IJCB 国际细胞生物学杂志》上 1687 - 8884 1687 - 8876 Hindawi出版公司 243532年 10.1155 / 2009/243532 243532年 研究文章 Y-Box绑定的n端结构域蛋白1诱导细胞周期阻滞于G2 / M期细胞周期蛋白D1 口 Payal Padala Mythili K。 考克斯 约翰 Guntaka Ramareddy V。 Bazett-Jones 大卫 分子科学部门 田纳西大学的健康科学中心 孟菲斯,TN 38163 美国 tennessee.edu 2009年 14 02 2010年 2009年 01 11 2009年 31日 12 2009年 2009年 版权©2009 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

Y-box结合蛋白YB-1是一种多功能蛋白参与细胞增殖,调节转录和翻译。我们之前的研究表明,中断DT-40 Chk-YB-1b基因的一个等位基因的细胞导致细胞周期的主要缺陷。在杂合的突变体中看到的异常可以归因于一个占主导地位的负面影响产生的中断YB-1等位基因产品。为了测试这个假说的氨基端序列YB-1融合antennapedia第三螺旋和绿色荧光蛋白。这些纯化的融合蛋白引入鼠肝癌细胞和它们对细胞增殖的影响进行了研究。结果表明,氨基端77个氨基酸的域YB-1蛋白质诱导细胞逮捕在G2 / M期细胞周期和凋亡。删除额外的分析表明,只有26的n端氨基酸YB-1会导致这些表型的变化。我们进一步证明这个氨基端77个氨基酸域YB-1扣押细胞质中的细胞周期蛋白D1的细胞在G2 / M期细胞周期。我们得出这样的结论:n端结构域YB-1扮演着重要的角色在细胞周期进程G2 / M期细胞周期。

 1。介绍

Y-box结合蛋白是冷休克域的成员(CSD)超家族蛋白( 1]。他们参与转录的规定( 2, 3翻译],调制( 4),DNA修复( 5耐药性],[ 6- - - - - - 8),应激反应(细胞外信号 9, 10)在胚胎发育早期阶段( 11, 12]。几项研究也显示,老年病的YB-1增殖细胞中蛋白质含量相比静止或核武器、细胞( 1, 13]。YB-1激活许多基因参与细胞增殖包括DNA聚合酶 α( 14)、增殖细胞核抗原(PCNA) [ 15, 16],胸苷激酶和拓扑异构酶II [ 15, 17]。然而,YB-1促进细胞增殖的机制还不了解。

淘汰赛研究来洞察YB-1在细胞增殖的功能。我们之前显示,目标是破坏的 5 ′ 鸡YB-1基因的一个等位基因在年底DT-40细胞导致细胞周期主要缺陷,包括较慢的倍增时间、基因组DNA含量增加,增加细胞大小和细胞凋亡细胞群的一小部分( 18]。相比之下,另一组发现YB-1+ / -杂合的缺陷突变体没有任何明显的增长,而YB-1- / -细胞表现出明显降低生长表型( 19]。针对中断的 3 ′ 年底YB-1呈现的一个等位基因小鼠胚胎干细胞对顺铂更敏感和丝裂霉素C没有任何明显增长的缺陷( 20.]。此外,监管的YB-1 shRNA导致显著减少的速度增殖和细胞凋亡率增加 21]。这些研究表明,氨基酸YB-1可能参与细胞增殖。一个明确的角色在细胞增殖YB-1被击出了两种等位基因的老鼠YB-1 [ 12]。这些老鼠胚胎致命,表明非冗余作用YB-1在早期胚胎发育。进一步的研究与YB1- / -成纤维细胞显示大大减少细胞增殖和细胞形态学改变,证明YB-1在细胞增殖的一个关键角色 12]。

在我们先前的研究[ 18我们推测,我们观察到的表型改变DT-40细胞可能是由于占主导地位的负面影响所假定的截断中断YB-1等位基因编码的蛋白质。如果这个假设是正确的,然后引入YB-1进入细胞的n端结构域应该模仿突变体的表型变化观察DT40细胞( 18]。因此,我们构建了克隆表达26或77氨基酸多肽序列对应YB-1的n端。我们也做了一个内部删除删除丙氨酸和脯氨酸YB-1氨基端77个氨基酸的序列。这些多肽融合antennapedia homeodomain,促进受体蛋白进入细胞和一个记者的独立吸收绿色荧光蛋白(GFP)的吸收和细胞定位监测蛋白质。这些融合蛋白引入鼠肝癌细胞和它们对细胞生长的影响进行了研究。我们的研究结果清楚地表明一个角色在细胞增殖YB-1介导的n端结构域YB-1可能通过回收周期蛋白D1在细胞质中,从而阻止细胞周期进展G2 / M。

