文摘

肝纤维化是慢性损伤的愈合反应,这可能会导致肝硬化和肝功能衰竭。研究已经进行了机制和肝纤维化的发病机制。然而,潜在的特异性标记基因表达参与纤维化进程仍然未知。在这项研究中,我们结合人类肝脏的公开访问单细胞转录组和微阵列数据集评估特异性表达模式的差异表达基因在肝脏。我们注意到EMP1(上皮膜蛋白1)CCl不仅明显活跃4(四氯化碳)治疗小鼠肝纤维化也BDL(胆管结扎)全身的肝纤维化,甚至在人类纤维化肝组织如酒精性肝炎、纳什(非酒精性脂肪肝炎),晚期肝纤维化。此外,我们表明,EMP1特定纤维化基因表达在肝星状细胞(肝星状细胞)和内皮细胞的蛋白质图谱单细胞转录组RNA-sequencing集群。它的表达在CCl纤维化肝星状细胞或显著升高4和NASH-induced成纤维细胞。先前的研究显示,EMP1在扩散过程中发挥作用,移民,转移,tumorigeneses通过多种机制在不同的癌症。因为HSC活化和增殖是肝损伤后两个重要的步骤,这将是有趣的调查EMP1在这些过程中的作用。所有这些信息表明EMP1可以作为一种新型纤维肝标记和将来可能的目标。

1。介绍

肝纤维化是细胞外基质(ECM)的累积异常蛋白质,如胶原蛋白、发生在大多数慢性肝病、肝硬化、肝衰竭、门静脉高压症状都是先进的肝纤维化(1]。肝脏炎症是引起慢性肝损伤,破坏肝脏组织的生理结构(2]。在损伤,肝细胞凋亡并发出有关模式,招募和激活淋巴细胞和巨噬细胞,以及促进pro-fibrotic myofibroblast激活(3]。这些myofibroblasts主要是来源于分化转移居民肝星状细胞(hsc) [4]。然而,肝脏的命运可能是一个anti-fibrotic, scar-dissolving阶段,或者一个无约束fibrosis-promoting阶段通过肝脏non-parenchymal细胞(5]。途径和介质,如自噬,内质网压力,氧化应激,视黄醇和胆固醇代谢,表观遗传学,和受体介导的信号,表明HSC激活的复杂性(6,7]。小说可能标记基因可能在这些过程很重要,另一方面,尚待探索。

在这项研究中,我们从肝结合单细胞RNA序列数据从公共数据库与传统微阵列数据集的样本识别标记基因表达在肝星状细胞和纤维化过程中反应。我们发现EMP1(上皮膜蛋白1)CCl不仅显著激活4(四氯化碳)治疗小鼠肝脏,而且在BDL(胆管结扎)全身的小鼠肝纤维化,甚至在人类纤维化肝组织如酒精性肝炎、纳什(非酒精性脂肪肝炎),和也与晚期肝脏疾病。此外,我们证明了EMP1是一个特定的纤维化的基因表达在肝星状细胞和内皮细胞(EC)利用单细胞转录组从数据库ProtinAtlas RNA-sequencing聚类结果,CCl和其表达显著升高4和NASH-induced成纤维细胞。先前的研究发现,EMP1调节肿瘤细胞迁移和增殖,我们怀疑在激活肝星状细胞(它有一个类似的角色8,9]。上皮膜蛋白(emp)编码的外围髓磷脂蛋白22 kDa PMP22基因家族,并参与肿瘤细胞的迁移、生长和分化。EMP1也称为CL-40、肿瘤相关膜蛋白。EMP1蛋白由157个氨基酸,是一种糖蛋白包含四个高度保守的疏水跨膜域局部膜。所有这些信息表明EMP1可能作为一种新型纤维肝标记和将来可能是一个潜在的目标。

