical跨膜蛋白结合蛋白(38),从而增加了细胞内营水平(33]。营地增加色素的方法之一是通过增加MITF[的表达39),是一个关键的转录因子对melanogenic蛋白质,如酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白1 (TRP-1)和PKC -(40- - - - - -42]。

MITF是basic-helix-loop-helix (bHLH)和亮氨酸拉链转录因子结合在基因启动子元素守恒的共识,特别是M - (AGTCATGTGCT)和E - (CATGTG)箱43,调节酪氨酸酶的转录,TRP-1, TRP-2 [41),PKC -(40),和受体44]。MITF可以绑定为或异质二聚体与另一个相关的家庭成员(了45])。MITF组成一个家庭至少9亚型(46,47),MITF-M同种型控制酪氨酸酶和PKC -在黑色素细胞转录40,48,49]。MITF活动和稳定性受其磷酸化状态通过MAPK / ERK-dependent通路(50,51]。磷酸化,MITF结合M-box或E-box共识序列转录激活(51,52),但MITF磷酸化又减少了稳定和提高其在蛋白酶体降解[50,53]。因此,长期激活MAPK / ERK通路将导致MITF蛋白质水平的下调。最近,MITF被证明是一个关键的转录因子Rab27a [54),一种蛋白质重要的黑素体运输,Pmel17 [48),黑素体矩阵形成所需的一种蛋白质。因此,MITF在黑色素合成中起着核心作用,以及黑素体生物起源和运输。

虽然因素增加杀菌作用是众所周知的,生理的代理抑制杀菌作用知之甚少。最近,它已被证明,interleukin-16、TNF -人类黑色素细胞减少黑素原生成(32]。TGF -也减少色素沉着(55]。

在本文中,我们进一步描述的机制BMP-4-dependent信号通路下调杀菌作用。具体来说,调解的胞内信号通路的影响BMP-4及其目标基因/蛋白质是探索。

2。材料和方法

2.1。材料

重组人类BMP-4获得研发系统,Inc .,明尼阿波利斯、锰。杜尔贝科的修改基本培养基(DMEM),课时,不必要的氨基酸,谷氨酰胺,中199和胰蛋白酶从GIBCO购买/ BRL盖瑟斯堡,MD。重组基本成纤维细胞生长因子是购自Amgen Inc . CA,千橡市牛脑垂体提取物(BPE) Clonetics Corp . CA,圣地亚哥和氢化可的松Calbiochem,圣地亚哥,CA。胰岛素,转铁蛋白,和dbcAMP从西格玛化工有限公司,圣路易斯,密苏里州尼龙膜和Tag-Ready-to-Go PCR珠子来自Amersham生物科学,皮斯卡塔韦,新泽西。牛的牛血清和胎牛血清来自HyClone实验室,Inc .,洛根,UT。聚乙烯二氟化物薄膜(PVDF)来自BioRad实验室,卡尔斯巴德,CA。FuGene6购买从罗氏诊断公司,新泽西州,新泽西。Lipofectamine +试剂是表达载体、大力神、钙、和promoterless renilla荧光素酶构建从Promega购买,麦迪逊,WI。

2.2。抗体

特定PKC -单克隆抗体(稀释:1:50)从BD购买生物科学,圣何塞CA。多克隆抗体磷酸化smad 1/5/8(稀释:1:10),TRP-1(稀释:1:1000)和MCI-R(稀释:1:10 0)购买的圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA。对酪氨酸酶单克隆抗体(稀释:1:1000)从向量实验室,购买公司,伯林盖姆,CA。MITF单克隆抗体(稀释:1:10)是一个慷慨的礼物David Fisher博士的皮肤病,马萨诸塞州综合医院,波士顿,MA。