 2。材料和方法 抗体和试剂

所有的化学试剂,除非另有说明来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。细胞培养基是来自Invitrogen-GIBCO (CA)卡尔斯巴德。为我们实验室的YB-1多克隆抗体生成σ。主要抗体,使二次抗体来源于Invitrogen-Molecular探针(CA)卡尔斯巴德。

 克隆和表达APGFP-Fusion蛋白质

pUC9向量修改我们的实验室和三个YB-1序列克隆在坐标系与16个氨基酸的上游序列编码长antennapedia homeodomain(美联社)和下游序列编码绿色荧光蛋白(图 2(a))。三个克隆APYB77GFP、APYB36GFP APYB26GFP和控制克隆APGFP,缺乏YB-1序列,变成了 大肠杆菌BL21DE3细胞。日志阶段文化与1毫米IPTG诱导一夜之间和蛋白质纯化。

 纯化的蛋白质

包涵体是孤立和可溶性描述( 22)和融合蛋白进一步纯化使用DEAE Sephacel从浮在表面的离子交换色谱在4°C(描述 23]。预期的融合蛋白被发现在分数筛选了0.3氯化钠。这些分数是透析过夜4变化TNG缓冲区(50 mM Tris-HCl, pH值8.0,100毫米甘油氯化钠和5%)。纯净的蛋白质是由运行一式三份的蛋白质分数15% sds - page凝胶紧随其后coomassie染色或银染色和免疫印迹GFP抗体。蛋白质浓度测定用BCA蛋白质分析工具包(皮尔斯-罗克福德,IL)。

 同步和治疗的细胞

大鼠肝癌细胞(写明atcc - h - 411 e)是生长在最低基本培养基补充10%的边后卫,100 U /毫升青霉素和100年 μ g / mL链霉素,湿润孵化器维持在37°C和5% 有限公司 2 。细胞每天为它提供给养亚文化1:trypsin-EDTA confluency 5,使用0.05%。实验分析,细胞被孵化40 μ g / mL纯化蛋白质的显示时间。双胸苷块用于同步的细胞G1(描述 24]。G2 / M期细胞同步孵化1至2.5 μ g / mL诺考达唑14到24小时。

 免疫印迹

细胞被洗和细胞溶解里帕缓冲后出版协议( 25]。核和细胞质分数,细胞在100年被刮掉 μ 在500 g L冰冷PBS和离心机5分钟。细胞颗粒resuspended于100年 μ L缓冲区(50毫米氯化钠,10毫米消息灵通的ph - 8.0, 500毫米蔗糖,1毫米EDTA, triton - x - 100 0.2%,新添加蛋白酶抑制剂和7毫米 β 巯基乙醇),高速涡流45秒和离心机在4°C 2000 g 2分钟。得到的上层清液作为细胞质中提取。颗粒resuspended于100年 μ L缓冲B(缓冲甘油25%和0.1毫米EDTA)和核颗粒状在2000 g 2分钟4°C。颗粒的溶解在50 μ L缓冲C与350毫米氯化钠(缓冲B),孵化冰上30分钟的间歇高速涡流和旋转在11000克15分钟在4°C。上层清液稀释至100年 μ L PBS和用作核提取。在sds - page凝胶等量的样品进行了分析。1:7500稀释Antirabbit GFP抗体在一夜之间被用作主要的抗体在4°C孵化。1:15000稀释HRP-conjugated Antirabbit免疫球蛋白作为二次抗体用于在室温下2小时。污点是开发利用化学发光试剂(皮尔斯,罗克福德,IL)根据制造商的协议。

 免疫沉淀反应

等量的完整的细胞溶解产物或核和胞质提取物稀释至500人 μ L与裂解缓冲和孵化1:2000稀释的细胞周期蛋白,B1, D1和D2 GFP抗体在一夜之间在4°C。等量的蛋白质琼脂糖珠(Amersham Biosciences-Piscataway, NJ)被添加到每个样本和孵化在室温下2小时。珠子是颗粒状在8000 g为4分钟和颗粒被裂解缓冲两次。由此产生的颗粒在样本resuspended缓冲和装上sds - page凝胶。