2。材料和方法

2.1。基因表达谱数据

从NCBI收集的所有基因表达微阵列矩阵(国家生物技术信息中心)地理(基因表达综合),这是一个数据库存储库高通量基因表达数据和杂交数组、芯片和微阵列10]。

2.2。差异表达基因(度)分析

从微阵列数据集GSE141821矩阵的表达式11],GSE55747, GSE80601 [12从地理下载是自动加载到R统计软件(版本3.8.0,https://www.r-project.org/)和度生成使用limma包(3.46.0版)(13]。被认为是基因差异表达,如果他们有一个绝对log2褶皱变化在罗斯福的< 0.05 > 1。所有其他的微阵列数据集包括GSE103580 [14],GSE139994 [15],GSE27640 [16],GSE28619 [17],GSE40041 [18],GSE49541 [19],GSE73499 [20.),GEO2R分析被用来获取EMP1表达式值和构造微分表达式(21]。能找到相关的所有数据信息在地理数据库中。数据集的信息如表所示1。

表1
包括数据集的特点。
2.3。功能富集分析

我们上传度成Metascape (https://metascape.org/),进行基因本体论(去),京都基因和基因组的百科全书(KEGG)富集分析,和最小的常见肿瘤数据元素(MCODE)富集分析22]。去和KEGG分析结果可视化的R ggplot2包(v 3.3.3)。同时,度被提交到字符串(检索搜索工具的相互作用基因/蛋白质)数据库(v11.0)使用媒体的信心(交互得分> 0.400)参数(23]。功能注释浓缩也表现在字符串和丰富通路可视化R使用ggplot2包(v 3.3.3)。

2.4。肝组织单细胞分析

因为许多细胞参与肝纤维化的过程中,常见的基因的表达在这些细胞检查,看看他们是否诱导纤维化通过控制这些细胞的功能(迁移)。在这项研究中,我们使用了蛋白质图谱(24)和PanglaoDB数据库(25为特定的表达模式)进行调查EMP1。蛋白质图谱是一个互动的开放数据库(http://www.proteinatlas.org/)允许全基因组的探索个体蛋白质对临床结果的影响。PanglaoDB (https://panglaodb.se/)是科学界的一个数据库感兴趣调查单细胞RNA-sequencing研究小鼠和人类。

2.5。GEPIA数据库分析

GEPIA(基因表达分析交互式分析)(26)是一个网站,其中包含9736年癌症的测序RNA表达数据和8587年TCGA正常样本和GTEx (genotype-tissue表达式)项目(http://gepia.cancer-pku.cn)。皮尔森的相关性是用来验证与其他fibrotic-related EMP1基因的强正相关性,以及从GTEx正常肝组织的表达矩阵27]。

3所示。结果

3.1。CCl Fibrotic-Related基因表达模式4全身的小鼠肝脏样本

研究肝纤维化的机制,我们分析了三地之间的度在三个地理数据集4全身的纤维化和控制样品。在GSE141821 45调节和7度使之抑制被发现(| log2 (foldchange) | > 1,调整 ;图1(一)和1 (b))。另一方面,数字1 (c)和1 (d)证明在GSE55747纤维化小鼠肝脏样本,有1817调节和1778度使之抑制| log2 (foldchange) | > 1和调整 。GSE80601,分析后,发现1778表达下调和1817调节度在CCl4-induced纤维化肝组织(| log2 (foldchange) | > 1,调整 ;数据1 (e)和1 (f))。我们确定了62调节基因和表达下调的基因通过交叉度从三个数据集(数字1 (g)和1 (h))。这些基因编码的ECM蛋白质,包括Col3a1,Col4a1,Col1a1。同时,基因编码ECM降解酶等Timp2,Mmp2,Adamts5要调节。急性期蛋白的表达Saa3血清淀粉样蛋白(A3)显著提高对急性和慢性炎症刺激的反应。这一发现强调了ECM CCl后改变了这一事实4治疗。同时,Cd14,Cd53,Cd68标记为单核细胞和巨噬细胞,是大大增加了。这意味着增加巨噬细胞内容和增加免疫损伤后过滤水平。细胞色素P450基因家族成员,等Cyp7b1和Cyp2d40是表达下调的基因。此外,在受伤后,Hsd3b5(hydroxy-delta-5-steroid脱氢酶、3β-和类固醇delta-isomerase 5)下降了监管。正常肝细胞的功能是由肝损伤的影响。调节和表达下调度使用维恩图(显示数据1 (g)和1 (h)分别)。

