变更的肌浆网释放在骨骼肌Calpain 3-Deficient老鼠

文摘

突变的激活蛋白酶(钙蛋白酶)导致肌营养不良。然而,钙蛋白酶的特定角色信号在营养不良的发病仍不清楚。我们调查了处理的骨骼细胞calpain 3-deficient老鼠。对咖啡因的反应,阿诺定受体(RyR)受体激动剂,减少−−/肌管和缺席−−/成肌细胞。−/−肌管显示小的振幅瞬变引起cyclopiazonic酸相比,野生型细胞。抑制l型(LCC)镇压caffeine-induced渠道反应在−−肌管。因此,缺乏calpain 3修改肌浆网(SR)老版本,通过减少内容,RyR信号的损伤,增加了LCC的活动。我们建议calpain 3-dependent蛋白水解作用有助于激活支持细胞内的蛋白质信号在细胞分化的一个阶段,是骨骼肌再生的关键。

1。介绍

钙蛋白酶在细胞内nonlysosomal半胱氨酸蛋白酶的功能是由Ca^{2 +}(见[1]审查)。这些蛋白质确实显示一个Ca^{2 +}绑定域名在每一个或大或小的子单元2]。钙蛋白酶的生理作用还没有完全理解但是蛋白酶,它们可能调节重要的细胞功能。特别是,无处不在的钙蛋白酶已经涉及各种各样的过程包括细胞凋亡、肌原性的分化,细胞分裂和融合1]。钙蛋白酶已被证明在其他细胞扮演监管角色,他们可以影响基因表达通过特定转录因子的乳沟,影响细胞的生存能力通过控制细胞凋亡,调节其他细胞过程通过特定激酶的乳沟和离子通道(审核Carafoli莫伦纳;(3])。这是证明,没有具体的骨骼肌calpain 3(从相应的基因capn3)导致肢带肌萎缩症2型(LGMD2A) (4),这种疾病与凋亡的一个重要层面纤维(5]。为了更好地理解函数LGMD2A calpain 3和诸多病理生理学机制中,一个适当的模型生成的基因打靶(6]。病理过程由于calpain 3缺乏是与膜透性改变有关(6]表明可能存在的内稳态扰动,特别是在细胞内Ca^{2 +}浓度([Ca^{2 +}]_我在肌肉萎缩症)。

94 kDa的识别从骨骼肌蛋白质具有thiol-dependent专门针对骨骼肌阿诺定受体蛋白水解活性(RyR)的发病机理有几个含意LGMD2A [7]。特别是,它可以骨骼肌功能的失调,至少部分的结果缺乏RyR监管calpain 3。

事实上,RyR,也称为Ca^{2 +}发布渠道,是关键蛋白质负责Ca的极其快速的运动^{2 +}(每秒数以百万计的离子)从内部商店命名为肌浆网(SR)胞质兴奋收缩过程中耦合。后者由质膜两极化的描述来自运动神经元和激活dihydropyridine受体或l型钙^{2 +}通道(lcc)机械耦合的骨骼RyR同种型1。反过来,Ca^{2 +}释放RyR导致收缩丝滑动,从而引发抽搐的肌肉细胞。然后Ca^{2 +}必须远离Na的胞质挤压通过了吗⁺/ Ca^{2 +}换热器和再吸收到SR的肌质/内质网钙^{2 +}腺苷三磷酸酶SERCA的泵。因此Ca^{2 +}骑自行车是一个调整的过程,需要强有力的控制其体内平衡。

测试RyR调制的假说calpain 3,我们研究了咖啡因的影响,RyR强有力的催化剂,和cyclopiazonic酸(CPA), SERCA的泵的抑制剂,在Ca^{2 +}]_我,控制肌肉的兴奋收缩偶联。我们测量(Ca^{2 +}]_我在正常的主要文化capn3缺乏小鼠骨骼肌细胞单细胞荧光microspectrofluorometry快。体内,卫星细胞被激活成成肌细胞,增殖并融合形成肌管修复受损的肌肉纤维。通过比较成肌细胞和肌管文化,我们旨在调查不同的再生过程中所涉及的步骤。我们药理方法使我们能够破译Ca的机制导致损伤^{2 +}释放在骨骼肌calpain 3是缺席,因为它可能会在LGMD2A病人。

