Y-Box结合蛋白-1的n端结构域通过与Cyclin D1结合诱导细胞周期阻滞在G2/M期

抽象的

Y盒结合蛋白YB-1是参与细胞增殖，转录和翻译的调控的多功能蛋白。我们以前的研究表明，DT-40细胞中的一个等位基因的破坏导致细胞周期中的主要缺陷。在杂合突变体中看到的异常可归因于破坏的YB-1等位基因产物施加的显性负效应。为了测试该假设，YB-1的N-末端序列与天平腺炎和绿色荧光蛋白的第三螺旋融合。将这些纯化的融合蛋白引入大鼠肝癌细胞中，研究了它们对细胞增殖的影响。结果表明，YB-1蛋白的N-末端77氨基酸结构域诱导细胞在细胞周期的G2 / M期中被捕并经历凋亡。额外的缺失分析表明，只要Yb-1的N-末端的26个氨基酸少量可能导致这些表型变化。我们进一步证明，该N-末端77氨基酸结构域在细胞周期的G2 / M期的细胞中细胞质中的Cytoplasm序列D1。我们得出结论，YB-1的N-末端结构域通过细胞周期的G2 / M期对细胞周期进展发挥着重要作用。

1.介绍

Y-box结合蛋白是冷激结构域(CSD)超家族蛋白的成员[<一个href="#B1">1］．他们参与转录的调节[<一个href="#B2">2那<一个href="#B3">3.，翻译的变调[<一个href="#B4">4.]，DNA修复[<一个href="#B5">5.]和耐药性[<一个href="#B6">6.-<一个href="#B8">8.]，对细胞外信号的应激反应[<一个href="#B9">9.那<一个href="#B10">10.和在胚胎发生的早期阶段[<一个href="#B11">11.那<一个href="#B12">12.］．几项研究还表明与静态或非增殖细胞相比，增殖细胞中YB-1蛋白水平的上调升压[<一个href="#B1">1那<一个href="#B13">13.］．YB-1激活了许多与细胞增殖有关的基因，包括DNA聚合酶α.［<一个href="#B14">14.]、增殖细胞核抗原(PCNA) [<一个href="#B15">15.那<一个href="#B16">16.，胸苷激酶和拓扑异构酶II [<一个href="#B15">15.那<一个href="#B17">17.］．然而，不明白YB-1促进细胞增殖的机制。

已经进行了淘汰赛，以获得洞察yb-1在细胞增殖中的功能。我们以前展示了针对的中断在DT-40细胞中，鸡YB-1基因的一个等位基因末端导致了主要的细胞周期缺陷，包括加倍时间变慢、基因组DNA含量增加、细胞大小增加和部分细胞群凋亡[<一个href="#B18">18.］．相比之下，另一个团体发现YB-1^+/-杂合突变体未表现出明显的生长缺陷，而YB-1突变体则表现出明显的生长缺陷^-/-细胞表现出明显减少的生长表型[<一个href="#B19">19.］．有针对性的破坏YB-1等位基因末端使小鼠胚胎干细胞对顺铂和丝裂霉素C更敏感，且无任何明显生长缺陷[<一个href="#B20">20.］．此外，shRNA下调YB-1导致增殖率显著降低，凋亡率增加[<一个href="#B21">21］．这些研究表明YB-1的氨基末端可能参与了细胞增殖。YB-1在细胞增殖中的明确作用已通过敲除小鼠中YB-1的两个等位基因得到证实[<一个href="#B12">12.］．这些小鼠是胚胎致死的，表明YB-1在早期胚胎发育中具有非多余的作用。进一步研究YB1^-/-成纤维细胞增殖大大减少，细胞形态发生改变，表明YB-1在细胞增殖中起关键作用[<一个href="#B12">12.］．