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图1
在三地的识别度4治疗小鼠肝脏样本。度是通过比较获得的治疗和CCl4-induced纤维化小鼠肝组织从三个地理数据集:GSE14182 GSE55747, GSE80601。(一)——(c))火山分布的情节CCl未经处理的控制和之间的度4治疗肝脏样本GSE14182、GSE55747 GSE80601,分别的阈值|日志2(foldchange) | > 1和调整 (砖红色,调节度;草绿色:表达下调度;灰色:不变)。(d) - (f)的热图阴谋在CCl样品(度4治疗和控制)从GSE14182 GSE55747, GSE80601,分别。颜色上面的热图显示样本组。热图的每一行代表一个差异表达基因的规范化表达值在所有样本(草绿色,低表达;砖红色,高表达)。(g)和(h)度从三种不同的微阵列数据集的维恩图。创新领导力4四氯化碳;度,差异表达基因;地理,基因表达的综合。

浓缩的分析是由Metascape(图2(一个))。通路参与包括ECM组织(去:0030198),积极调控的细胞迁移(去:0030335),胶原蛋白降解(r - mmu - 1442490),和积极的监管回应外界刺激(去:0032103)。图2 (b)描述了MCODE分析蛋白质相互作用(PPI)由Metascape模型。ECM集群核心PPI的一部分蛋白质交互网络(Col1a1,Col3a1,Col4a1,Col6a1,亮度,Sparc;图2 (b))。此外,我们使用了字符串功能注释浓缩,浓缩通路是显示在顶部R使用ggplot2工具(v 3.3.3)。:BP浓缩表明通路,如应激反应和细胞因子改变(图2 (c)),同时KEGG浓缩表明肌动蛋白细胞骨架的改变监管和白细胞transendothelial激活(图2 (d))。这些浓缩途径发现大多是与肝脏的纤维化进程一致。

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图2
功能性浓缩度的分析。(a)条形图聚集浓缩本体类别(包括去和KEGG计算)由Metascape(彩色 - - - - - -值;最小重叠:3; ;最低浓缩:1.5)。(b) MCODE浓缩Metascape PPI网络的分析。功能富集分析:BP (c)和KEGG使用PPI (d)所产生的字符串。度被导入到数据库生成一个字符串PPI网络0.4分数最低必要的交互。去,基因本体;KEGG京都基因和基因组的百科全书;MCODE、分子复杂的检测;PPI:蛋白质相互作用。
3.2。EMP1 CCl标记基因4治疗肝脏样本

我们注意到同4治疗快速增加引起的Emp1表达式在小鼠肝组织从不同的数据集(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。CCl GSE80601表达谱的肝组织处理4( (6)和控制肝组织 )处理石油对Balb / c小鼠显示6周Emp1CCl后表达明显增加4治疗(日志2FC = 2.461, ;图3(一个))。在GSE27640 CCl 18周后4治疗的小鼠模型,Emp1基因显著调节(日志2FC = 1.673, )相比正常肝组织的控制。埃罗替尼,EGF受体抑制剂能降低肝纤维化和肝细胞癌的发展,抑制表达的增加Emp1在GSE27640(图3 (b))。与此同时,在GSE73499后3、6、9周三地4政府的表现Emp1基因也显著调节大鼠肝硬化模型(日志2FC = 1.117, )(图3 (c))。鼠肝脏处理样品相比,控制车辆,Emp1老鼠的肝组织的表达CCl处理4显著调节(日志2FC = 1.416, )在GSE139994。总的来说,这些发现表明,肝脏组织CCl回应4全身急性和慢性损伤引发快速增加Emp1在小鼠模型。