2。材料和方法

2.1。代capn3-Deficient老鼠

的生产capn3−−/老鼠进行了根据完善的过程在2000年出版的由理查德·和合作者6]。

2.2。主要的骨骼肌细胞培养

上部和下部腿的肌肉切除成年老鼠,和增殖从这些肌肉卫星细胞被孤立链霉蛋白酶消化如前所述[8]。细胞被播种在gelatine-coated(0.5%)玻璃底部文化菜(HBSt或gwst - 3522系列;直径22毫米,0.17毫米厚度;WillCo井BV -一个荷兰msterdam) 210³细胞每厘米²杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)含20%胎牛血清,和孵化C在7.5%股份有限公司₂。细胞不断生长在这个媒介,取代了在第三天,然后每4天。卫星细胞增殖在文化长达11天。

2.3。间接免疫荧光法

间接免疫荧光法是被马丁等人(1997年9)使用适当的稀释中小学荧光抗体。样本与徕卡TCS 4 d共焦显微镜观察。

2.4。染料(Ca的加载和测量^{2 +}]_我

染料加载和测量细胞内自由钙([Ca^{2 +}]_我)进行描述(10- - - - - -12]。2.5文化菜是冲洗和孵化M fura-2-AM和0.05% w / v普朗尼克f - 127(美国)分子探针公司,在洛克洛克的缓冲区(mM):氯化钠140;氯化钾5;MgCl₂1.2;CaCl₂2.2;葡萄糖10;HEPES-Tris 10;pH值7.25)C 45分钟。随后,加载细胞冲洗与洛克的缓冲区,和荧光测量进行了缓冲保持在35 -C在实验的时间进程。Calcium-free介质(EGTA-buffer)包含(毫米):EGTA, 2;氯化钠,140;氯化钾、5;葡萄糖,10;氯化钾、5;MgCl₂,1;和消息灵通的10;pH值7.4。在这个EGTA缓冲区,免费的Ca^{2 +}调整到100海里(对应于休息(Ca吗^{2 +}]_我由初步fura-2测量)。(Ca^{2 +}]_我在单个细胞水平是衡量使用FFP光度计系统(蔡司、从、德国)基于一个倒置显微镜(axiovert - 100)配备了这项工作。带通滤波器(340/10和380/10 nm)交替放置滤光轮,和细胞兴奋通过油浸物镜(Zeiss-plan Neofluar100年,1.3厦门市)。用荧光值修正为背景和暗电流,Ca^{2 +}]_我计算了从340和380海里录音之间的比率。为在体外校准(Ca^{2 +}]_我测量基于Grynkiewicz等描述的过程。13),我们使用Ca^{2 +}-EGTA缓冲区包含(毫米):氯化钠140;MgCl₂2;葡萄糖10;消息灵通的10与Tris-HCl pH = 7.25调整。各种标准被用于系统校准(如前所述13]。

2.5。药物

除非另有说明,所有化学品都从Sigma-France购买。集中库存DMSO解cyclopiazonic酸(CPA)和阿诺定(Alomone实验室、以色列)存储c .咖啡因(Almone实验室,伊斯雷尔)溶解在适当的浓度直接在工作缓冲区。测试解决方案准备日常使用整除从冻结的股票来获取工作浓度。

2.6。药物的应用

控制和测试解决方案应用使用多个毛细血管灌注系统(200m内径毛细管,流量500l / min)放置接近细胞测试(< 0.5毫米)。每个毛细管的水库50厘米以上浴。切换从一个毛细管开到下一个完整的解决方案的变化。每个应用程序后,细胞被洗与洛克的缓冲区。预培养和抑制物质是在500年L含抑制剂稀释在洛克的缓冲区。

