重组人类BMP-4获得研发系统,Inc .,明尼阿波利斯、锰。杜尔贝科的修改基本培养基(DMEM),课时,不必要的氨基酸,谷氨酰胺,中199和胰蛋白酶从GIBCO购买/ BRL盖瑟斯堡,MD。重组基本成纤维细胞生长因子是购自Amgen Inc . CA,千橡市牛脑垂体提取物(BPE) Clonetics Corp . CA,圣地亚哥和氢化可的松Calbiochem,圣地亚哥,CA。胰岛素,转铁蛋白,和dbcAMP从西格玛化工有限公司,圣路易斯,密苏里州尼龙膜和Tag-Ready-to-Go PCR珠子来自Amersham生物科学,皮斯卡塔韦,新泽西。牛的牛血清和胎牛血清来自HyClone实验室,Inc .,洛根,UT。聚乙烯二氟化物薄膜(PVDF)来自BioRad实验室,卡尔斯巴德,CA。FuGene6购买从罗氏诊断公司,新泽西州,新泽西。Lipofectamine +试剂是表达载体、大力神、钙、和promoterless renilla荧光素酶构建从Promega购买,麦迪逊,WI。

特定PKC -单克隆抗体 β (稀释:1:50)从BD购买生物科学,圣何塞CA。多克隆抗体磷酸化smad 1/5/8(稀释:1:10),TRP-1(稀释:1:1000)和MCI-R(稀释:1:10 0)购买的圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA。对酪氨酸酶单克隆抗体(稀释:1:1000)从向量实验室,购买公司,伯林盖姆,CA。MITF单克隆抗体(稀释:1:10)是一个慷慨的礼物David Fisher博士的皮肤病,马萨诸塞州综合医院,波士顿,MA。

新生儿包皮被用来获得人类黑色素细胞如前所述[ 23]。总之,表皮与真皮分离后一夜之间0.25%胰蛋白酶4中孵化 ° c .主要文化被包含1.8毫米成立于199年的媒介 Ca + 2 和补充 10 - - - - - - 9 三碘甲状腺氨酸,10 μ g / mL胰岛素, 1。4 × 10 - - - - - - 6 氢化可的松,BPE (35 ug /毫升),80嗯dbcAMP 10 ng / mL基本成纤维细胞生长因子和5 - 10%胎牛血清。文章主要文化都保持在低钙(0.03毫米)。细胞在第一或第二通道用于所有实验。LH黑色素瘤细胞在含有10%的牛血清DMEM维护。

免疫印迹分析如前所述[ 23]。细胞收获里帕缓冲区(0.25米三羟甲基氨基甲烷(pH值7.5),液0.5 M氯化钠,2.5% SDS和0.1% triton - x - 100)含有蛋白酶抑制剂(100 μ 冈田酸,100 μ PMSF, 100 μ g / mL Apoprotinin, 2 μ g / mL亮抑酶肽和100 μ 米Ortho-Vanadate钠)。蛋白质样品受到7.5% sds - page和转移到PVDF膜electrophoretically。膜preincubated在烂醉如泥的100%(5克脱脂奶粉在100毫升磷酸缓冲盐(PBS)) 1 - 3小时在室温下用颤抖的,其次是一夜孵化与抗血清(0.5 1 ug /毫升烂醉如泥的10%)4 ° C ( 18, 26, 50]。最后孵化,包含0.5%的膜被广泛用PBS Tween-20,使用ECL工具包和加工。膜被暴露在柯达X-OMAT电影。

PKC - β promoter-CAT记者构造和控制表达向量得到从南佛罗里达大学的丹尼斯·库珀博士( 56]。

为了介绍PKC - β promoter-CAT记者构造成韩黑素瘤细胞,4 ug的DNA是用Lipofectamine预处理+试剂作为转染效率的内部控制,0.4 ug promoterless renilla cotransfected荧光素酶。转染24小时后,细胞治疗与车辆或BMP-4 (25 ng / mL)。细胞然后从48到72小时后收获BMP-4治疗。猫和荧光素酶化验进行根据制造商的协议。