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图3
EMP1是肝纤维化的标志基因在动物和人类样本。Emp1CCl upregulation在4治疗小鼠肝脏样本与正常组织相比GSE80601 (a), GSE27640 (b), GSE73499 (c)和GSE139994 (d)。Emp1老鼠表达海拔BDL模型与虚假的组(e)。积极的协会EMP1表达与酒精性肝炎(GSE28619) (f)和酒精性肝硬变(GSE103580)样品(g)的表达增加EMP1肝脏样本与纤维化晚期(3 - 4阶段)与温和(0 - 1)阶段(h)。在老鼠模型中,Emp1表达式是最大的副功拜纳什组相比,非酒精性脂肪肝+ 2型糖尿病和健康对照组。BDL,胆管结扎(我);创新领导力4四氯化碳;EMP1,上皮膜蛋白1;过多的祷告,非酒精性脂肪肝;非酒精性脂肪肝,非酒精性脂肪肝;纳什,非酒精性肝病;2型糖尿病,2型糖尿病;* 和* * * 。
3.3。EMP1是肝纤维化的标志基因样本

除了同4治疗模式,也得出了类似的结论在其他肝纤维化模型,包括人类临床纤维化肝脏样本条件造成的非酒精性脂肪肝(非酒精性脂肪肝疾病[副功拜])。例如,当与对照组相比,Emp1迅速激活在急性或慢性损伤小鼠模型GSE40041虚假或BDL 48小时或28天,分别(日志吗2FC = 1.152, ;图3 (e))。根据GSE28619数据集,肝基因表达微阵列分析是检查的患者酗酒( )和正常肝脏( ),和EMP1在酒精性肝炎组织相当高(GSE28619;日志2FC = 2.73, ;图3 (f))。EMP1也更多的酒精中高度表达的脂肪变性比中度急性酒精性肝炎和肝硬化,根据数据集(GSE103580;(日志2FC = 0.325, ;图3 (g))。此外,EMP1更大更高的非酒精性脂肪肝肝脏活检组织中表达样本从先进(纤维化阶段3 - 4),而温和的样本(纤维化阶段0 - 1)在GSE49541(日志吗2FC = 1.152, ;图3 (h))。此外,在不同的阶段,从GSE65220鼠肝脏纤维化,Emp1表达最高纳什与其他阶段相比,比如健康,过多的祷告和非酒精性脂肪肝与2型糖尿病(2型糖尿病;日志2FC = 2.157, ;图3(我))。所有这些证据表明EMP1表达增加与纤维化的肝脏恶性肿瘤的严重程度和可能发挥作用在调节肝脏损伤反应。

3.4。主要的表达EMP1肝星状细胞在肝单细胞转录组

使用人类的蛋白质图谱(https://www.proteinatlas.org/),我们研究了不同细胞类型的表达谱在肝组织中,以确定哪些细胞类型表达EMP1最多。我们发现EMP1是专门用EC表达(紫色技术集群)以及Ito (perisinusoidal消耗细胞,也称为星状细胞)的肝间质细胞(草绿色c - 4集群)单细胞转录组聚类结果正常肝组织。数据显示在一个UMAP(统一歧管近似和投影图;图4(一))。根据聚类结果,EMP1表达式是低枯氏细胞(砖红色,供给其他集群)和其他细胞类型包括免疫细胞和肝细胞(c - 2;图4(一))。伊藤细胞平均表达价值TPM(每千碱基成绩单)为161.3,而EC平均TPM的181.9,EMP1表达式是低所有其他细胞类型(图4 (b))。EMP1热图描绘了最高水平的基因表达以及其他来自各种细胞类型的基因标志,如CD34对于电子商务,CD3ET细胞,CD163巨噬细胞。EMP1和FSCN1(Fascin actin-bundling蛋白1)最相似的表达模式根据数据集(图4 (c))。