2.7。数据分析和统计方法

结果表示为均值±S。D或意味着±S.E.M。样本大小的数量()是细胞的数量相同的测试协议(控制、试验药物复苏),每组。(微量)数据显示,在线测量(Ca^{2 +}]_我水平之前和之后的应用测试物质,而条形图和数值数据给出均值±S.E.M.和代表的峰值振幅(Ca^{2 +}]_我增加。根据数据,使用方差分析或Mann-Whitney等级和测试结果进行分析。除非另有说明,被认为具有统计显著性差异。

2.8。免疫印迹

肌肉样本均质在200毫米蔗糖,0.4毫米CaCl₂,20毫米玫瑰(pH值7.4),200年M phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 1毫米diisopropylfluorophosphate (DFP)。蛋白质样品变性30分钟在室温和接受在4% - -15%丙烯酰胺梯度sds - page凝胶和electro-transferred止动剂膜3 0.8小时。膜阻止了PBS脱脂奶粉4%,0.1%渐变20 (PBS-T)在室温下30分钟,然后孵化一夜之间C的兔多克隆抗体RyR稀释000 (1/1014]。在PBS-T洗涤后,细胞膜被孵化了3小时在室温下与antirabbit二级抗体与辣根过氧化物酶(杰克逊ImmunoResearch实验室)耦合。启示进行了化学发光试剂(西方化学发光试剂+闪电,珀金埃尔默)。带强度量化使用ImageJ软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。

2.9。rt - pcr分析

从肌肉总RNA提取试剂盒方法(表达载体)粉碎后使用快速准备FP120装置(Bio101)。残余DNA被撤使用免费样品DNA工具包(Ambion)。一个g的RNA reverse-transcribed使用随机五个一根据协议“rt - pcr上标二世第一个链合成系统”(表达载体)。进行PCR反应以0.2的1/20每个引物的M。三对引物的设计capn3为了弥补可变剪接的地区4)如下:

p94sys3:向前-TTCACCAAATCCAACCACCG -和反向-ACTCCAAGAACCGTTCCACT -; p94sys5:向前-AGACAAAGATGAGAAGGCCC -和反向-GCCGATCCACAGAGATTGTA -; p94sys6:向前-GACAGAGCACACAGCAACAA -和反向-GTTGGCTGTTGAGATGGAAG -。

PCR琼脂糖凝胶电泳分离的产品和溴化乙锭染色。带强度量化使用ImageJ软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。

2.10。半胱天冬酶3活动

确定和量化半胱天冬酶3函数中,我们使用PhiPhiLux-G₂D₂衬底工具包(OncoImmunin公司,医学博士,美国)。短暂,衬底耦合半胱天冬酶3的荧光团和裂解时,荧光可以被探测到,测量并分析了(激发和发射峰是552和580 nm,职责)。

3所示。结果

3.1。的生活形态和分子描述成肌细胞和肌管

我们首先为特征的分化状态骨骼肌主要文化在这项研究中使用的表达特定分化标记。在6天的文化,单核细胞从野生型(图1(一)(左)和上部面板capn3不足(没有显示)老鼠均匀myogenin阳性(图1(一),左中面板)和阴性MHC(图1(a),左低面板)的信号,确定他们已分化成肌细胞。在文化11天之后,成为多核细胞(图1(a),右面板上部),myogenin染色强烈降低(图1(一)对介质板);相比之下,细胞表达MHC染色(图1(一)对降低面板)。因此,当时大多数成肌细胞融合成肌管,显示serum-induced进一步分化培养时间,因此对野生型和条件capn3老鼠不足(没有显示)。因此,在随后的单细胞Ca^{2 +}独立测量肌母细胞和肌管探测时表现出不同分化状态。