2.3。细胞和媒体

新生儿包皮被用来获得人类黑色素细胞如前所述[23]。总之,表皮与真皮分离后一夜之间0.25%胰蛋白酶4中孵化c .主要文化被包含1.8毫米成立于199年的媒介和补充三碘甲状腺氨酸,10g / mL胰岛素,氢化可的松,BPE (35 ug /毫升),80嗯dbcAMP 10 ng / mL基本成纤维细胞生长因子和5 - 10%胎牛血清。文章主要文化都保持在低钙(0.03毫米)。细胞在第一或第二通道用于所有实验。LH黑色素瘤细胞在含有10%的牛血清DMEM维护。

2.4。免疫印迹分析

免疫印迹分析如前所述[23]。细胞收获里帕缓冲区(0.25米三羟甲基氨基甲烷(pH值7.5),液0.5 M氯化钠,2.5% SDS和0.1% triton - x - 100)含有蛋白酶抑制剂(100冈田酸,100PMSF, 100g / mL Apoprotinin, 2g / mL亮抑酶肽和100米Ortho-Vanadate钠)。蛋白质样品受到7.5% sds - page和转移到PVDF膜electrophoretically。膜preincubated在烂醉如泥的100%(5克脱脂奶粉在100毫升磷酸缓冲盐(PBS)) 1 - 3小时在室温下用颤抖的,其次是一夜孵化与抗血清(0.5 1 ug /毫升烂醉如泥的10%)4C (18,26,50]。最后孵化,包含0.5%的膜被广泛用PBS Tween-20,使用ECL工具包和加工。膜被暴露在柯达X-OMAT电影。

2.5。向量

PKC -promoter-CAT记者构造和控制表达向量得到从南佛罗里达大学的丹尼斯·库珀博士(56]。

2.6。瞬时转染

为了介绍PKC -promoter-CAT记者构造成韩黑素瘤细胞,4 ug的DNA是用Lipofectamine预处理+试剂作为转染效率的内部控制,0.4 ug promoterless renilla cotransfected荧光素酶。转染24小时后,细胞治疗与车辆或BMP-4 (25 ng / mL)。细胞然后从48到72小时后收获BMP-4治疗。猫和荧光素酶化验进行根据制造商的协议。

2.7。半定量rt - pcr

确定BMP-4 PKC的水平——的影响成绩单、半定量rt - pcr最初表现。具体来说,从黑色素细胞总RNA的互补脱氧核糖核酸是由孤立使用低聚糖pd (N)₆(法玛西亚精细化工,皮斯卡塔韦,NJ)。引物具体的PKC -承认两我和二世从牛津大学生物医学研究购买公司内部控制、引物对GAPDH(向前:落后:)使用。0.1 ug的cDNA放大了15 pmol每向前和向后引物。最初,37个周期放大进行互补脱氧核糖核酸和核糖核酸从每个样品以确保没有污染的RNA基因组DNA样本。所有PCR反应放大了29日周期的下降在指数期最优检测放大的PKC -和骨形态发生蛋白受体和允许mRNA转录调制的定量分析。变性是在94年在58 C 30秒,引物退火C 1分钟,DNA聚合为72C在热循环1分钟(MJ研究Inc .,沃尔瑟姆,MA)。PCR产物分离/ 1%的琼脂糖凝胶1 x TAE和溴化乙锭染色。PCR产物的水平受到光密度分析。PKC -转录水平被标准化的水平GAPDH成绩单。

2.8。实时定量PCR(存在)

BMP-4对MITF-M水平车辆与使用MyiQ BMP-4黑色素细胞治疗进行了分析光学模块实时PCR系统(Biorad)和智商SYBR绿色Supermix包含MITF-M上游引物:和下游引物:。第二组MITF-M引物设计并用于确认结果:上游引物:和下游引物:。PCR反应是在50 uL包含2 - 4 ng cDNA体积。最后的引物和探针浓度为每个引物/探针组合进行了优化。两步PCR循环进行如下:95C 5分钟×1周期,95年C 0.5分钟,55×40 C 0.5分钟周期。所有内部控制、并行GAPDH是放大正常化。

2.9。光密度分析

光密度分析是由西方和北方印迹的放射自显影图扫描和PCR产品到戴尔电脑(PC)。每个扫描带强度决定使用Doc 1000/2000 BIO-RAD凝胶成像背景减法后密度计。