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图4
EMP1是表达激活纤维肝星状。蛋白质的细胞类型阿特拉斯阿特拉斯(https://www.proteinatlas.org/)的表达进行验证EMP1在肝脏组织。(一)功能块EMP1覆盖的UMAP投影肝脏样本。(b)条图显示了TPM的表达EMP1在不同的细胞类型集群包括肝细胞、Ito细胞,T细胞,库弗尔细胞,B细胞等等。(c)的热图的规范化EMP1表达式以及其他标记基因在肝脏组织在不同的细胞类型。显著正相关EMP1表达式与纤维化肝星状细胞(GSE120281) (d)和CCl要么激活成纤维细胞4西方饮食治疗或纳什模型(GSE134512)样品(e)三地4四氯化碳;EMP1,上皮膜蛋白1;纳什,非酒精性肝病;TPM,记录每百万;UMAP,统一的歧管近似和投影。 和* * * 。
3.5。EMP1激活肝星状细胞中表达升高,肝纤维母细胞

因为我们知道肝星状细胞的活化增殖,纤维发生的myofibroblasts一直被认为是肝纤维化的主要原因在实验和人类的肝损伤。GSE120281,信使RNA的静止(Q)或肝星状细胞和肝脏的纤维化(F)正弦EC (SEC)生成的RNA在CCl控制或测序4治疗的老鼠,是调查。在纤维化肝星状细胞,与静止肝星状细胞相比,Emp1表达在CCl响应显著增加4治疗(日志2FC = 4.895, ;图4 (d))。GSE134512数据集,激活成纤维细胞的转录组分析纳什肝脏和发现Emp1CCl显著升高的4全身和NASH-induced成纤维细胞相比,激活肝星状细胞(日志2FC = 2.116, ;图4 (e))。

3.6。EMP1表达式与ECM蛋白质

GEPIA被用来确认的显著正相关EMP1表达式COL1A2(α2型胶原链),TGFB1(转化生长因子β1),MMP19(矩阵metallopeptidase 19)VIM(波形蛋白)在正常肝脏样本( , ;图5(一个)- - - - - -5 (d))。然后,我们使用PanglaoDB数据库双重检查我们的发现。EMP1证明是成纤维细胞中高度表达,EC,其次是角质细胞,但不是在肝星状细胞(图5 (e))。这些结果表明,EMP1可以帮助激活和分化转化后的纤维化进展的肝星状细胞在肝纤维化的发展,因此提高肝纤维化。

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图5
与fibrotic-related EMP1表达呈正相关基因在肝脏。显著正相关性EMP1表达式与fibrotic-related基因包括TGFB1(一),COL1A2(b),MMP9(c)VIM(d),根据表达谱在GEPIA2 GTEx正常肝RNA-sequencing矩阵。(e) Barplot细胞集群(y设在)和细胞类型(x设在)基因的表达。表情丰富的EMP1从363年开始在不同的细胞类型根据PanglaoDB scRNA-seq样本和1487细胞集群。COL1A2、胶原类型我α2链;EMP1,上皮膜蛋白1;GEPIA2、基因表达分析交互式分析;GTEx Genotype-Tissue表达式;MMP9,矩阵metallopeptidase 9;scRNA-seq单细胞RNA序列;TGFB1,转化生长因子β1;VIM,波形蛋白。

4所示。讨论

肝纤维化的根本原因是肝星状细胞的激活,然后从静止的变换,vitamin-A-storing细胞增殖、纤维化myofibroblasts [28]。肝星状细胞的失活Tcf21(转录因子21),证明抑制小鼠肝纤维化进展(29日]。然而,肝星状细胞激活是一个相当复杂的过程,尚未完全了解。