确定BMP-4 PKC的水平——的影响 β 成绩单、半定量rt - pcr最初表现。具体来说,从黑色素细胞总RNA的互补脱氧核糖核酸是由孤立使用低聚糖pd (N)₆(法玛西亚精细化工,皮斯卡塔韦,NJ)。引物具体的PKC - β 承认两 β 我和 β 二世从牛津大学生物医学研究购买公司内部控制、引物对GAPDH(向前: 5 ′ GTCATCATCTCCGCCCCTTC 3 ′ 落后: 3 ′ CCGCACTACCGGCACCCCGT 5 ′ )使用。0.1 ug的cDNA放大了15 pmol每向前和向后引物。最初,37个周期放大进行互补脱氧核糖核酸和核糖核酸从每个样品以确保没有污染的RNA基因组DNA样本。所有PCR反应放大了29日周期的下降在指数期最优检测放大的PKC - β 和骨形态发生蛋白受体和允许mRNA转录调制的定量分析。变性是在94年 ° 在58 C 30秒,引物退火 ° C 1分钟,DNA聚合为72 ° C在热循环1分钟(MJ研究Inc .,沃尔瑟姆,MA)。PCR产物分离/ 1%的琼脂糖凝胶1 x TAE和溴化乙锭染色。PCR产物的水平受到光密度分析。PKC - β 转录水平被标准化的水平GAPDH成绩单。

BMP-4对MITF-M水平车辆与使用MyiQ BMP-4黑色素细胞治疗进行了分析 TM 光学模块实时PCR系统(Biorad)和智商SYBR绿色Supermix包含MITF-M上游引物: 5 ′ CACGGGTCTCTGCTCTCC 3 ′ 和下游引物: 5 ′ GGTTGTTGTTGAAGGTGATGG 3 ′ 。第二组MITF-M引物设计并用于确认结果:上游引物: 5 ′ ATAGAAAGTAGAGGGAGGGATAG 5 ′ 和下游引物: 5 ′ TTATTTGCTAAAGTGGTAGAAAGG 3 ′ 。PCR反应是在50 uL包含2 - 4 ng cDNA体积。最后的引物和探针浓度为每个引物/探针组合进行了优化。两步PCR循环进行如下:95 ° C 5分钟×1周期,95年 ° C 0.5分钟,55 ° ×40 C 0.5分钟周期。所有内部控制、并行GAPDH是放大正常化。

光密度分析是由西方和北方印迹的放射自显影图扫描和PCR产品到戴尔电脑(PC TM )。每个扫描带强度决定使用Doc 1000/2000 BIO-RAD凝胶成像背景减法后密度计 。

BMP-4被证明抑制黑素原生成,黑色素细胞的关键差异化功能,部分通过减少酪氨酸酶的表达( 18]。检查BMP-4是否会影响其他melanogenic蛋白质的表达,成对文化subconfluent人类黑色素细胞主要是处理车辆(4毫米HCl / 0.01% BSA)或BMP-4 25 ng / mL;最优浓度治疗黑色素细胞如前所报道( 18),24和48小时TRP-1的蛋白质含量,PKC - β , 使用特定抗体和MC1-R评估,这些蛋白质。结果表明,BMP-4 PKC的蛋白质含量下降 β 49.9±29.7% ( P < 。 04 在24小时和47.7±18.0% ( P < 。 04 )(图48小时 1(一)),级的减少降低酪氨酸酶磷酸化和活动在人类黑色素细胞( 23, 27]。TRP-1的蛋白质含量下降了45%±5.0% ( P < 。 05年 )和36±6.5.0% ( P < 。 045年 分别)在24和48小时时间点(图 1 (b))。MC1-R的蛋白质含量下降了50%±2.0% ( P < 。 03 )和55%±2.5% ( P < 。 05年 分别)在24和48小时(图 1 (c))。总之,BMP-4 PKC的蛋白质含量减少 β 、TRP-1 MC1-R。更早的时间点的变化不显著水平的这些蛋白质BMP-4治疗的反应。