在第二组实验中我们分析capn3从正常和表达在成肌细胞和肌管capn3有缺陷的老鼠。rt - pcr进行RNA提取成肌细胞和肌管分化阶段,与特定的引物覆盖的地区capn3可变剪接(4]。只发现弱表达capn3有缺陷的细胞(数据没有显示;(6]),而它是存在于正常细胞在两个阶段。此外,这个细胞培养系统的分化过程伴随着calpain 3的表达模式的改变RNA亚型与可变剪接形式主要表达在未成熟的细胞(见MB道图1(b)和表1semiquantification)。

在兴奋收缩耦合现象,RyR释放Ca^{2 +}针对等离子体膜的去极化。以前的出版物报道RyR的乳沟94 kDa巯基蛋白酶为两个片段(375 kDa和150 kDa片段)7,15]。这劈理的结果在一个增强的Ca^{2 +}从老泡流出。我们对这种蛋白质在正常和免疫印迹capn3缺乏整体骨骼肌样品(图1(c)和表2semiquantification)。裂解碎片都得到样本表明calpain 3没有必要在整个肌肉和乳沟,最有可能不能参与处理Ca的结果^{2 +}在培养增殖释放RyR卫星细胞。

缺乏calpain 3是与细胞凋亡相关(5)显示增加的半胱天冬酶3活动(16]。劈理的分析荧光底物半胱天冬酶3进行专门的细胞成肌细胞阶段。图1(d)强调了半胱天冬酶3活动的显著提高calpain 3-deficient细胞相比,野生型细胞。半胱天冬酶3凋亡的标志,因此这个结果表明可能增加凋亡率当calpain 3缺乏小鼠成肌细胞。

3.2。Caffeine-Induced (Ca^{2 +}]_我增加隔离成肌细胞和肌管

咖啡因,最著名的阿诺定受体激动剂(17使用),在这项研究,以确保完整的20毫米激活RyRs的肌浆网(SR) [18,19]。(Ca^{2 +}]_我释放咖啡因测试在成肌细胞和肌管从野生型(+ / +)和培养capn3不足(−−)老鼠(图2)。休息(Ca^{2 +}]_我水平的细胞类型+ / +和−−老鼠没有显著变化(103±4海里;= 187)。本地咖啡因应用程序后,+ / +肌母细胞显示一个(Ca和缓慢增加^{2 +}]_我,3分钟后达到顶峰的咖啡因应用和衰变缓慢,甚至在咖啡因(图中被淘汰了2(一个))大概确认Na的出现在这个阶段⁺/ Ca^{2 +}换热器在质膜级(20.]。细胞的数量对咖啡因在这些细胞类型总结在图3(一个)。36 + / + 32的成肌细胞显示(Ca的增加^{2 +}]_我后的应用咖啡因。没有(Ca^{2 +}]_我反应观察咖啡因对于重复应用程序(数据未显示)即使咖啡因很快起飞。相比之下,+ / +肌管展出一个常数,重复和可再生的增加(Ca^{2 +}]_我经过短暂(30岁)和重复的应用咖啡因(图2 (b))。的平均峰值振幅(Ca^{2 +}]_我反应是绘制在图3 (b)。相比之下,−−/肌母细胞没有表现出(Ca^{2 +}]_我全身反应咖啡因在绝大多数的细胞(图2 (c)和图3(一个);71)66个细胞。一个很小的反应是观察到71年只有5个细胞(图3(一个))。+ / +肌管相比,累进脱敏的Ca^{2 +}]_我应对重复观察咖啡因应用(3分钟)在−−肌管(图2 (d))。此外,引起的反应的峰值振幅连续3投20毫米咖啡因在−−/肌小管明显低于野生型:60%,分别减少75%和90%,(n= 12;图3 (c)对比图3 (b))。