在这项工作中,我们首先证明了EMP1 CCl后最高架基因之一4全身的肝损伤小鼠模型。然后,我们发现EMP1水平也升高在各种肝损伤后样品,如BDL模型和酒精性肝炎。EMP1表达在成纤维细胞和EC,单细胞转录组研究表明肝组织。此外,我们观察到EMP1表达式是更大的在激活纤维发生的成纤维细胞,并与典型的纤维化的基因。是员工,其中包括EMP1,EMP2,EMP3编码的增长arrest-specific 3 (GAS3) /外围髓磷脂蛋白22 kDa (PMP22)基因家族9]。员工家庭有四个假定的跨膜域约有160氨基酸残基(30.]。虽然在这个家族的基因通常牵涉到肿瘤细胞迁移,增殖,分化,很少有研究证明其在肝纤维化中的作用。他之前等人发现upregulation异常PMP22TGF -βCCl激活肝星状细胞和4全身的肝纤维化小鼠模型,以及pro-fibrotic作用PMP22通过加重TGF -β全身的HSC激活(31日]。这将是有趣的调查和比较完整的基因家族的作用在肝脏纤维化的过程。

广泛的研究已经进行到EMP1在发病机制中的作用和肿瘤发生各种癌症。在乳腺癌中,例如,EMP1功能作为一个标记为小叶和导管浸润性乳腺癌分化,以及假定的与乳腺癌入侵推广(32]。的表达与组织学分级,增加EMP1, EMP2, EMP3增加上皮成分和减少在叶状柄肿瘤的间质成分33]。在前列腺癌,EMP1高度表达的患者更高的格里森评分,并增加EMP1水平显著增加癌细胞迁移,导致肿瘤转移,这意味着EMP1可能发挥重要作用作为肿瘤转移的积极的监管机构(8]。在卵巢癌中,EMP1发挥关键作用被发现是一种消极监管机构在卵巢浆液性肿瘤,和减少EMP1表达式在浆液性肿瘤与疾病严重度增加有关34]。EMP1也耐吉非替尼的生物标志物,并与缺乏完全或部分对吉非替尼在肺癌患者样本,以及临床进展中等耐吉非替尼(35]。在急性淋巴细胞白血病,EMP1是一种新型的贫穷儿童白血病的预后因素调节强的松阻力,细胞增殖、迁移、粘附[36]。在神经胶质瘤,EMP1调节细胞增殖、迁移,并通过PI3K-AKT具备干细胞信号和CD44 (37]。鉴于大多数研究认为EMP1可以提高肿瘤生长,入侵和迁移,我们假设EMP1也可以促进活化HSC增殖和迁移后受伤。星状细胞激活的特点是扩散和迁移38),以减少核扩散可能修改肝纤维化,根据许多发表的结果(39- - - - - -42]。然而,今后还需要进一步的验证测试来验证假设。

在我们丰富的分析,所涉及的途径包括ECM组织,积极调控的细胞迁移,胶原蛋白降解,和积极的应对外界刺激的监管。浓缩的分析表明,应激反应和细胞因子等途径改变,同时KEGG浓缩表明肌动蛋白细胞骨架的改变监管和白细胞transendothelial激活。这些浓缩途径发现大多是与肝脏的纤维化进程一致。

本研究有一些局限性。首先,包括数据集是基于小鼠;我们缺乏人类样本验证。第二,我们没有执行的分析,研究EMP1的表达在不同的子组不同临床因素如性别和年龄。第三,缺乏实验验证,分析使用数据集从公共数据库但不是在较大的数据集进行验证。

综上所述,这些科学数据暗示EMP1可能损伤后的肝纤维化过程中用作标志基因在肝星状细胞和可能有潜在的作用,然而在未来需要额外的验证实验。

数据可用性

仿真实验数据支持本文的研究可从通讯作者或第一作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。