在我们早期的研究中[<一个href="#B18">18.我们推测，在DT-40细胞中观察到的改变的表型可能是由于由破坏的YB-1等位基因编码的推定截短的蛋白质施加的显性负效应。如果这种假设是正确的，则将YB-1的N末端结构域引入细胞中应该模拟突变体DT40细胞中观察到的表型变化[<一个href="#B18">18.］．因此，我们构建了表达对应于YB-1的N-末端的26或77个氨基酸多肽序列的克隆。我们还制造了内部缺失，除去了YB-1的N-末端77氨基酸的丙氨酸和富含脯氨酸的序列。这些多肽与antiNapedia同源域融合，其促使受体将蛋白质的受体与细胞中的摄取和记者绿色荧光蛋白（GFP）融入，以监测蛋白质的摄取和细胞定位。将这些融合蛋白引入大鼠肝癌细胞，并研究了研究的对细胞生长的影响。我们的结果清楚地表明了Yb-1在细胞增殖中的作用，该蛋白酶增殖中由Yb-1的N-末端结构域介导的，可能是通过在细胞质中的螯合细胞周期蛋白D1沉积，从而阻止来自G2 / m的细胞周期进展。

2.材料和方法

抗体和试剂
所有的化学试剂，除非另有说明，都来自Sigma-Aldrich(圣路易斯，MO)。细胞培养基为Invitrogen-GIBCO (Carlsbad, CA)。YB-1多克隆抗体由Sigma为我们实验室制备。一抗和荧光标记的二抗来自Invitrogen-Molecular探针(Carlsbad, CA)。

apgfp融合蛋白的克隆与表达
我们在实验室对pUC9载体进行了修饰，在框架中克隆了YB-1的三条序列，上游编码16个氨基酸长触角同源结构域(AP)，下游编码GFP(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig2/" target="_blank">2(a))。将3个克隆APYB77GFP、APYB36GFP、APYB26GFP和缺少YB-1序列的对照克隆APYB26GFP转化大肠杆菌BL21DE3细胞。用1 mM IPTG诱导对数相培养过夜，纯化蛋白。

纯化蛋白质
如所述分离和溶解包容体，如[<一个href="#B22">22]如描述的，在4℃下使用DEAE Sephacel离子交换色谱法从上清液中进一步纯化融合蛋白。<一个href="#B23">23］．在0.3 M NaCl洗脱的馏分中检测到预期的融合蛋白。将这些馏分用四种不同的TNG缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl和5%甘油)透析过夜。蛋白质的纯度是通过在15% SDS-PAGE凝胶上运行三次，然后考马斯氏染色或银染色和GFP抗体的western blotting来确定的。用BCA蛋白检测试剂盒(Pierce- Rockford, IL)测定蛋白浓度。

细胞的同步和治疗
大鼠肝癌细胞（ATCC-H-411E）在补充有10％FBS，100u / mL青霉素和100的最低基本培养基中生长 g/mL链霉素，保持在37°C和5%的湿培养箱中．每天喂食的细胞以1:5的比例传代，使用0.05%胰酶- edta。为进行实验分析，细胞与40g/mL的纯化蛋白。双胸腺嘧啶阻断用于G1细胞的同步化，如所述[<一个href="#B24">24］．对于G2/M期同步细胞，用1 ~ 2.5孵育g/mL诺可达唑14 ~ 24小时。

免疫印迹
按照已公布的方案，用RIPA缓冲液清洗和裂解细胞[<一个href="#B25">25］．细胞核和细胞质部分，每100个细胞刮取冰冻PBS, 500 g离心5分钟。细胞颗粒重悬100次L Buffer A (50 mM NaCl, 10 mM HEPES pH-8.0, 500 mM蔗糖，1 mM EDTA, 0.2% Triton-X-100，新鲜添加蛋白酶抑制剂和7 mM-巯基乙醇)，高速旋转45秒，2000 g 4°C离心2分钟。所得上清液用作细胞质提取物。该颗粒在100分钟内重新悬浮l缓冲B（缓冲液A具有25％甘油和0.1mM EDTA），在4℃下以2000g沉淀2分钟。将颗粒溶于50 l缓冲液C（带350mm NaCl的缓冲液B），在冰上孵育30分钟，间歇高速涡旋，在4℃下以11000g旋转15分钟。将上清液稀释至100 L，作为核提取液。等量样品在SDS-PAGE凝胶上分析。1:使用7500稀释的抗兔GFP抗体作为一抗，4℃过夜。用1∶15000稀释酶标抗兔IgG作为二抗，室温孵育2小时。根据制造商的协议，使用化学发光试剂盒(Pierce, Rockford, IL)进行印迹。