 免疫细胞化学和间接免疫荧光法

细胞被漂洗两次磷酸缓冲盐(PBS),固定15分钟。有4%的人 p甲醛,洗两次PBS和储存在4°C。细胞被封锁在PBS 5%山羊血清和3% BSA 30分钟。和冲洗三次PBS。然后主要抗体的细胞被孵化Antirabbit GFP(1: 500)或Antirabbit YB-1(1: 300)和Antimouse细胞周期蛋白D1(1: 300)为3小时在随后几个洗PBS。随后细胞孵化与二次抗体FITC共轭Antirabbit免疫球蛋白g(1: 500)和Texas-Red共轭Antimouse免疫球蛋白g(1: 500)为1小时在室温下在黑暗的房间里。盖玻片是用水洗了几次PBS和一次删除任何盐和左为45分钟在缺乏光线风干。盖玻片被安装到玻璃幻灯片使用Vectashield安装介质包含DAPI(向量Laboratories-Burlingame, CA)复染色细胞核。幻灯片是储存在 - - - - - - 20. °C,直到通过显微镜分析。

 共焦显微镜

共焦图像捕获LSM 510激光扫描显微镜三色(卡尔蔡司,耶拿,德国)使用氩激光输出和75% HeNe1激光激发波长488 nm和543 nm,分别。光学切片厚度被设置为0.3 μ 40米,放大 × 和部分被大约在中期高水平的细胞。光电倍增管增益和激光功率是一样的在每一个实验。凋亡气泡被使用Axioplan 2 epiflorescent显微镜(德国蔡司)。使用63 DAPI荧光被捕 × 显微镜的放大镜头。Axiovision软件是用来捕捉zvi-stacks图像。暴露组为每个实验使用控制核和固定。最少100染色细胞得分为每个实验。所有图片进行分析和调整的对比在Adobe Photoshop 5.0 (CA)圣何塞。

 DNA碎片

指数增长的细胞融合蛋白孵育24、48和72小时。分析的DNA碎片是描述( 18]。

 流式细胞仪分析

细胞被胰蛋白酶化收获或刮冰和颗粒状的500 g 5分钟。他们用PBS、固定与EtOH冰冷的70%,在冰上孵化了45分钟,在500 g离心5分钟。汉克斯的颗粒被平衡盐溶液(hbs)含1% BSA, resuspended propidium碘缓冲区中(1:1稀释20 ug /毫升的π在哈佛商学院和1毫克/毫升核糖核酸酶A)和孵化为30分钟37°C水浴。样本正欲使用流式细胞仪分析了石中剑。分析凋亡细胞,Aposcreen膜联蛋白V-FITC工具包(南方生物技术Associates Inc .、伯明翰、AL)是根据制造商的协议。适当的细胞碎片被排除在流式细胞仪分析和光散射浇注。细胞周期的资料分析了使用Microsoft Excel和酒吧图绘制。

 3所示。结果 3.1。APYBGFP和APGFP融合蛋白是内化和稳定细胞内

早些时候我们中断DT-40 YB-1基因的一个等位基因细胞,观察深刻的细胞周期缺陷( 18]。我们提出,这种效应可能是由于截断内脯氨酸多肽的编码外显子1和中断产生的等位基因。为了测试假定的截短蛋白是否会负责以前观察到的结果,我们开发了一个表达盒包含伴77个氨基酸16个氨基酸之间的YB-1插入antennapedia肽和GFP的记者。这些克隆的氨基酸序列图所示 1(一)。这个构造将称为APYB77GFP(图 1(一)画线)。另外两个融合包含26个n端氨基酸的YB-1 (APYB26GFP)和克隆与内部删除,删除alanine-proline-rich氨基端77个氨基酸的序列YB-1 (APYB36GFP)也(图生成 1 (b)图纸行)。这些融合蛋白提纯到80%以上评估的同质性聚丙烯酰胺凝胶电泳和他们的大小经免疫印迹(图 1 (b))。