能够很好的证明,BMP-4调节目标基因的转录Smads 1/5/8 - [ 11- - - - - - 14)依赖和/或MAPK / ERK通路( 15, 16]。检查其中一个或两个通路是否参与调解的影响BMP-4 melanogenic蛋白的表达在人类黑色素细胞磷酸化(激活)Smads 1/5/8 BMP-4第一次调查。成对文化黑色素细胞治疗与车辆或BMP-4 (25 ng / mL) 2和4小时如前所做的( 18]。然后收获细胞免疫印迹分析使用一个多克隆抗体对磷酸化Smads-1/5/8反应。结果表明,Smads-1/5/8由BMP-4磷酸化后2小时内治疗(图 2(一个))。

调查是否BMP-4也可以激活MAPK / ERK-dependent通路在人类黑色素细胞,黑色素细胞的成对文化处理车辆或BMP-4 (25 ng / mL) 15 - 30分钟。肿瘤促进剂佛波醇dibutyrate (PDBu)被用作积极控制如图所示(前 50]。如图 2 (b)30分钟内,ERK1/2磷酸化BMP-4治疗。正如所料,PDBu磷酸化ERK1/2在15分钟的治疗。这些结果表明,Smads-1/5/8和MAPK / erk途径被激活BMP-4和可能参与调停BMP-4人工培养的黑色素细胞反应。

众所周知,激活MAPK / ERK通路可以使磷酸化MITF,导致瞬时激活然后MITF退化( 50, 51]。MITF是关键转录因子调节TRP-1的表达,PKC - β , 和MC1-R。因此,它的影响可能BMP-4这些melanogenic蛋白表达的是部分或完全通过MITF介导。测试MITF BMP-4治疗是否会导致磷酸化,成对的黑色素细胞的文化对待BMP-4 (25 ng / mL)为0,0.5,1、2,5小时。结果表明高基础水平的磷酸化MITF(0人力资源)。然后磷酸化水平MITF增加了2 - 4倍( P < 。 03 在1小时),有一个后续减少(图5小时时间点 3(一个))。确认磷酸化的MITF BMP-4治疗是通过MAPK / ERK-dependent通路,介导黑色素细胞的成对文化对待MAKP抑制剂PD98056 (10 uM)或车辆(DMSO)。PD98056完全封锁了BMP-4诱导MITF磷酸化(图 3 (b)),确认BMP-4磷酸化MITF通过MAPK / ERK-dependent途径。

因为众所周知,磷酸化MITF MAPK / ERK-dependent途径导致proteosome-mediated MITF[退化 50, 51),减少水平的MITF BMP-4治疗4到5小时可能是因为MITF退化。进一步证实了这种可能性,成对的黑色素细胞的文化对待BMP-4 (25 ng / mL)为0,1,2,3,5小时存在与否的蛋白酶体抑制剂mg - 132 (10 uM)。蛋白质合成抑制剂cyclohexamide (15 ug /毫升)添加治疗组。结果表明,BMP-4首先增加磷酸化水平MITF(0.5 - 1小时),然后MITF水平开始下降在2小时,并显著降低5个小时。存在的蛋白酶体抑制剂mg - 132完全封锁了退化MITF(图 3 (c))。这些结果清楚地表明,BMP-4暂时性的磷酸化MITF,所以可能会促进急性杀菌作用,其次是下调。

如果BMP-4引起瞬态磷酸化MITF,其次是proteosome-mediated退化,长期治疗BMP最终导致MITF总水平下降。测试这种可能性,成对的黑色素细胞的文化对待BMP-4 (25 ng / mL)或车辆仅24或48小时。免疫印迹分析使用特定单克隆抗体MITF检测磷酸化和nonphosphorylated MITF透露,BMP-4显著下降的水平两种MITF 24和48小时时间点(图 4(一))。