免疫沉淀
等量的全细胞裂解液或细胞核和细胞质提取物稀释至500L用裂解缓冲液，并在4℃下与1：2000稀释的细胞周期蛋白A，B1，D1 D2和GFP抗体孵育过夜。向每个样品中加入等量的蛋白质甲藓珠粒（Amersham Biosciences-Piscataway，NJ），并在室温下温育2小时。将珠子以8000g沉淀到8000g 4分钟，用裂解缓冲液洗涤沉淀物两次。将所得颗粒重悬于样品缓冲液中并加载到SDS-PAGE凝胶上。

免疫细胞化学和间接免疫荧光
用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞2次，固定15分钟。有4%的人p-甲醛，用PBS洗两次，4°C保存。用5%山羊血清和3% BSA在PBS中阻断细胞30分钟。用PBS冲洗三次。然后用一抗抗兔GFP(1:50 0)或抗兔YB-1(1:30 0)和anti - ouse cyclin D1(1:30 0)孵育细胞3小时，然后用PBS冲洗几次。随后用二抗FITC标记的抗兔IgG(1:50 0)和Texas-Red标记的抗鼠IgG(1:50 0)在室温暗室中孵育细胞1小时。用PBS洗涤几次，用水洗涤一次以除去任何盐分，并在无光下风干45分钟。用含有DAPI (Vector Laboratories-Burlingame, CA)的Vectashield安装介质将盖玻片固定在玻片上，对细胞核进行反染色。幻灯片储存在直到显微镜分析。

共焦显微镜
在LSM 510激光扫描三色显微镜(德国耶拿卡尔蔡司)上，利用75%输出的氩气激光和激发波长分别为488 nm和543 nm的HeNe1激光进行共聚焦成像。光学切片厚度设置为0.3M，放大到40切片大约在细胞的中间高度水平。每次实验的光电倍增管增益和激光功率相同。Axioplan 2荧光显微镜(德国蔡司)可见凋亡泡。DAPI荧光是用63显微镜的放大镜。AxioVision软件用于捕获ZVI堆栈的图像。使用对照核进行曝光并为每个实验固定。为每个实验评分至少100个染色细胞。在Adobe Photoshop 5.0（San Jose，CA）中，分析并调整了所有图像。

DNA碎片化
将指数较长的细胞与融合蛋白一起温育24,48和72小时。如所述分析DNA碎片分析[<一个href="#B18">18.］．

流式细胞仪分析
通过胰蛋白酶化或在冰上刮擦细胞并在500g下造粒5分钟。用PBS洗涤它们，用冰冷的70％EtOH固定，在冰上温育45分钟，并以500g离心5分钟。用含有1％BSA的HANKS平衡盐溶液（HBSS）洗涤沉淀，重悬于碘化钛缓冲液（1：1在HBSS和1mg / mL RNase A中稀释20μg/ mL）中，并孵育30分钟37°C水浴。使用Becton Dickinson Facs Calibur分析样品。对于凋亡细胞分析，根据制造商的议定书使用适用的Anexxin V-FITC套件（南生物技术助理公司，伯明翰，Al）。通过适当的前向和光散射门控从FACS分析中排除细胞碎片。分析细胞周期轮廓，并使用Microsoft Excel绘制条形图。

3.结果

3.1。APYBGFP和APGFP融合蛋白在细胞内部化和稳定

早些时候，我们在DT-40细胞中破坏了YB-1基因的一个等位基因，并观察到严重的细胞周期缺陷[<一个href="#B18">18.］．我们提出，这种效应可能是由于外显子1编码的富含脯氨酸的多肽被截断，并由中断的等位基因产生。为了测试假定的截断蛋白是否与之前的观察结果有关，我们开发了一个包含YB-1的77个氨基酸末端的表达盒，插入16个氨基酸触角肽和一个GFP报告蛋白之间。这些克隆的氨基酸序列如图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig1/" target="_blank">1（a）．此构建体将被称为APYB77GFP（图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig1/" target="_blank">1（a）画线)。另外两个包含YB-1的26个n端氨基酸(APYB26GFP)的融合体和一个内部缺失的克隆，从YB-1的77个n端氨基酸(APYB36GFP)中去除富含丙氨酸-脯氨酸的序列(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig1/" target="_blank">1 (b)图纸行)。经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，这些融合蛋白的同源性达到80%以上，蛋白质印迹(western blotting)证实了它们的大小(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig1/" target="_blank">1 (b))．