融合的示意图表示构造和截断YB-1蛋白质的氨基酸序列。(a)氨基端区域的氨基酸序列的每个截断YB-1蛋白质。注意内部APYB36GFP删除,删除alanine-proline序列(b)每个包含antennapedia融合的素描,YB-1 GFP和大肠杆菌表达融合蛋白的大小,分析了页面之后,免疫印迹分析。

证据表明,APYBGFP和APGFP融合蛋白得到内化进入细胞。完整的细胞提取物的大鼠肝癌细胞孵化与每个融合蛋白3和18人力资源被使用anti-GFP抗体免疫印迹分析。大量使用了部分的细节 2。

为了表明antennapedia肽能直接YB-1融合蛋白的细胞吸收,我们培养大鼠肝癌细胞与40个 μ 每个蛋白质3 g / mL和18小时。细胞提取物的准备和分析了使用anti-GFP抗体免疫印迹。结果呈现在图 2表明,融合蛋白内化早3小时(图 2L (a),车道标记)并继续积累至少18人力资源(图 2)。这个时候超过80%的细胞有了融合蛋白表明antennapedia肽允许细胞蛋白质有效(见图 3)也获得了类似的结果主要分离大鼠主动脉平滑肌细胞(RASM)(数据未显示)。这些结果表明,该融合蛋白很容易通过肿瘤和主细胞内化。

融合蛋白含有氨基端YB-1序列是局限于细胞的细胞质中。(一)内化蛋白的亚细胞定位在细胞孵化APYB26GFP(面板B和F), APYB36GFP(面板C和G),和APYB77GFP(电池板D和H)或APGFP控制(E)所示。代表细胞的箭头。为了显示详细字段代表(被冲广场)18小时面板放大,显示在一个单独的框右边的图。(b)的免疫印迹分析核和胞质提取物使用多克隆GFP抗体。注意三个APYBGFP蛋白质只有在细胞质中提取两个时间点而APGFP检测核和胞质提取物。

 3.2。n端结构域YB-1负责细胞质的本地化

证明所有的蛋白质的内化,然后研究这些蛋白质细胞内的定位。细胞融合蛋白孵育3 - 18人力资源和共焦显微镜的准备。结果表明,80%以上的细胞蛋白质由18个小时。APGFP没有包含任何YB-1序列,是分布在整个细胞,也就是说,在细胞核和细胞质(图 3(一个)面板和E)。这可能是由于这一事实可以分布在细胞GFP,除非特定目标信号包括(了 26])或细胞穿透antennapedia一半可能是负责易位GFP通过细胞质和核细胞膜。相比之下,孵化的三个YB-1融合蛋白表明3和18个小时,大部分的蛋白质局部细胞质(图 3(一个),面板B和D, C和E, F和H)。这些结果表明,氨基酸YB-1限制细胞的细胞质的融合蛋白。

这是进一步证实了免疫印迹分析。分析了核和胞质提取物的大鼠肝癌细胞免疫印迹分析使用anti-GFP抗体。这些研究表明,APYBGFP融合蛋白被发现只在细胞的胞质提取即使18人力资源,而APGFP检测核和胞质提取(图 3 (b))。小于2 3%的内化APYBGFP蛋白质在细胞核中发现了控制APGFP高达30 - 40%在细胞核中发现了18个小时。我们认为存在的n端氨基酸序列的YB-1融合蛋白负责限制本地化细胞的细胞质中。

 3.3。细胞培养与APYBGFP蛋白质逮捕在G2 / M期细胞周期

有了伴的交付YB-1肽进入细胞,我们想知道这些YB-1肽诱导细胞周期缺陷类似于我们以前观察到YB-1-disrupted杂合的突变DT-40细胞( 18]。与每一个融合蛋白细胞孵化24,48和72小时。一半的细胞被沾propidium碘化和DNA进行流式细胞仪分析来确定内容。我们的结果表明, ~ 32%的细胞被逮捕在G2 / M期细胞周期后72小时孵化与APYB77GFP(图 4),而APYB26GFP诱导24%以上的细胞积聚在G2 / M以下相同的72小时孵化(图 4)。相比之下,只有约10% APYB36GFP-incubated细胞G2 / M(图 5),这非常类似于APGFP-incubated细胞不到6% -8%的细胞在G2 / M期(图 4)。这些结果表明,氨基YB-1序列,包含alanine-proline-rich域,可能参与调节细胞的发展从G1 G2 / M。