3所示。结果

3.1。BMP-4 TRP-1蛋白质含量的下降,PKC -,MC1-R

BMP-4被证明抑制黑素原生成,黑色素细胞的关键差异化功能,部分通过减少酪氨酸酶的表达(18]。检查BMP-4是否会影响其他melanogenic蛋白质的表达,成对文化subconfluent人类黑色素细胞主要是处理车辆(4毫米HCl / 0.01% BSA)或BMP-4 25 ng / mL;最优浓度治疗黑色素细胞如前所报道(18),24和48小时TRP-1的蛋白质含量,PKC -使用特定抗体和MC1-R评估,这些蛋白质。结果表明,BMP-4 PKC的蛋白质含量下降49.9±29.7% (在24小时和47.7±18.0% ()(图48小时1(一)),级的减少降低酪氨酸酶磷酸化和活动在人类黑色素细胞(23,27]。TRP-1的蛋白质含量下降了45%±5.0% ()和36±6.5.0% (分别)在24和48小时时间点(图1 (b))。MC1-R的蛋白质含量下降了50%±2.0% ()和55%±2.5% (分别)在24和48小时(图1 (c))。总之,BMP-4 PKC的蛋白质含量减少、TRP-1 MC1-R。更早的时间点的变化不显著水平的这些蛋白质BMP-4治疗的反应。

3.2。BMP-4 Smads-1/5/8和MAPK / ERK信号通路激活

能够很好的证明,BMP-4调节目标基因的转录Smads 1/5/8 - [11- - - - - -14)依赖和/或MAPK / ERK通路(15,16]。检查其中一个或两个通路是否参与调解的影响BMP-4 melanogenic蛋白的表达在人类黑色素细胞磷酸化(激活)Smads 1/5/8 BMP-4第一次调查。成对文化黑色素细胞治疗与车辆或BMP-4 (25 ng / mL) 2和4小时如前所做的(18]。然后收获细胞免疫印迹分析使用一个多克隆抗体对磷酸化Smads-1/5/8反应。结果表明,Smads-1/5/8由BMP-4磷酸化后2小时内治疗(图2(一个))。

调查是否BMP-4也可以激活MAPK / ERK-dependent通路在人类黑色素细胞,黑色素细胞的成对文化处理车辆或BMP-4 (25 ng / mL) 15 - 30分钟。肿瘤促进剂佛波醇dibutyrate (PDBu)被用作积极控制如图所示(前50]。如图2 (b)30分钟内,ERK1/2磷酸化BMP-4治疗。正如所料,PDBu磷酸化ERK1/2在15分钟的治疗。这些结果表明,Smads-1/5/8和MAPK / erk途径被激活BMP-4和可能参与调停BMP-4人工培养的黑色素细胞反应。

3.3。磷酸化水平MITF短暂地增加了BMP-4

众所周知,激活MAPK / ERK通路可以使磷酸化MITF,导致瞬时激活然后MITF退化(50,51]。MITF是关键转录因子调节TRP-1的表达,PKC -和MC1-R。因此,它的影响可能BMP-4这些melanogenic蛋白表达的是部分或完全通过MITF介导。测试MITF BMP-4治疗是否会导致磷酸化,成对的黑色素细胞的文化对待BMP-4 (25 ng / mL)为0,0.5,1、2,5小时。结果表明高基础水平的磷酸化MITF(0人力资源)。然后磷酸化水平MITF增加了2 - 4倍(在1小时),有一个后续减少(图5小时时间点3(一个))。确认磷酸化的MITF BMP-4治疗是通过MAPK / ERK-dependent通路,介导黑色素细胞的成对文化对待MAKP抑制剂PD98056 (10 uM)或车辆(DMSO)。PD98056完全封锁了BMP-4诱导MITF磷酸化(图3 (b)),确认BMP-4磷酸化MITF通过MAPK / ERK-dependent途径。