为了证明触角肽能指导YB-1融合蛋白的细胞摄取，我们用40G / ml每种蛋白质为3和18小时。使用抗GFP抗体通过蛋白质印迹制备细胞提取物并分析。结果显示在图中<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig2/" target="_blank">2表明融合蛋白早在3小时内被内化(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig2/" target="_blank">2（a），泳道标记为l）并继续累积至少18小时（图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig2/" target="_blank">2)．此时超过80％的细胞占据了融合蛋白，表明天平肽肽允许细胞有效地占用蛋白质（见图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig3/" target="_blank">3.）通过从大鼠主动脉平滑肌（Rasm）分离的原代细胞获得了类似的结果（数据未显示）。这些结果表明融合蛋白容易被肿瘤和原代细胞内化。

３．２．YB-1的n端结构域负责细胞质定位

在证明了所有蛋白质的内化后，我们接着研究了这些蛋白质在细胞内的定位。细胞与融合蛋白孵育3或18小时，并准备共聚焦显微镜。结果显示，在18小时内，80%以上的细胞已经吸收了这些蛋白。APGFP不含任何YB-1序列，分布于整个细胞，即细胞核和细胞质中(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig3/" target="_blank">3(一个)面板a和e）。这可能是因为除非包括特定的定位信号，否则单独的GFP可以分发所有细胞（在[<一个href="#B18a">26]）或者细胞穿透抗环结部分部分可能是通过细胞质和核膜转移GFP的负责。相反，三个Yb-1融合蛋白的孵育表明，在3和18小时，大多数蛋白质仅在细胞质中定位（图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig3/" target="_blank">3(一个)，面板B和D，C和E，以及F和H）。这些结果表明YB-1的氨基末端将融合蛋白限制为细胞的细胞质。

通过免疫印迹分析进一步证实了这一点。通过使用抗GFP抗体的免疫印迹分析分析大鼠肝癌细胞的核和细胞质提取物。这些研究表明，甚至在18小时后，仅在细胞的细胞质提取物中检测到APYBGFP融合蛋白，而在核和细胞质提取物中检测到APGFP（图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig3/" target="_blank">3 (b))．不到2 - 3%的内化APYBGFP蛋白在细胞核中被发现，而在对照APGFP中，到18小时时在细胞核中被检测到高达30 - 40%。我们的结论是，YB-1的n端氨基酸序列在融合蛋白中的存在是其在细胞质中定位受限的原因。

３．3.APYBGFP蛋白孵育的细胞在细胞周期的G2/M期停滞

在证明了氨基末端YB-1多肽进入细胞后，我们想知道这些YB-1多肽是否会诱导细胞周期缺陷，类似于我们之前在YB-1破坏的杂合突变体DT-40细胞中观察到的缺陷[<一个href="#B18">18.］．细胞与这些融合蛋白分别孵育24、48和72小时。半数细胞用碘化丙啶染色，流式细胞仪检测DNA含量。我们的结果表明在与APYB77GFP孵育72小时后，将32％的细胞在细胞周期的G2 / M期中被捕（图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig4/" target="_blank">4.）当APYB26GFP诱导超过24％的细胞，以在相同的72小时孵育后累积为G2 / m（图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig4/" target="_blank">4.)．相反，只有约10％APYB36GFP孵育的细胞在G2 / m中（图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig5/" target="_blank">5.)，这与apgfp孵育的细胞非常相似，只有不到6%-8%的细胞处于G2/M期(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig4/" target="_blank">4.)．这些结果表明，YB-1的n端序列可能参与了细胞从G2/M向G1的发展过程，该n端序列含有丰富的丙氨酸-脯氨酸结构域。