3.3。咖啡因和注册会计师对Ca^{2 +}]_我在孤立的成肌细胞和肌管从野生型(+ / +)和capn3-Deficient(−−)老鼠

然后,我们比较了注册会计师可以同咖啡因的影响。注册会计师是一个强有力的抑制剂的肌浆网钙(SR)^{2 +}atp酶(21,22)和诱发Ca^{2 +}从内部Ca动员^{2 +}商店,优先消耗敏感的商店(23]。在+ / +肌母细胞会计师(10米)诱导增加(Ca^{2 +}]_我低得多的振幅(图4(一)引起的,对峰值)比之前接触咖啡因(图4(一);左峰值)。测试+ / +肌管,咖啡因和注册会计师诱导类似(Ca^{2 +}]_我增加,峰值振幅明显高于(图4 (b))比成肌细胞中观察到这两种药物(图4(一))。人对咖啡因的反应之间的差异发现,注册会计师在+ / +成肌细胞和+ / +肌管被发现显著(;数据5(一个)和5 (b)。

有趣的是,在capn3有缺陷的细胞(−−),Ca^{2 +}]_我人对咖啡因的反应和注册会计师(人物截然不同4 (c)和4 (d)参数的测试。首先,正如已经见图2 (c),Ca^{2 +}应对咖啡因在−−肌母细胞完全缺席(图4 (c)留下痕迹),小的振幅在−−肌管(图4 (d)正确的跟踪)。相比之下CPA诱导显著(Ca^{2 +}]_我上升/−−肌母细胞(图4 (c)对峰值),但一个小得多的增加/−−肌管,即使注册会计师之前应用咖啡因(图4 (d)左峰值)。不同的峰值振幅(Ca^{2 +}]_我反应是量化和总结在图5。

3.4。外部Ca的影响^{2 +}Ca的浓度和^{2 +}老渠道在质膜上^{2 +}释放

(Ca^{2 +}]_我咖啡因引起的反应也在低Ca进行测试^{2 +}EGTA-buffer调查依赖外部Ca^{2 +}在肌管从野生型和获得capn3不足(−−)老鼠。事实上,细胞外钙^{2 +}不明显影响(Ca^{2 +}]_我20毫米咖啡因引起的反应在+ / +肌管(结果未显示)。然而,一个主要的减少(Ca^{2 +}]_我反应观察咖啡因在−−肌管,在缺乏细胞外钙^{2 +}(结果未显示)。

接下来的实验设计旨在剖析RyR和Ca之间的功能互动^{2 +}渠道成肌细胞的质膜和野生型和肌管capn3不足(−−)老鼠。在这方面,我们我们的研究集中于肌管,因为−−/肌母细胞出现对咖啡因。我们受到肌管连续接触咖啡因,在没有或存在特异性的Ca^{2 +}通道阻滞剂(即。,100年的混合物M Cd^{2 +}和50M NiCl₂)。没有一个Ca^{2 +}影响通道阻滞剂(Ca^{2 +}]_我咖啡因引起的响应+ / +肌管(数字6(一)和6 (b))。与此形成鲜明对比的是,Ca^{2 +}通道阻滞剂显著降低(Ca^{2 +}]_我咖啡因引起的反应在−−肌管(数字6 (c)和6 (d))。值得注意的是,在Ca的抑制^{2 +}条目(数据6(一)和6 (c)),基线增加进一步表明有一个Ca^{2 +}返回在两种类型的细胞。然而,第四和第五咖啡因的相对振幅之间的应用程序仍然不同+ / +和−−肌管。此外,后开始Ca的抑制^{2 +}条目(图6 (c)),基线降低进一步表明本构Ca^{2 +}进入−−/肌管。此外,在另一组实验中,各种更具体的拦截器检查的影响,其中最重要的Ca^{2 +}频道子型受体阻滞剂,如nicardipine (l型拦截器),ωGVIA-N-type,ωMVIIC / MVIIA-a P / Q型、omega-Aga-IVA (P / Q型拦截器),和snx - 482(异形战机拦截器)。有趣的是,只有nicardipine Ca 800海里明显阻塞^{2 +}咖啡因引起的反应在−−肌管(控制:568±32 nM;nicardipine: 102±25海里;n= 4;)表明响应不能直接由咖啡因敏感通道。