进一步检查是否MITF水平降低了慢性治疗黑色素细胞BMP-4完全是由于proteosome-mediated MITF退化或BMP-4也可以减少MITF成绩单、双文化的黑色素细胞治疗与车辆或BMP-4 (25 ng / mL) 4、24、48小时总RNA是孤立的。反转录成RNA cDNA, MITF-M成绩单车辆之间的水平和BMP-4治疗样本确定使用定量实时PCR。GAPDH水平的成绩单是用作内部控制。MITF-M转录水平保持不变在4和24小时后BMP-4治疗(图 4 (b))。然而,经过48小时的BMP-4治疗,MITF-M成绩单显著水平( P = 。 039年 )降低(图 4 (b))。这些结果表明,蛋白质含量的减少的MITF BMP-4最初由于proteosome-mediated退化。BMP-4随后减少MITF在转录水平的表达。

结果到目前为止表明BMP-4短暂激活MITF通过MAPK / ERK-dependent途径。我们的研究结果还表明,BMP-4转录调节MITF的表达。最近的报告表明,cAMP-dependent通路可能调解BMP-4诱导变化( 57]。因为营地被牵连的关键分子诱导色素( 39, 41),通过诱导的表达MITF-M [ 40BMP-4],可能影响细胞内营的水平在人类黑色素细胞培养进行了探讨。成对文化subconfluent黑色素细胞治疗与BMP-4 (25 ng / mL)。然后在每个时间点细胞收获和营地的水平测量使用酶联免疫印迹试验(ELISA)。18小时内BMP-4治疗,营级开始减少48小时,BMP-4显著降低细胞内的营地(图 5)。这个结果表明MITF BMP-4影响表达式的一部分可以通过cAMP-dependent介导的通路。

目前还不清楚到什么程度Smads-1/5/8通路参与调解的影响BMP-4 TRP-1的表达,PKC - β 、MC1-R MITF。酪氨酸酶的启动子区域的核苷酸序列,出版和PKC - β 透露,他们都包含Smad-1共识序列和Smad-5 58, 59),这表明BMP-4可以控制这两个关键melanogenic表达的蛋白质通过Smad-dependent通路。

探索BMP-4可能调节PKC——的可能性 β 表达式,在某种程度上,通过抑制PKC的推广活动 β 基因可能通过Smad-dependent通路,PKC -水平 β 记录第一次使用半定量RT PCR检测。如图 6(一),两个成绩单的PKC - β 识别和记录的水平是大大减少了BMP-4(图 6)。

为了演示BMP-4是否会影响PKC的推广活动 β PKC - β promoter-CAT记者构造( 56)是人类黑色素瘤细胞转染到LH最初培养从一个转移性黑色素瘤 60]。与其他黑素瘤行,内生PKC的表达 β 是失去了 61年, 62年),LH人类黑色素瘤细胞保留PKC的表达 β ,表达BMPR-IA / IB和BMPR-II(数据没有显示)。此外,PKC的表达 β 韩黑素瘤细胞应对BMP-4类似发现在培养的黑色素细胞的蛋白质和PKC的信使rna β 被治疗的细胞减少BMP-4 (25 ng / mL) 24小时(数据没有显示)。然后,检查是否BMP-4抑制PKC的推广活动 β ,PKC - β promoter-CAT记者构造转染到配对LH黑色素瘤细胞的文化。一个promoterless renilla-luciferase记者构造cotransfected到每个盘子规范化板块之间的转染效率,和结果表示为猫活动/荧光素酶的活动。盘子是对待BMP-4 (25 ng / mL)或车辆单独转染24小时后,和细胞收获BMP-4治疗后48小时。在八个独立的实验中,启动子活性的PKC - β 降低了~ 25±5% BMP-4-treated细胞相比vehicle-treated细胞(图 7)。成对学生t检验表明,启动子活性的抑制PKC - β 由BMP-4统计学意义( P < 。 01 )。虽然BMP-4对启动子PKC活性的影响 β 是统计学意义,减少的总体水平是温和的和小于水平减少PKC - β 信使rna和蛋白质的水平。这些结果表明,BMP-4利用只是部分Smads-dependent通路调节PKC的表达 β 。