的内化YB-1融合蛋白导致细胞周期阻滞于G2 / M期。鼠肝癌细胞孵化的融合蛋白与propidium碘染色,进行流式细胞仪分析(a)。三个独立实验进行统计分析和所有的值(细胞的百分数)报告是绝对的 P < 。 001年 。面板B细胞的百分比表明了融合蛋白,通过流式细胞仪分析量化。这表明没有区别在蛋白质吸收的程度与融合蛋白细胞孵化。

细胞培养与三个APYBGFP蛋白质显示明显的细胞凋亡。(a)大鼠肝癌细胞与每个融合蛋白的孵化沾FITC-conjugated膜联蛋白V和进行流式细胞仪分析。面板C显示细胞的数量(百分比)采取了量化的融合蛋白流式细胞仪分析。(b)的DNA琼脂糖凝胶电泳分离与融合细胞孵化。取细胞的百分比(c)融合蛋白,通过流式细胞仪分析量化。

为了显示块在G2 / M期的差异并不是融合蛋白的摄入,剩下的一半的样品被用来量化GFP阳性细胞平均GFP荧光。结果呈现在图 4 (b)表明GFP-positive细胞相似的百分比的融合。此外,未观察到的差异意味着不同的融合蛋白GFP荧光。这些结果表明,APYBGFP-incubated细胞的细胞周期阻滞并不是由于变化融合蛋白阳性细胞的数量或数量的内化蛋白质,但由于YB-1 n端序列的存在。此外,这些数据清楚地表明分子的n端YB-1逮捕的G2 / M期细胞的细胞周期。

 3.4。YB-1的氨基酸是参与调节细胞凋亡

早些时候我们演示了杂合的突变DT-40细胞凋亡和猜测,这可能是由于潜在的截短蛋白编码的主要负面影响有缺陷的等位基因( 18]。随后,另一组报道我们YB-1下调导致凋亡细胞死亡速率的增加,说明直接YB-1水平和细胞凋亡之间的关系( 20.]。基于这些观察我们假设参与调节apoptotis YB-1分子的n端。

测试的可能性YB-1调节细胞凋亡的n端,我们进行了实验,检测磷脂酰丝氨酸的存在在细胞表面使用fluorescein-conjugated膜联蛋白V和DNA碎片,两者都是细胞凋亡的标志。细胞融合蛋白孵育24、48和72小时和一半的细胞染色膜联蛋白V,流式细胞仪分析。我们的研究结果表明,在APGFP-incubated细胞小于1到2%的细胞凋亡后72小时孵化(图 5(一个))。相比之下,孵化与APYB77GFP刺激22 - 23%的细胞变成膜联蛋白V-positive 72小时。类似的结果APYB26GFP -细胞(图孵化 5(一个))。相比之下,APYB36GFP以更有效地导致细胞凋亡。再一次,这些蛋白质的吸收相当就是明证GFP阳性细胞的数量和他们的意思是GFP荧光(图 5 (c))。这些结果清楚地表明,氨基alanine-proline-rich 26个氨基酸是主要的YB-1死域的一部分。

这些结果进一步证实了DNA碎片分析。DNA细胞融合蛋白孵育不同时间被琼脂糖凝胶电泳分析。可以看出,模式的DNA碎片,就是明证的外观180 - 200 bp的梯子,显然是与细胞的DNA处理YB-1包含融合蛋白(图 5 (b)),但不是细胞孵化控制融合蛋白,APGFP。进一步,原子核与DAPI染色显示的细胞核染色质凝聚和破碎处理APYBGFP蛋白72年人力资源而不是APGFP-incubated细胞核显示正常的外观(参见图S1补充材料网上doi: 10.155 / 2009/243532)。基于这些结果,我们得出这样的结论:氨基末端区域YB-1参与细胞凋亡。

