绿茶和部分柑橘皮浸渍对单胺氧化酶和丁酰胆碱酯酶活性的抑制比较

摘要

这项研究旨在调查绿茶(茶树)和一些柑桔皮[柚子皮(柑橘最大值)、柚子(柑橘天堂金花蛇)，以及橙色(素类[单胺氧化酶(MAO)和丁酰胆碱酯酶(BChE)]与神经退行性疾病的管理有关。苯酚的含量和抗氧化活性主要表现为清除2,2′-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)自由基的能力、铁还原抗氧化性能和Fe^２＋还考察了螯合能力。绿茶的总酚(43.3 mg/g)和总黄酮(16.4 mg/g)含量最高，桔子[总酚(19.6 mg/g)、总黄酮(6.5 mg/g)]、柚子[总酚(16.3 mg/g)、总黄酮(5.2 mg/g)]和柚子[总酚(17.7 mg/g)、总黄酮(5.9 mg/g)]的含量最高。橙色(EC₅₀= 1.78 mg/mL)对MAO的抑制能力最高，绿茶对MAO的抑制能力最低(EC₅₀= 2.56毫克/毫升)。同样，绿茶对BChE的抑制能力最低(EC₅₀= 5.43 mg/mL)。而绿茶冲剂具有最强的ABTS自由基清除能力、还原能力和Fe能力^２＋螯合能力。绿茶和柑橘皮对MAO和BChE活性的抑制作用使其成为预防和治疗神经退行性疾病的良好饮食手段。

1.介绍

神经退行性疾病的治疗靶点包括单胺氧化酶(MAO)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、丁酰胆碱酯酶(BChE)和氧化应激[1］．MAO抑制剂的使用及其在抑郁症和其他神经退行性疾病(如阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD))管理中的作用机制已经确定[2］．未受抑制的MAO活动，特别是MAO- b，有助于神经变性，导致阿尔茨海默病的发展[3.］．此外，过量的MAO活动与大脑中自由基生成的增加和神经元损伤有关[3.］．因此，抑制MAO活性是AD和其他神经退行性疾病的治疗靶点。

大脑胆碱能功能的降低已被证明会导致AD患者的记忆障碍[4］．因此，使用乙酰胆碱酯酶和BChE抑制剂来减少乙酰胆碱的水解是一种治疗神经退行性变的方法。然而，研究表明，在治疗AD时，联合抑制乙酰胆碱酯酶和BChE比选择性抑制乙酰胆碱酯酶更可取[5］．而且，乙酰胆碱酯酶活性随着AD进展而下降，而BChE活性随着疾病进展而增加[6，7］．此外，旨在改善氧化损伤的努力也被证明对神经退行性疾病的治疗是有益的。胆碱酯酶抑制和抗氧化能力的结合被认为是治疗这类疾病的有效方法[8］．绿茶和柑橘皮一直被用于替代和补充医学，作为治疗某些退化性疾病的廉价干预措施，许多国家以输液的形式食用它们。

抑制乙酰胆碱酯酶活性，抑制铁^２＋一些柑橘皮水提取物的诱导脂质过氧化和自由基清除能力已被较早的报道[9］．然而，这项研究试图比较绿茶(茶树)和一些柑桔皮[柚子皮(柑橘最大值)、柚子(柑橘天堂金花蛇)，以及橙色(素类)]对MAO和BChE(与神经退行性疾病有关的关键酶)活性的影响，以及它们的铁螯合特性体外。

2.材料和方法

2．1．样品收集

绿茶(茶树)和一些柑橘皮、柚子皮(柑橘最大值)、柚子(柑橘天堂金花蛇)，以及橙色(素类)是在尼日利亚西南部的阿库雷采集的。将绿茶和果皮晒干7天，研磨成细粉。

2．2．注入制备

将磨碎的样品在沸水中浸泡5分钟，制成冲剂。然后将所得混合物过滤，滤液储存在冰箱中以供后续分析。

2．3.总酚含量的测定

总酚含量按Singleton等方法测定[10］．简单地说，用2.5 mL 10% Folin-Ciocalteu试剂(v/v)氧化适当稀释的提取物，用2.0 mL 7.5%碳酸钠中和。反应混合物在45℃下孵育40分钟，在765 nm处用分光光度计测定吸光度。总酚含量随后计算为没食子酸当量(GAE)。