为了证明G2/M期的阻滞不是由于融合蛋白摄取的差异，剩余的一半样本用于定量GFP阳性细胞中的平均GFP荧光。结果如图所示<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig4/" target="_blank">4 (b)表明，所有融合的GFP阳性细胞的百分比相似。此外，在不同融合蛋白的平均GFP荧光中没有观察到差异。这些结果表明APYBGFP - 孵育细胞中的细胞周期停滞不是由于融合蛋白阳性细胞数或内化蛋白的量的变化，而是由于Yb-1 N-末端序列的存在。此外，该数据在细胞周期的G2 / M期的细胞中清楚地暗示YB-1的N-末端。

3．4．YB-1的氨基端参与调控细胞凋亡

早些时候我们在杂合突变体DT-40细胞中展示了凋亡，并推测这可能是由于缺陷等位基因编码的电位截短蛋白的显性负效应<一个href="#B18">18.］．随后另一组报道YB-1下调导致细胞凋亡率增加，表明YB-1水平与细胞凋亡有直接关系[<一个href="#B20">20.］．基于这些观察结果，我们假设YB-1的N-末端参与调节细胞凋亡。

为了验证YB-1的n端调控细胞凋亡的可能性，我们进行了实验，利用荧光素偶联膜联蛋白V和DNA片段检测细胞表面磷脂酰丝氨酸的存在，这两者都是细胞凋亡的标志。细胞与融合蛋白共孵育24、48和72小时，半数细胞用膜联蛋白V染色并采用流式细胞仪分析。我们的结果表明，在apgfp培养的细胞中，在72小时的培养后，不到1 - 2%的细胞凋亡(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig5/" target="_blank">5(一个))．相反，与APYB77GFP培养刺激22-23％的细胞，以至于72小时的膜蛋白V阳性。使用APYB26GFP-孵育的细胞获得了类似的结果（图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig5/" target="_blank">5(一个))．相比之下，APYB36GFP在导致细胞凋亡方面效果较差。同样，从GFP阳性细胞的数量和它们的平均GFP荧光值可以看出，这些蛋白质的摄取具有可比性(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig5/" target="_blank">5（c）)．这些结果清楚地表明，YB-1 n端富含丙氨酸-脯氨酸的26个氨基酸是YB-1主要死亡域的一部分。

DNA片段分析进一步证实了上述结果。用琼脂糖凝胶电泳分析不同时期与融合蛋白孵育的细胞的DNA。可以看出，用含有融合蛋白的YB-1处理的细胞的DNA，可以清楚地看到DNA片段的模式，如图180-200 bp的阶梯的出现所示(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig5/" target="_blank">5（b）)，而不是与对照融合蛋白APGFP孵育的细胞。此外，用DAPI对细胞核进行染色，发现在APYBGFP蛋白处理72小时的细胞中染色质凝结和细胞核破裂，但在apgfp孵育的细胞核中却没有，细胞核外观正常(见补充材料图S1，可在doi: 10.155/2009/243532上获得)。基于这些结果，我们认为YB-1的氨基末端参与了细胞凋亡。

3.5。YB-1与细胞周期蛋白D1的末端域的相互作用

有研究表明YB-1调控G2/M期细胞周期蛋白A和B1的转录[<一个href="#B26">27］．由于cyclin D1在细胞周期的G2期通过ras介导的mRNA翻译控制上调，并且由于它在细胞核内的定位对细胞周期进展非常重要，我们想知道YB-1是否与这些细胞周期特异性的细胞周期蛋白相互作用。为了研究这种相互作用，我们用细胞周期蛋白A、B1、D1和D2的抗体免疫沉淀大鼠肝癌细胞全细胞提取物，并检测YB-1的存在。我们的结果清楚地表明YB-1主要与cyclin D1相互作用，因为这是在下拉检测中观察到的主要条带(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig6/" target="_blank">6（a）)．我们观察到细胞周期蛋白B和D2在G2中也上调。为了证明这种相互作用不是由于所使用的蛋白质提取方法造成的，我们对从非同步和诺考达唑处理的培养物中分离的提取物进行了免疫沉淀。如预期的那样，诺考达唑在G2/M中阻断了细胞(补充图S2)。由于抗cyclin D1抗体拉低了nocodazole处理的细胞提取物中的YB-1，这表明YB-1与cyclin D1相互作用。使用抗YB-1抗体进行交互实验，证实YB-1确实与cyclin D1结合(补充图S3)。