 3.5。n端结构域的相互作用与细胞周期蛋白D1 YB-1

它已经表明,YB-1调节转录的G2 / M期细胞周期蛋白和B1 ( 27]。由于细胞周期蛋白D1调节在G2期细胞周期的Ras-mediated平移控制的信使rna,并因为它是定位在细胞核细胞周期进展是非常重要的,我们想知道是否YB-1与细胞周期蛋白。这些细胞cycle-specific为了研究这种交互,整个细胞提取物的大鼠肝癌细胞细胞周期蛋白,与抗体免疫沉淀反应,B1, D1和D2和检查YB-1的存在。我们的研究结果清楚地表明,YB-1主要与细胞周期蛋白D1,因为这是主要的乐队下拉化验(图中观察到 6(一))。我们观察到细胞周期蛋白B和D2的小乐队也在G2调节。为了表明这种交互不是由于工件的蛋白质提取方法,我们进行免疫沉淀反应从异步提取分离以及nocodazole-treated文化。诺考达唑,正如所料,阻止细胞G2 / M(补充图S2)。自anticyclin D1抗体推倒YB-1 nocodazole-treated细胞提取物,它表明YB-1与细胞周期蛋白D1。互惠的实验使用anti-YB-1抗体证实YB-1确实结合细胞周期蛋白D1(补充图S3)。

证据表明YB-1与细胞周期蛋白D1。(a)的免疫沉淀反应大鼠肝癌细胞提取物anticyclin抗体免疫印迹紧随其后使用YB-1抗体(顶面板标志着)。污点被剥夺了与细胞周期蛋白D1 reprobed抗体(中间面板B)。等量提取物也被加载的凝胶,玷污和探索肌动蛋白(底部面板标记C)。(B)的间接免疫荧光法分析异步和nocodazole-treated细胞。YB-1抗体(FITC-conjugated)或anticyclin D1抗体(德州红色)被用来定位YB-1和细胞周期蛋白D1在异步C(板),双胸苷阻塞(电池板D E)或nocodazole-treated (G I)细胞。(c)融合蛋白的免疫沉淀反应从整个细胞溶解产物分离的异步和G2 / M期细胞同步。

为了调查如果YB-1和细胞周期蛋白D1硝唑在细胞在细胞周期的不同阶段,我们分析了他们分布在G1 / S和G2 / M期细胞同步使用共焦显微镜。我们观察到,在异步化和G1 / S期细胞YB-1同步主要是胞质(图 6 (b),面板和D)而周期蛋白D1的主要核(图 6 (b),电池板C和F)与最小co-localization(图 6 (b)、面板B和E)。然而,在G2 / M YB-1 phase-blocked细胞和细胞周期蛋白D1部分硝唑主要在细胞质(图 6 (b),我和电池板G H)。

为了证明这个colocalization是由于特定的YB-1之间的相互作用和细胞周期蛋白D1,我们进行免疫沉淀反应使用特定的抗血清与孤立的核和胞质提取物(补充图S3A和S3B)。Anticyclin D1抗体只拉下细胞周期蛋白D1和anti-YB-1抗体了只能从细胞质YB-1表明这些蛋白质确实是本地化在细胞核和细胞质,未经处理的细胞的分别。然而,在nocodazole-treated细胞,在G2期被捕,细胞周期蛋白D1抗体推倒YB-1从细胞质,反之亦然。正如所料,诺考达唑阻止了大部分细胞G2 / M期细胞周期(补充图S2)。我们得出这样的结论:YB-1和细胞周期蛋白D1相互作用G2期细胞的细胞质中。有趣的是当渥曼青霉素,PI-3激酶的抑制剂,Akt通路,大量的细胞周期蛋白D1可以检测到细胞核(补充图S4)。这表明YB-1之间的相互作用和细胞周期蛋白D1依赖于一个或两个蛋白质的磷酸化。需要进一步的实验来确定phosporylation网站。

 3.6。交互的YB-1 n端结构域与在G2 / M期阻止细胞周期蛋白D1

为了确定YB-1与细胞周期蛋白D1的氨基酸,整个细胞提取物的异步化和G2 / M期细胞同步使用nocodozole孵化了GFP抗体和细胞周期蛋白D1探测。Anti-YB-1免疫沉淀反应细胞周期蛋白D1被用作积极控制。免疫沉淀反应的APGFP孵化细胞起到了消极的控制。细胞周期蛋白D1在异步化细胞(图中未发现免疫沉淀反应 6 (c))。然而,在nocodazole-blocked细胞,细胞周期蛋白D1共沉淀APYB26GFP和APYB77GFP 3人力资源和18小时时间点(图 6 (c)),而它没有从APYB36GFP-incubated细胞免疫沉淀反应的准备。因为异步文化也包含一些细胞G2 / M我们期望某些细胞周期蛋白D1和YB-1之间的交互,如补充图S3B所示。我们没有观察到这种互动与融合蛋白aynchronous细胞。这可能是由于技术的灵敏度或交互的内生YB-1可能屏蔽检测。然而,这些结果表明,YB-1可能参与的alanine-proline-rich n端序列隔绝在细胞质当细胞周期蛋白D1的封锁在G2 / M期细胞周期。保留的细胞周期蛋白D1 YB-1 G2 / M期细胞的细胞质的融合蛋白可能是负责观察这些融合对细胞周期进展和细胞凋亡的影响。