２.４.总黄酮含量的测定

总黄酮含量的测定采用Meda等人报道的稍作修改的方法[11];将0.5 mL适当稀释的样品与0.5 mL甲醇、50μL 10% AlCl3, 50μL 1 M醋酸钾，1.4 mL水，室温孵育30分钟。随后在415 nm处测量反应混合物的吸光度;然后计算总黄酮含量。

2．5．酶抑制试验

2.5.1。单胺氧化酶(MAO)抑制试验

按方法测定不同浓度灌洗液中MAO含量及MAO活性[12，13，稍作修改。简而言之，反应混合物包括pH为7的0.025 M磷酸盐缓冲液、0.0125 M氨基脲、10 mM苄胺(pH调整到7)、0.67 mg酶和总反应体积为2 mL的适当稀释的输液剂。30 min后，加入醋酸1 mL，在沸水浴中煮沸3 min，离心。室温孵育10分钟后，上清液(1 mL)与等体积的0.05% 2,4 - dnph和2.5 mL苯混合。分离苯层后与等体积0.1 N NaOH混合。滗出碱性层，80°C加热10分钟。在450nm波长下测定显现的橙黄色。

2.5.2。丁酰胆碱酯酶抑制试验

用改良的Ellman比色法评价BChE的抑制作用[14］．在含200的反应混合物中测定BChE的活性μL的BChE溶液(0.415 U/mL in 0.1 M磷酸盐缓冲液，pH 8.0)， 100μL含NaHCO的5,5 ' -二硫代二(2-硝基苯甲酸)酸(3.3 mM in 0.1 M磷酸盐缓冲溶液，pH 7.0)的溶液_3.(6 mM)，果汁稀释(0-100μL), 500年μL磷酸缓冲液，pH 8.0。在25°C孵育20分钟后，碘化丁酰硫胆碱(100μ加入0.05 mM溶液L)作为底物，用紫外分光光度计在25°C下412 nm吸光度变化3.0 min测定BChE的活性。

2.6。在体外抗氧化研究

2.6.1。菲^２＋螯合试验

的铁^２＋用Minotti和Aust改进的方法测定了输液的螯合能力[15]，由Puntel等人稍作修改。[16］．刚做好的500μM FeSO₄(150μL)加入含有168的反应混合物中μTris-HCl (pH 7.4)， 218μL生理盐水和提取物(0-25μL).反应混合物孵育5 min，加入13μL 0.25% 1,10 -菲罗啉(w/v)。随后用分光光度计在510 nm处测量吸光度。随后计算了Fe (II)的螯合能力。

2.6.2。2 ' -Azino-bis(3- ethylbenzthiazole -6- sulfonacid) (ABTS)自由基清除能力

采用Re等人的方法测定了该液对ABTS*的清除能力[17］．ABTS*由(7 mmol/l) ABTS水溶液与K反应生成₂年代₂O₈(2.45 mmol/l，最终浓度)在黑暗中处理16 h，用乙醇调节Abs734 nm至0.700。将适当稀释的提取液0.2 mL加入到2.0 mL ABTS*溶液中，15 min后在734 nm处测定吸光度。随后计算Trolox等效抗氧化能力。

2.7。数据分析

将3个重复的结果合并，用均数±标准差(sd)表示。学生的-检验、单因素方差分析(ANOVA)和最小显著性差异(LSD) [18］．重要性在．

3.结果

绿茶和柑橘皮冲剂中总酚和类黄酮含量的测定结果见表1结果表明，绿茶的总酚(43.3 mg/g)和总黄酮(16.4 mg/g)含量最高，桔子[总酚(19.6 mg/g)，总黄酮(6.5 mg/g)]、柚子[总酚(16.3 mg/g)，总黄酮(5.2 mg/g)]和柚子[总酚(17.7 mg/g)，总黄酮(5.9 mg/g)]的含量最高。输液对单胺氧化酶和丁酰胆碱酯酶活性的影响如图所示1和2，以及欧盟委员会₅₀值在表2．输液以剂量依赖性的方式抑制酶的活性。然而,橙色(EC₅₀= 1.78 mg/mL)对MAO的抑制能力最高，绿茶对MAO的抑制能力最低(EC₅₀= 2.56毫克/毫升)。同样，冲剂对BChE的抑制能力显示绿茶对BChE的抑制能力最小(EC)₅₀= 5.43 mg/mL)₅₀= 3.61毫克/毫升);柚子(EC₅₀= 4.42毫克/毫升);柚子(EC₅₀= 4.20毫克/毫升)]。数字3.和表2结果表明，绿茶(EC₅₀= 0.63 mg/mL)的铁含量最高^２＋螯合能力比较柑橘皮的注入[橙子(EC₅₀= 0.72毫克/毫升);柚子(EC₅₀= 0.81毫克/毫升);柚子(EC₅₀= 0.82毫克/毫升)]。此外，据报道，这些输注物清除ABTS自由基的能力相当于Trolox(图)4)显示，绿茶(9.71 mmol/g)清除ABTS自由基的能力最高，葡萄柚(4.13 mmol/g)和柚子(3.99 mmol/g)清除ABTS自由基的能力最低。