为了研究YB-1和cyclin D1是否在细胞周期的不同阶段共定位，我们使用共聚焦显微镜分析了它们在G1/S和G2/M期同步细胞中的分布。我们观察到在异步和G1/S期同步的细胞中YB-1主要是胞质(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig6/" target="_blank">6（b），面板a和d）而细胞周期蛋白d1主要是核（图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig6/" target="_blank">6（b），面板C和面板F)与最小的共同本地化(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig6/" target="_blank">6（b），面板b和e）。然而，在G2 / M相封闭的细胞中，Yb-1和细胞周期蛋白D1主要是在细胞质中的部分共同定位（图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig6/" target="_blank">6（b），面板g，h和i）。

为了证明这种共定位是由于YB-1和cyclin D1之间的特异性相互作用，我们使用特异性抗血清对分离的细胞核和细胞质提取物进行免疫沉淀(补充图S3A和S3B)。anti- cyclin D1和anti-YB-1分别从细胞质中下调cyclin D1和YB-1，表明这两种蛋白确实分别位于细胞核和细胞质中。然而，在诺可达唑处理的细胞中，阻滞在G2期，cyclin D1抗体从细胞质中拉低YB-1，反之亦然。如预期，诺考达唑在细胞周期的G2/M期阻断了大部分细胞(补充图S2)。我们推断YB-1和cyclin D1在G2期细胞的细胞质中相互作用。有趣的是，当使用PI-3激酶和Akt通路的抑制剂Wortmannin时，可以在细胞核中检测到大量的cyclin D1(补充图S4)。这表明YB-1和cyclin D1之间的相互作用依赖于其中一个或两个蛋白的磷酸化。需要进一步的实验来确定磷酸化位点。

3.6。YB-1 n端结构域与Cyclin D1在G2/M期阻滞细胞中的相互作用

为了确定YB-1的氨基端是否与cyclin D1相互作用，我们将不同步的全细胞提取液和用nocodoole同步的G2/M期细胞提取液与GFP抗体孵育并检测cyclin D1。以抗yb -1免疫沉淀的Cyclin D1作为阳性对照。免疫沉淀APGFP培养的细胞作为阴性对照。在不同步的细胞中未观察到Cyclin D1免疫沉淀(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig6/" target="_blank">6 (c))．然而，在Nocodazole阻断的细胞中，在3小时和18小时的时间点，用APYB26GFP和APYB77GFP共沉淀细胞周期蛋白D1（图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijcb/2009/243532/fig6/" target="_blank">6 (c))，而从apyb36gfp培养的细胞制备的免疫沉淀中不存在。由于异步培养也包含一些G2/M细胞，我们预计cyclin D1和YB-1之间会有一些相互作用，如图补充图S3B所示。我们还没有在不同步细胞中观察到这种与融合蛋白的相互作用。这可能是由于该技术的敏感性，或者内源性YB-1存在时的相互作用可能是掩蔽检测。然而，这些结果表明，YB-1富含丙氨酸-脯氨酸的n端序列可能在细胞周期G2/M期受阻时参与了细胞周期蛋白D1在细胞质中的隔离。YB-1融合蛋白将cyclin D1保留在G2/M期细胞的细胞质中，可能是这种融合对细胞周期进展和凋亡的影响。

4。讨论

YB-1表达与细胞增殖密切相关。例如，YB-1在再生型肝癌和肝癌中高表达，但在细胞静止的正常成人肝脏中几乎检测不到[<一个href="#B27">28那<一个href="#B28">29］．我们之前的研究表明，CHK-YB-1B基因的一种等位基因的破坏导致杂合DT-40突变体中的异常，包括较慢的生长速率和增加与细胞凋亡相关的基因组DNA含量[<一个href="#B27">28］．我们推测，所见的缺陷可能是由于被中断的YB-1等位基因编码的假定的n端被截断的蛋白质的显性负作用。如果我们的假设是正确的，那么引入与YB-1氨基端相对应的多肽应该模拟突变体DT40细胞中观察到的缺陷[<一个href="#B18">18.］．