4所示。讨论

钙蛋白酶家族的Ca^{2 +}端依赖半胱氨酸蛋白酶(评论文章,请参阅[1- - - - - -3])的成员,表示无所不在地(钙蛋白酶1和2)或组织方式(calpain 3骨骼肌特定的同种型calpain 3发现镜头)。除了Ca^{2 +}离子,无处不在的钙蛋白酶的激活可以调制与30 kD的小单元,或与膜,自我分解的n端,或calpastatin,特定的抑制剂。其功能的肌肉已经受到了越来越多的兴趣,因为发现无处不在的钙蛋白酶的激活和浓度是杜氏肌萎缩症的小鼠模型中增加(mdx老鼠)。此外,蛋白质降解是mdx增强肌肉(24),认为增加退化导致高架Ca^{2 +}营养不良的肌肉内的现有水平。钙蛋白酶的基质膜相关细胞骨架蛋白,质膜Ca^{2 +}atp酶和离子通道蛋白。有趣的是,Ca^{2 +}泵位于质膜是一种首选的衬底的calpain红细胞(25]。如果在dystrophin-deficient肌肉受损,这种calpain行动,除了引发过多的Ca^{2 +}涌入,打扰一个重要挤压路径。钙蛋白酶在正常组织被认为发挥监管作用。因此认为,在营养不良的过程中,缺乏钙蛋白酶的影响会导致代谢途径而不是肌肉蛋白质水解。钙蛋白酶分裂基板在受限制的地方(3),不太可能参与调解主要辅助降解功能。因此,目前的证据支持在异常高calpain活动肌肉萎缩症通过具体的监管机制的破坏肌肉,而不是通过增加非特异性蛋白水解作用。

在本研究中我们使用鼠标的主要文化从正常和骨骼肌capn3−−/老鼠最近在Genethon生成。理查德的实验室。Capn3缺乏小鼠完全肥沃的和可行的,显示出轻微的肌肉萎缩症影响特定的肌肉群。肌肉表现类似的凋亡和扰动的影响,有趣的是,我的B {kappa}{α}/ NF - B {kappa}途径见LGMD2A患者(5),capn3有缺陷的小鼠(6]。

的可用性骨骼肌细胞从正常的主要文化capn3−−/老鼠提供了一个机会来解决在不久的将来,上游和下游的事件发生在导致(Ca^{2 +}]_我从正常和成肌细胞和肌管capn3−−老鼠。值得注意的是,有可能是calpain 3作为反馈调节器在骨骼肌细胞钙稳态RyR施加一个动作。后者,也称为Ca^{2 +}SR的释放通道,是一个关键的蛋白质参与兴奋收缩偶联。它的活动是由一个94 kDa的交界SR膜巯基蛋白酶RyR专门开辟一个站点。这种分裂导致增强的Ca^{2 +}老射流从囊泡(7,15]。

重要的是,在我们的手中calpain 3似乎不需要体外骨骼肌的乳沟。的乳沟RyR没有calpain 3(阳性)可能是由于calpain 1或2,广泛表达于所有细胞类型。这些钙蛋白酶的活性可能确实是多余的。评估ryanodine-sensitive内部Ca的活动^{2 +}商店,我们应用咖啡因刺激,咖啡因是一个著名的RyR活化剂(17]。

咖啡因的效果在正常肌管相比,成肌细胞显示出成熟的RyR信号在文化融合的过程。重要的是,成肌细胞和肌管capn3−−/老鼠显示弱振幅的caffeine-induced Ca^{2 +}]_我瞬变比正常细胞,这可能表明较低的SR Ca^{2 +}加载状态KO骨骼细胞,减少数量的RyR SR膜表面,或减少这些受体的敏感性,但独立于任何乳沟calpain 3。