 4所示。讨论

YB-1表达与细胞增殖密切相关。例如,YB-1再生肝和肝癌中高度表达,但几乎没有可检测在正常成人肝细胞静止( 28, 29日]。我们以前的研究表明,中断Chk-YB-1b基因的一个等位基因导致杂合的异常DT-40突变体,包括较慢的增长速度和增加基因组DNA与细胞凋亡相关的内容( 28]。我们推测的缺陷可能是由于假定的氨基端截断的主要负面影响中断YB-1等位基因编码的蛋白质。如果我们的假设是正确的,那么引入YB-1应该模拟肽的氨基酸突变DT40细胞中观察到的缺陷( 18]。

antennapedia肽被证明是最有效的和最小的细胞毒性细胞穿透肽( 30.]。因此YB-1序列克隆这样的融合蛋白antennapedia肽的氨基端和羧基记者GFP序列。我们报告,内化的四个APGFP融合蛋白发生在指数增长的鼠肝癌细胞的效率高。控制蛋白质,APGFP没有任何YB-1序列,是分布在整个cell-both细胞核和细胞质。相比之下,YB-1融合蛋白限制细胞的细胞质中。自从APGFP分布在细胞,看起来YB-1一部分负责细胞质本地化。

的能力YB-1 n端与细胞周期蛋白D1和潜在的保留在细胞的细胞质可能占的影响细胞周期进展和apoptsis YB-1融合。细胞周期蛋白D1, Bcl-1编码的基因,是一个假定的protooncogene,先前的研究已经表明,YB-1和细胞周期蛋白D1都调节在许多肿瘤( 1, 31日, 32]。尽管YB-1通常是细胞质核蛋白质,蛋白质和细胞周期蛋白D1 YB-1存在于原子核在G1年代中期阶段( 27)的同时,细胞周期蛋白D1。细胞周期蛋白D1迁址至细胞质的S期和G2期( 33, 34),当YB-1也集中在细胞质中。细胞周期蛋白D1的水平在G2 / M期细胞细胞周期至关重要的决定如果他们接受新一轮的复制。

它已经表明,细胞周期蛋白D1-knockout小鼠胚胎存活了13天,然后死( 35]。细胞分离出这些老鼠生长通常虽然速度降低。然而,在上皮细胞细胞周期蛋白D2补偿损失的细胞周期蛋白D1指示细胞周期蛋白在细胞增殖(这些的重要性 36]。细胞周期蛋白D1被认为是一个G1细胞周期蛋白,作为其与Cdk4/6互动有助于Rb蛋白的磷酸化也能隔绝Cdk抑制剂,这是需要S期的细胞周期进展( 37]。

细胞周期蛋白D1的水平也会增加在G2和维护在有丝分裂和G1 ( 10, 34, 38]。规定似乎是在转录后的水平,表明从头合成的细胞周期蛋白D1在G2期发生。它的命运决定通过receptor-coupled Ras信号( 34, 37]。很可能在细胞周期蛋白D1存在于细胞质G2的氨基端域YB-1扣押细胞周期蛋白D1,防止其进入细胞核。核易位serine-threonine YB-1需要磷酸化的蛋白激酶Akt在CSD YB-1 (ser - 102 39- - - - - - 41]。这种磷酸化也导致翻译的几个细胞信使rna ( 42]。因为CSD和羧基末端acidic-basic域融合蛋白缺失,很多函数进行内生YB-1全长分子的破坏。因此,细胞蛋白(s)与氨基YB-1序列影响下游信号导致细胞损伤,使细胞G2,给一个机会来恢复或对细胞凋亡可能在p53-dependent通路( 24, 37]。这里提供的数据表明,YB-1之间的相互作用和细胞周期蛋白D1发挥重要作用在调节细胞周期蛋白D1函数在G2 / M期细胞周期。