抗环结肽肽被证明是所有细胞穿透肽的最有效且最低细胞毒性[<一个href="#B29">30.］．因此，熔化蛋白质在氨基末端将抗环结蛋白肽和羧基末端的报道GFP序列中携带的方式克隆Yb-1序列。我们在此报告，四种APGFP融合蛋白的内化以高效率在指数上生长的大鼠肝癌细胞中发生。对照蛋白质，不具有任何YB-1序列的APGFP分布在整个细胞 - 核和细胞质中。相反，Yb-1融合蛋白仅限于细胞的细胞质。由于APGFP分布在细胞上，因此YB-1部分似乎是对细胞质定位的原因。

YB-1 n端能够与细胞周期蛋白D1结合，并可能将其保留在细胞浆中，这可能是YB-1融合对细胞周期进展和凋亡的影响。Cyclin D1由Bcl-1基因编码，是一种推定的原癌基因，以往的研究表明，YB-1和Cyclin D1在许多肿瘤中均上调[<一个href="#B1">1那<一个href="#B30">31那<一个href="#B31">32］．虽然YB-1一般是一种细胞质蛋白，cyclin D1是一种核蛋白，但YB-1在G1期到S期中期存在于细胞核中[<一个href="#B26">27与cyclin D1相同。细胞周期蛋白D1在S期结束时转移到细胞质，进入G2期[<一个href="#B32">33那<一个href="#B33">34[当Yb-1也集中在细胞质中时。细胞周期的G2 / M期的细胞周期蛋白D1的水平对于细胞来说至关重要，以确定它们是否必须经历另一轮复制。

已经证明，细胞周期蛋白D1敲除小鼠胚胎存活约13天，然后死亡[<一个href="#B34">35］．从这些老鼠身上分离出来的细胞生长正常，尽管速度较慢。然而，在上皮细胞中，细胞周期蛋白D2弥补了细胞周期蛋白D1的缺失，表明这些细胞周期蛋白在细胞增殖中的重要性[<一个href="#B35">36］．细胞周期蛋白D1被认为是G1 Cyclin，因为其与CDK4 / 6的相互作用有助于RB蛋白的磷酸化，并且还螯合CDK抑制剂，这是细胞周期进展到S期所需的CDK抑制剂[<一个href="#B36">37］．

细胞周期蛋白D1的水平也在G2中增加，并在有丝分裂和G1中维持[<一个href="#B10">10.那<一个href="#B33">34那<一个href="#B37">38］．这一调控似乎是在转录后水平，表明细胞周期蛋白D1的从头合成发生在G2期。它的命运是由受体耦合Ras信号所决定的[<一个href="#B33">34那<一个href="#B36">37］．当Cyclin D1存在于G2中的细胞质中时，YB-1的氨基末端域螯合细胞周期蛋白D1并防止其进口到细胞核中。Yb-1的核转移需要在YB-1的CSD中的SER-102的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶Akt磷酸化[<一个href="#B38">39-<一个href="#B40">41］．这种磷酸化也诱导了几种细胞mrna的翻译[<一个href="#B41">42］．由于CSD和羧基末端酸性基本结构域缺失，因此通过全长内源性YB-1分子进行的许多功能被破坏。因此，与N-末端YB-1序列相互作用的细胞蛋白质影响下游信号，导致细胞损伤，使得G2中的细胞能够在P53中恢复或经历细胞凋亡的机会- 依赖途径[<一个href="#B24">24那<一个href="#B36">37］．本文提供的数据表明，YB-1和Cyclin D1之间的相互作用在调节细胞周期的G2 / M相处的Cyclin D1功能中起着关键作用。

cyclin D1的稳定和核积累依赖于PI3-K、Akt通路，而pi3可负调控GSK-3［<一个href="#B42">43，一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过调节mRNA转录和蛋白降解来调节细胞周期蛋白D1的表达。<一个href="#B42">43]）。细胞周期蛋白D1以及YB-1的磷酸化取决于PI3-K和AKT途径。磷酸化时的YB-1易于膨胀成核，在那里它直接诱导P110pi3 -激酶催化亚基[<一个href="#B38">39那<一个href="#B43">44］．类似地，细胞周期蛋白D1也由PI3-激酶，AKT和GSK-3调节（审核[<一个href="#B31">32]）。细胞周期蛋白D1对于细胞周期进展和从细胞质导出到核来说是重要的，对于G2 / M esit至关重要[<一个href="#B33">34］．正常情况下，细胞周期蛋白D1被输出到细胞质中，在那里它被泛素途径降解[<一个href="#B31">32］．