虽然注册会计师,一种化合物耗尽内部Ca^{2 +}商店(26),诱发(Ca的增加^{2 +}]_我在所有条件下测试,看来这些反应较弱capn3−−/肌管相比,野生型肌管,加强SR Ca的假设^{2 +}负荷减少capn3−−/肌管或表明SR Ca^{2 +}atp酶或低表达或少敏感KO肌管的拦截器。CPA反应野生型肌母细胞和肌小管之间的差异很可能由于SR的大小变化与细胞的大小的变化在文化融合中,肌管面积较大。

咖啡因被认为直接激活RyR SR膜,导致这个通道的开放和Ca的释放^{2 +}从老细胞溶质,独立于任何Ca^{2 +}通过质膜流入。细胞外钙较低的事实^{2 +}和阻断剂的低成本航空公司取消caffeine-induced (Ca^{2 +}]_我增加−−/肌管表明RyR开放和SR Ca^{2 +}释放导致Ca^{2 +}通过低成本航空公司仅在KO肌管流入。从胞质钙^{2 +}众所周知,负调控这些频道(失活),释放SR不足以唤起开放的去极化使低成本航空公司(27),最有可能是一个额外的通道在质膜诱发的去极化反应caffeine-evoked (Ca^{2 +}]_我增加−−/肌管。

最后,另一个可能性是,缺乏calpain 3导致减少RyR对咖啡因敏感,可能涉及监管翻译后成熟的受体,因此独立于任何功能RyR的乳沟。值得注意的是RyR包含许多内源性胞质域半胱氨酸的蛋白质。因此,绑定的咖啡因其网站的胞质面RyR需要激活细胞外的RyR Ca^{2 +}条目以引起适当的受体。

综上所述,获得的结果在−−肌管指示:(i)减少SR负载,(ii) RyR信号的改变,(iii)(即增加了LCC活动。,本构^{2 +}条目),但(iv)的基底细胞内并没有增加^{2 +}浓度。Ca的主要系统^{2 +}从胞质挤压Na⁺/ Ca^{2 +}换热器,很容易推测,在换热器的活动可以增加(更高的蛋白表达和/或更高的离子流)在KO细胞维持Ca的水平^{2 +}的细胞。然而,这将是另一个特定的调查。

总之,通过使用一个淘汰赛的策略,我们可以诱导小鼠骨骼肌萎缩症由于缺乏calpain 3,因此画一般的细胞通路参与了这种疾病。LGMD2A萎缩症的特点是(我)增加半胱天冬酶3活动,(ii)的管制途径导致细胞凋亡(5,16),(3)膜透性的增加,(iv)的大小减少SR和v) RyR信号的功能障碍。事实上,我们的药理研究了Ca机制更多的光^{2 +}改造失败的骨骼肌,我们提出一个重大的监管作用capn3在SR Ca^{2 +}释放,可能由增加LCC参与Ca^{2 +}进入弥补老功能的改变。此外,calpain-dependent蛋白水解作用可能不仅参与RyR渠道本身的规定,而且在激活的分裂RyR辅助蛋白质形成RyR1多复杂。

感兴趣的,我们组的最近的研究显示,不是calpain 3,但是-calpain兴奋收缩(Ca的现象是很重要的^{2 +}全身)在正常和解偶联capn3−−/骨骼肌纤维(28),这表明不同钙蛋白酶的活动和功能的模式相当复杂,每个calpain似乎扮演了一个非常具体的在Ca的规定和定义的角色^{2 +}信号。

确认

作者感谢Drs。基思•兰利蒙彼利埃、法国和詹姆斯·达特IEM CR,布拉格,捷克共和国,批判阅读和语言编辑的手稿。作者也要感谢先生将Veen (WillCo井帐面价值,一个msterdam, NL) for his generous gift of glass-bottom cover dishes for Ca^{2 +}测量实验。这项工作是s . b .的赠款支持“法语协会反对肌病”。第一作者是支持的日本社会奖学金计划(没有促进科学邀请。2004 & FY2008;s - 08216)。g . Dayanithi”de矫揉造作的盟CNRS-France说话”。

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