稳定和核细胞周期蛋白D1积累取决于PI3-K, Akt通路,从而消极调节GSK-3 β ( 43),一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,调节细胞周期蛋白D1表达式通过调节mRNA转录和蛋白质降解(了 43])。细胞周期蛋白D1的磷酸化以及YB-1取决于PI3-K和Akt通路。YB-1,磷酸化是直接诱发p110易位到细胞核 α pi3激酶的催化亚基 39, 44]。同样,细胞周期蛋白D1也受pi3激酶,Akt GSK-3 β (综述[ 32])。细胞周期蛋白D1的核是重要的细胞周期进程和出口从细胞质到原子核对G2 / M esit[至关重要 34]。正常的细胞周期蛋白D1导出到细胞质,它由泛素降解途径 32]。

渥曼青霉素,PI3-kinase-Akt通路的抑制剂,刺激细胞周期蛋白D1的核本地化nocodazole-treated细胞,表明细胞周期蛋白D1 YB-1和之间的交互产生的胞质细胞周期蛋白D1的定位取决于YB-1磷酸化或细胞周期蛋白D1或两者兼而有之。YB-1是由一种蛋白激酶磷酸化的爵士102年CSD和p90核糖体S6激酶。这种磷酸化允许YB-1航天飞机进入细胞核,它诱发transcriptioin PI3-K α 110催化亚基 39]。然而,在APYB77GFP APYB26GFP,这个磷酸化站点不存在,因此这n端结构域能隔绝细胞周期蛋白D1和防止其原子核的运动。这可能会导致细胞周期阻滞于G2 / M。

YB-1是已知的与几个细胞蛋白包括那些参与DNA合成、DNA修复、转录和翻译。它还结合几个mrna和压制翻译( 42]。根据类型的细胞和细胞周期阶段可能需要这些交互为核易位和/或胞质保留各种细胞因子。通常知道细胞停止在G2 / M是不稳定的,在这段时间内,细胞生存取决于几个蛋白质包括p53、p21和细胞周期蛋白,决定细胞的命运,也就是说,是否去另一轮的细胞周期和细胞凋亡。当全长YB-1绑定到适当的目标和引起适当的反应,细胞周期进展正常;然而,当n端序列结合蛋白质p53等( 45)或细胞周期蛋白D1和让他们在不同的隔间的细胞,那么它不能引起同样的反应,因此缺陷。

它已经表明,细胞阻塞在G2 / M期细胞周期似乎不稳定和凋亡 33, 34, 46]。此外,众所周知,修复任何损坏DNA发生在G2和YB-1一直参与这个过程。在我们的实验中我们发现YB-1刺激细胞的N-termainal地区逮捕在G2 / M期细胞周期。这种显性效应的分子的n端YB-1的能力可能是由于YB-1调节中心体函数绑定到肌动蛋白( 47和中心体在有丝分裂期间 48]。中心体的抑制作用可能会导致染色体不稳定和非整倍性( 46, 49),这可能会导致一个街区在细胞周期和细胞凋亡。我们的数据,这是符合这些以前的观测,提出了关键作用的YB-1 n端结构域在调节细胞增殖和细胞凋亡。

总之,在这个报告中,我们演示了co-localization YB-1和细胞周期蛋白D1的阻塞G2 / M期细胞的细胞质中。此外,我们目前的证据的交互融合蛋白的细胞周期蛋白D1 APYB26GFP和APYB77GFP在G2 / M期细胞。我们建议YB-1结合细胞周期蛋白D1和隔绝在细胞质中。这将导致细胞逮捕在G2 / M期细胞周期和保护细胞周期蛋白D1的退化,这对G2 / M退出是很重要的。由于这种异常在G2 / M被捕,被捕的细胞变得不稳定并接受细胞凋亡。从细胞周期蛋白D1免疫沉淀反应APYB77GFP APYB26GFP,但不是APYB36GFP和与细胞凋亡增加,很可能与细胞周期蛋白D1的交互是通过丙氨酸和脯氨酸在YB-1的n端序列。进一步的研究需要阐明的生理重要性YB-1 /周期蛋白D1的交互和准确识别领域参与这种交互。

 确认

这项工作是支持的资金从Sudershan生物科技有限公司,印度。我们感谢Drs。杆Hori和李亏的批判阅读手稿和帮忙准备数据。

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