因为众所周知,磷酸化MITF MAPK / ERK-dependent途径导致proteosome-mediated MITF[退化50,51),减少水平的MITF BMP-4治疗4到5小时可能是因为MITF退化。进一步证实了这种可能性,成对的黑色素细胞的文化对待BMP-4 (25 ng / mL)为0,1,2,3,5小时存在与否的蛋白酶体抑制剂mg - 132 (10 uM)。蛋白质合成抑制剂cyclohexamide (15 ug /毫升)添加治疗组。结果表明,BMP-4首先增加磷酸化水平MITF(0.5 - 1小时),然后MITF水平开始下降在2小时,并显著降低5个小时。存在的蛋白酶体抑制剂mg - 132完全封锁了退化MITF(图3 (c))。这些结果清楚地表明,BMP-4暂时性的磷酸化MITF,所以可能会促进急性杀菌作用,其次是下调。

3.4。慢性治疗BMP-4 MITF总量下降

如果BMP-4引起瞬态磷酸化MITF,其次是proteosome-mediated退化,长期治疗BMP最终导致MITF总水平下降。测试这种可能性,成对的黑色素细胞的文化对待BMP-4 (25 ng / mL)或车辆仅24或48小时。免疫印迹分析使用特定单克隆抗体MITF检测磷酸化和nonphosphorylated MITF透露,BMP-4显著下降的水平两种MITF 24和48小时时间点(图4(一))。

进一步检查是否MITF水平降低了慢性治疗黑色素细胞BMP-4完全是由于proteosome-mediated MITF退化或BMP-4也可以减少MITF成绩单、双文化的黑色素细胞治疗与车辆或BMP-4 (25 ng / mL) 4、24、48小时总RNA是孤立的。反转录成RNA cDNA, MITF-M成绩单车辆之间的水平和BMP-4治疗样本确定使用定量实时PCR。GAPDH水平的成绩单是用作内部控制。MITF-M转录水平保持不变在4和24小时后BMP-4治疗(图4 (b))。然而,经过48小时的BMP-4治疗,MITF-M成绩单显著水平()降低(图4 (b))。这些结果表明,蛋白质含量的减少的MITF BMP-4最初由于proteosome-mediated退化。BMP-4随后减少MITF在转录水平的表达。

3.5。BMP-4降低了细胞内的黑色素细胞的阵营

结果到目前为止表明BMP-4短暂激活MITF通过MAPK / ERK-dependent途径。我们的研究结果还表明,BMP-4转录调节MITF的表达。最近的报告表明,cAMP-dependent通路可能调解BMP-4诱导变化(57]。因为营地被牵连的关键分子诱导色素(39,41),通过诱导的表达MITF-M [40BMP-4],可能影响细胞内营的水平在人类黑色素细胞培养进行了探讨。成对文化subconfluent黑色素细胞治疗与BMP-4 (25 ng / mL)。然后在每个时间点细胞收获和营地的水平测量使用酶联免疫印迹试验(ELISA)。18小时内BMP-4治疗,营级开始减少48小时,BMP-4显著降低细胞内的营地(图5)。这个结果表明MITF BMP-4影响表达式的一部分可以通过cAMP-dependent介导的通路。

3.6。BMP-4对启动子PKC活性的影响

目前还不清楚到什么程度Smads-1/5/8通路参与调解的影响BMP-4 TRP-1的表达,PKC -、MC1-R MITF。酪氨酸酶的启动子区域的核苷酸序列,出版和PKC -透露,他们都包含Smad-1共识序列和Smad-558,59),这表明BMP-4可以控制这两个关键melanogenic表达的蛋白质通过Smad-dependent通路。

探索BMP-4可能调节PKC——的可能性表达式,在某种程度上,通过抑制PKC的推广活动基因可能通过Smad-dependent通路,PKC -水平记录第一次使用半定量RT PCR检测。如图6(一),两个成绩单的PKC -识别和记录的水平是大大减少了BMP-4(图6)。