4.讨论

本研究中使用的输注对单胺氧化酶和BChE的抑制作用表明，它们在AD和PD等神经退行性疾病的治疗中具有潜在的应用价值。这项研究表明，柚子、橙子和柚子皮的冲泡剂比绿茶冲泡剂对这些酶有更高的抑制作用。在AD患者的脑组织中，单胺类神经递质(多巴胺、血清素和去甲肾上腺素)水平下降，MAO活性增加，注射抑制MAO的治疗重要性得到了支持[3.，19］．因此，抑制MAO在增加大脑中这些神经递质的水平中起着重要作用。此外，先前的研究表明MAO抑制剂可以减少活性氧的产生[3.］．由于与合成抑制剂的结构相似，类黄酮衍生物已被证明是MAO抑制剂[20.］．胆碱酯酶是治疗AD的重要靶点[7］．柑桔皮水提取物抑制乙酰胆碱酯酶的特性早前已由作者报道[9］．本研究表明，柑橘皮冲剂比绿茶冲剂具有更高的BChE抑制作用。BChE抑制在AD治疗中非常重要，因为BChE的浓度随着退行性疾病的进展而上升[5，6］．绿茶和柑橘皮富含酚类化合物，特别是黄酮类化合物，已被证明具有抗胆碱酯酶的特性[21，22］．研究还表明，天然多酚化合物与已建立的胆碱酯酶抑制剂在分子量、酚环和疏水组分方面存在结构上的相似性[23］．

MAO活性已被证明会导致更高的自由基生成[24］．类似地，先前的研究表明，在神经退行性过程中MAO活性和铁的增加，导致阿尔茨海默病和帕金森病[1］．MAO抑制剂的神经保护作用也与它们抑制H₂O₂和NH_3.，是胺降解的有害产物[25］．因此，冲剂的自由基清除能力和铁螯合特性进一步证实了其作为治疗神经退行性疾病的膳食手段的潜力。由于天然物质组成复杂，采用不同的体外方法研究了绿茶和柑橘皮浸膏的抗氧化活性。该研究中使用的柑橘果皮水提液清除自由基[1,1-二苯基-2苦基肼(DPPH)和羟基(OH)]的能力早前已由作者报道[9］．然而，在这项研究中，研究人员使用一种更稳定的以氮为中心的自由基(ABTS*)来研究绿茶和一些柑橘皮的浸渍清除自由基的能力[17］．结果表明，绿茶具有最高的ABTS*清除能力相比，浸泡从果皮。

的铁^２＋本研究显示，铁螯合剂在AD患者中显示出有益的作用，因此，输液的螯合能力在AD治疗中可能有疗效[26通过减缓疾病的发展铁已经被证明在AD患者的大脑中积累[27然后通过芬顿反应生成自由基[28］．合成铁螯合剂的缺点是毒性高，难以跨越血脑屏障[29］．然而，在这项研究中使用的输液富含酚类化合物，这是铁螯合剂，可以穿过血脑屏障[1，30.］．其他研究也表明MAO抑制剂和铁螯合剂在神经退行性疾病的治疗中是有效的[31］．因此，铁螯合剂和MAO抑制剂的组合化合物被开发出来。本研究中使用的输注物具有抑制MAO和螯合铁的双功能能力^２＋这可能是绿茶和柑橘皮管理或预防神经退化的机制的一部分。

绿茶和柑橘皮冲泡液中总酚和类黄酮的高含量与早期的研究文章一致[32，33］．此外，柚子、柚子和橘子等柑橘品种的果皮中总酚和类黄酮含量也存在差异。果皮中总酚含量较高，这与一些柑橘果皮中酚含量的早期报道一致。这些变化可能是由于个体物种在次生代谢产物(如多酚)生物合成方面的遗传潜力等因素造成的[34］．

5.结论

绿茶和柑橘皮的抗氧化特性和抑制MAO和BChE的作用使它们成为治疗神经退行性疾病的良好饮食手段。然而,进一步在活的有机体内建议进行实验和临床试验。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

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