渥曼青霉素,PI3-kinase-Akt通路的抑制剂,刺激细胞周期蛋白D1的核本地化nocodazole-treated细胞,表明细胞周期蛋白D1 YB-1和之间的交互产生的胞质细胞周期蛋白D1的定位取决于YB-1磷酸化或细胞周期蛋白D1或两者兼而有之。已知YB-1在CSD中的ser 102被Akt和p90核糖体S6激酶磷酸化。这种磷酸化作用使YB-1穿梭于细胞核内，诱导PI3-K的转录110催化亚基[<一个href="#B38">39］．然而，在APYB77GFP和APYB26GFP中，这个磷酸化位点不存在，因此这个n端结构域隔离了周期蛋白D1，阻止其向细胞核移动。这可能导致细胞周期阻滞在G2/M。

已知YB-1与几种细胞蛋白质相互作用，包括参与DNA合成，DNA修复，转录和翻译的细胞蛋白。它还绑定到几个MRNA并抑制翻译[<一个href="#B41">42］．根据细胞类型和细胞周期阶段的不同，这些相互作用可能需要核易位和/或各种细胞因子的细胞质保留。众所周知，在G2/M阶段停止的细胞是不稳定的，在此期间，细胞的生存依赖于p53、p21、cyclins等几种蛋白质，这些蛋白质决定了细胞的命运，即是继续新一轮的细胞周期还是凋亡。当全长YB-1与适当的靶标结合并引起适当的反应时，细胞周期正常进行;然而，当n端序列与p53等蛋白质结合时[<一个href="#B44">45或cyclin D1，并将它们保存在细胞的不同区域，那么它就不能引起相同的反应，从而产生缺陷。

已经证明，在细胞周期的G2 / M期中封闭的细胞似乎是不稳定的并且经历凋亡[<一个href="#B32">33那<一个href="#B33">34那<一个href="#B45">46］．此外，已知在G2和Yb-1期间发生任何受损DNA的修复，并且在该过程中涉及。在我们的实验中，我们发现YB-1刺激细胞的N-末端区域在细胞周期的G2 / M期中被捕。Yb-1的N-末端的显性效果可能是由于YB-1通过与肌动蛋白结合调节中心体函数的能力[<一个href="#B46">47]和在丝分裂期间的Centroomes [<一个href="#B47">48］．对中心函数的抑制可以导致染色体不稳定性和动脉倍差[<一个href="#B45">46那<一个href="#B48">49，可能导致细胞周期阻滞和凋亡。我们的数据与之前的观察结果一致，表明YB-1 n端结构域在调控细胞增殖和凋亡中起着关键作用。

总之，在本报告中，我们在G2 / M相封闭细胞的细胞质中证明了Yb-1和Cyclin D1的共定位。此外，我们提出了Cyclin D1与融合蛋白APYB26GFP和APYB77GFP在G2 / M相封闭细胞中相互作用的证据。我们提出Yb-1与细胞周期蛋白D1结合并在细胞质中螯合。这使得细胞在细胞周期的G2 / M期中停留并保护细胞周期蛋白D1免于降解，这对于G2 / M出口很重要。由于这种异常被捕的逮捕，细胞变得不稳定并进行细胞凋亡。自节环蛋白D1免疫沉淀APYB77GFP和APYB26GFP，但不是APYB36GFP和与增加的细胞凋亡相关，因此可能通过丙氨酸和富含YB-1的N-末端的富含丙氨酸和富含脯氨酸的序列进行的相互作用。进一步的研究是阐明YB-1 / Cyclin D1相互作用的生理重要性，并精确识别该相互作用所涉及的结构域。

致谢

这项工作得到了印度苏瑟汉山生物技术有限公司的资金。我们感谢Drs。Rod Hori和Kui Li对稿件的批判性阅读，并为数字提供帮助。

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