为了演示BMP-4是否会影响PKC的推广活动PKC -promoter-CAT记者构造(56)是人类黑色素瘤细胞转染到LH最初培养从一个转移性黑色素瘤60]。与其他黑素瘤行,内生PKC的表达是失去了61年,62年),LH人类黑色素瘤细胞保留PKC的表达,表达BMPR-IA / IB和BMPR-II(数据没有显示)。此外,PKC的表达韩黑素瘤细胞应对BMP-4类似发现在培养的黑色素细胞的蛋白质和PKC的信使rna被治疗的细胞减少BMP-4 (25 ng / mL) 24小时(数据没有显示)。然后,检查是否BMP-4抑制PKC的推广活动,PKC -promoter-CAT记者构造转染到配对LH黑色素瘤细胞的文化。一个promoterless renilla-luciferase记者构造cotransfected到每个盘子规范化板块之间的转染效率,和结果表示为猫活动/荧光素酶的活动。盘子是对待BMP-4 (25 ng / mL)或车辆单独转染24小时后,和细胞收获BMP-4治疗后48小时。在八个独立的实验中,启动子活性的PKC -降低了~ 25±5% BMP-4-treated细胞相比vehicle-treated细胞(图7)。成对学生t检验表明,启动子活性的抑制PKC -由BMP-4统计学意义()。虽然BMP-4对启动子PKC活性的影响是统计学意义,减少的总体水平是温和的和小于水平减少PKC -信使rna和蛋白质的水平。这些结果表明,BMP-4利用只是部分Smads-dependent通路调节PKC的表达。

4所示。讨论

骨形成蛋白(bmp)被证明是重要的发展成黑素细胞在胚胎发生(了19])。近年来,它已经表明,我国BMP 2/4特别是,可能扮演关键角色分化表皮黑色素细胞的生物学功能作为旁分泌和自分泌因子通过影响黑色素细胞的活动。表皮角化细胞和黑色素细胞表达BMP-4及其受体;BMPR-IA, BMPR-IB, BMPR-II BMP-4和所有三个BMP-4受体抑制在这些细胞暴露在紫外线(18]。此外,BMP-4及其信号通路最近提出的新型调制器人工色素(18]。

通过Smads BMP-4能够发挥其生物学作用——和/或MAPK / ERK信号通路15,16]。我们的研究结果表明,BMP-4治疗引起的信号通路的激活。然而,研究结果有力地表明,BMP-4优先利用MAPK / ERK-pathway调节黑色素的合成或杀菌作用一旦它的细胞表面受体结合。实验提出了证明的一个主要目标蛋白质BMP-4激活MAPK / ERK通路在人类MITF黑色素细胞。调制的活动和/或表达MITF可能产生重大影响的生物学黑色素细胞因为MITF中央许多melanogenic蛋白的转录因子,包括酪氨酸酶(41TRP-1], [41]PKC -(40- - - - - -42),和受体44],以及凋亡蛋白bcl2 [63年]。当BMP-4添加到黑素细胞文化,MITF短暂地磷酸化通过MAPK / BMP-4 ERK-dependent信号通路,这最初磷酸化激活的转录活动MITF,正如前面所示(50,51]。因此,BMP-4可以敏锐地促进黑素原生成。然而,磷酸化MITF导致proteosome-mediated退化,如前所报道(53]。最终由BMP-4 MITF水平下降将导致整体melanogenic蛋白质的水平,从而减少,导致黑素原生成的下调。

细胞表面受体c - kit,被激活后配位体的相互作用干细胞因子(CSF),是第一个在黑色素细胞显示细胞表面受体激活MAPK / ERK通路MITF从而导致瞬态磷酸化,激活的转录因子(51]。最近表明,c - kit可溶性形式,从黑色素细胞和隔绝CSF释放出来,因此,抑制黑素原生成(64年]。这将是有趣的决定是否BMP-4和可溶性c - kit表达上调可能协同工作MITF水平。

我们的结果进一步表明,TRP-1 BMP-4对表达的影响,PKC -和MC1-R主要介导间接通过减少MITF水平。MITF水平下降将导致这些基因的转录活动水平下降。事实上,它引起的减少PKC的成绩单——的水平。然而,减少PKC——的一部分记录通过Smad-dependent BMP-4是通路,稍后解释。尽管如此,MAPK / ERK-dependant途径似乎PKC的水平发挥更大的贡献通过MITF。

我们的结果进一步表明,BMP-4下调的蛋白质水平MITF首先proteosome-mediated退化。接下来就有减少MITF-M记录的水平,表明BMP-4可以转录抑制MITF-M的表达。水平的降低MITF-M可能由cAMP-dependent通路。结果表明,BMP-4减少细胞内水平的阵营。据报道,BMP-4可以调节细胞内的营地(19,65年,66年]。在黑色素细胞不清楚BMP-4下调细胞内营通过显示MC1-R的表达水平,或者通过其他的机制。Smads-dependent通路参与不太可能下调MITF-M成绩单,因为MITF基因的启动子区域不包含DNA共识序列Smads结合位点(46]。

MITF也显示出积极的调节凋亡蛋白的表达bcl2 [63年]。因此,减少水平的MITF BMP-4可能最终影响黑色素细胞的生存。Yaar节等人报道,BMP-4短期接触黑色素细胞并没有改变扩散率和它并没有导致黑色素细胞的凋亡18]。然而,BMP-4可能增加黑色素细胞的敏感性损害如紫外线和其他化学制剂,能减少黑色素细胞的生存。因此,BMP-4在黑素细胞的作用将会超出它在黑素原生成中的作用。

Smads 1、5、8和/或被BMP-4磷酸化后2小时内治疗人类黑色素细胞培养。此外,Yaar节等人表明,激活(磷酸化)Smad 1 5、和/或8把核(18]。在melanogenic蛋白检查,只有PKC的启动子区域揭示十二Smad-1和一个Smad-5共识序列(58),这表明BMP-4可以直接调节的转录活动PKC -基因。转染的PKC -promoter-CAT记者构造成LH细胞显示温和但PKC -的重要方案promoter-CAT记者活动。PKC -下降的水平成绩单由BMP-4大于的抑制PKC -启动子活动。这些结果表明,PKC BMP-4——的影响表达可能涉及直接转录调控。然而,明确示范PKC -之间的直接互动启动子和Smads 1、5、8和/或需要额外的实验涉及gel-shifts和/或芯片分析。

在小鼠黑色素瘤细胞,TGF -减少色素减少酪氨酸酶稳定性的信使rna和蛋白质(67年),以及减少的水平和活动MITF [55]。TGF -只显示减少的水平phosphrylated MITF [55]。然而,结果摘要显示,水平的磷酸化和nonphosphorylated MITF被BMP-4在人工培养的黑色素细胞减少。尽管BMP-4属于总科的TGF -,他们的行动的详细机制可能不同杀菌作用。

目前的体外研究的结果有可能体内的相关性,为转基因小鼠中BMP-4行动是由过度的生理与抑制剂的大脑在毛囊明显深色大衣的颜色(21]。

我们的研究结果表明,BMP-4-dependent通路是一个关键的生理-调制器的杀菌作用,抑制melanogenic蛋白和信号分子的表达。BMP-4可能因此提供一种新颖的目标调制的杀菌作用。

缩写

BMP-4:	骨形成蛋白4
PKC -:	蛋白激酶C -
MITF:	Microphthalmia-associated转录因子
猫:	氯霉素乙酰转移酶
DMEM:	杜尔贝科的修改的重要媒介
BPE:	牛脑垂体提取物
TRP-1:	酪氨酸酶相关蛋白1
MC1-R:	肾上腺皮质受体1
MAPK:	增殖蛋白激酶
兵:	Extracellular-signal调节激酶
紫外线:	紫外线照射。

确认

这部分工作是支持阿k Kurban职业发展奖和国家白癜风基金会(H.Y.公园)。作者要感谢南佛罗里达大学的丹尼斯·库珀博士提供的PKC -启动子构建和David Fisher博士的皮肤病,马萨诸塞州综合医院,波士顿,MA对MITF提供单克隆抗体。

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